第六讲神经递质的释放.pdf

文章编号?1008?0872(2001)02?0166?05?中图分类号?R338?7?文献标识码?A?收稿日期?2001?02?08 通讯作者?孙刚?联系电话?021?25070260 作者简介?孙刚(1961?),男,青岛市人,主任教授,博士,主要从事胎盘激素与胎儿发育的研究?分子神经科学系列讲座?第六讲?神经递质的释放孙刚,何平,万顺伦(第二军医大学生理学教研室,上海 200433)?神经递质是以囊泡的形式储存于神经末梢的,根据囊泡的形态和大小可以将其分为以下几种类型:具有均匀透明中心的小囊泡(SSV,直径 100 mol/L 时,囊泡就可以与突触前膜快速融合并形成融合孔、释放神经递质。2?3?与神经递质释放有关的突触蛋白?很多突触蛋白参与了囊泡递质的释放过程。根据突触蛋白的存在部位,可以将与神经递质释放有关的突触蛋白分为以下几种:囊泡蛋白:突触 素(synapsin),synaptobrevin(VAMP),synaptophysin(p38),synaptotagmin(p65),rabphilin 及动力素(dynamin)等;!突触前膜蛋白:syntaxin(HPC1),Munc?18(n?sec1),SNAP?25,physophilin 和 neurexin 等;细胞浆蛋白:NSF,SNAP,Rab3A等。下面介绍几种主要突触蛋白在递质释放过程中的作用。2?3?1?突触素参与囊泡集聚过程?突触素是一种存在于囊泡壁的蛋白质,突触素蛋白约占囊泡蛋白的 9%。突触素的基因有两种,两种基因的表达产物经不同剪切可以产生&a,&b,%a 及%b 四种同源性突触素。在神经末梢,突触素是以二聚体&a?b 和%a?b 的形式存在,两种二聚体的 N 末端结构相同,存在钙调蛋白依赖性蛋白激酶&(CaMK I)和 cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)的磷酸化位点。突触素&的 C 末端还存在钙调蛋白依赖性蛋白激酶%(CaMK%)的磷酸化位点。在静息状态下,突触囊泡通过突触素 I 结合于细胞骨架蛋白上。突触素通过囊泡壁上的磷脂和 CaMK%与囊泡相连;通过N 末端的两个连接位点与细胞骨架蛋白相连(Fig2)。兴奋时,随着细胞内钙离子水平的升高,钙离子激活CaMK%,后者磷酸化突触素&的 C 末端,使其与囊泡的结合减弱,囊泡由细胞骨架蛋白上被释放出来,并向活动区集聚。Fig 2?Attachment of vesicle to the cytoskeleton through synapsin神经末梢兴奋时,活动区的钙离子水平远远超过激活CaMK%所需的钙离子水平,提示神经递质释放过程中还存在其他依赖钙离子的环节。2?3?2?SNARE 参与囊泡的锚定?由细胞骨架释放出来的囊泡向活动区不断集聚,并#锚定在突触前膜上,经预激后才能与突触前膜融合,释放神经递质。SNARE 蛋白与囊泡的#锚定有关。SNARE是一组由囊泡蛋白 synaptobrevin和突触前膜蛋白 syntaxin,SNAP?25 组成的蛋白质复合体。锚定前,synaptobrevin 与囊泡上的另外一种蛋白 synaptophysin 结合,而syntaxin 与突触前膜上的另外一种蛋白 munc?18 结合。munc?18 阻止了 syntaxin 与另外一种突触前膜蛋白 SNAP?25 的结合。锚定时,一方面,munc?18 与 syntaxin 解离,使 syntaxin 得以与 SNAP?25 结合;另一方面,synaptophysin 与 synaptobrevin解离,使囊泡上的 synaptobrevin 蛋白能够与突触前膜上的syntaxin?SNAP?25 复合物结合,形成 20s 复合 物 SNARE(Fig3),完成囊泡在突触前膜上的锚定过程。因此,突触前膜munc?18蛋白的主要作用为阻止 SNARE 复合物的形成,从而阻止囊泡在突触前膜的锚定。梭状芽胞杆菌的神经毒素,如破伤风毒素,可以将 SNARE 分解,因此可以阻断囊泡的神经递质释放。Fig3?The formation of SNARE and its role in the docking of vesicle tothe presynaptic membrane2?3?3?SNAP 参与囊泡的预激过程?囊泡与突触前膜锚定后,还需要消耗ATP 进行激活。几种细胞浆蛋白参与了囊泡的预激过程,其中包括N?乙基马来酰亚胺敏感因子(NSF)和可溶性 NSF 结合 蛋白(SNAP)。NSF 为相对 分子质 量 Mr76000(76 kD)的 ATP 酶,而 SNAP 存在,?,#三种亚型。当囊泡与突触前膜锚定后,NSF 通过 SNAP 与SNARE 蛋白复合体连接,NSF 水解 ATP,并使 SNARE蛋白复合物发生构象改变,完成预激过程。此时的囊泡膜就可以进一步与突触前膜发生融合,并 形成融合孔,释放神经递质。因此,NSF 通 过SNAP 与 SNARE 的结合对于囊泡的预激及神经递质的释放都非常重要。2?3?4?突 触 囊 泡 与 前 膜 的 融 合 孔 由 synaptophysin 和physophilin 形成?囊泡预激后,就可以与突触前膜融合,并形成逐渐扩大的融合孔,以释放囊泡内容物。现在认为融合孔的形成是囊泡膜上的 synaptophysin 蛋白和突触前膜 上的physophilin 蛋白相互作用的结果。此融合孔的结构类似于细胞间的缝隙连接(gap junction),由六聚体的synaptophysin 和具有 H+?ATP 酶活性的 physophilin 组成。synaptophysin 是一种具有四次跨膜结构的囊泡膜蛋白,当重组于脂质双分子层中时,synaptophysin 具有电压敏感性离子通道的性质。2?3?5?synaptotagmin 是囊泡胞吐步骤中最后的钙离子感受蛋白?Synaptotagmin 是一种只跨膜一次的囊泡膜蛋白,其 N末端位于囊泡内,C 末端位于胞浆中。Synaptotagmin 具有多个磷脂依赖性的钙离子结合位点,与钙离子的亲和常数约为10 100mol/L,synaptotagmin 的 C 末端存在两段重复序列,类似蛋白激酶 C(PKC)的钙离子结合域(C2)。Synaptotagmin与钙离子的结合特点提示它很可能是突触囊泡神经递质释168中国神经科学杂志 2001 年 5月?第 17 卷?第 2 期?ChinJ Neurosci,May 2001,17(2)放过程中的重要钙离子感受蛋白(calcium sensor)。敲除 synaptotagmin 基因的突变型纯合子(?/?)小鼠出生时呼吸和对触觉刺激的反应均正常,但小鼠体力逐渐耗竭,一般在生后 48 h 内死亡。突变型小鼠的大脑神经元在形态学方面并未见异常,但运用全细胞膜片钳技术研究神经元间突触诱发反应时发现,突变型动物神经元对刺激的应答反应显著降低,进一步的研究发现,这是突触前膜神经递质释放减少的缘故。将 synaptotagmin 的 C2 结构域注入枪乌贼巨轴突以阻断内源性 synaptotagmin的作用,结果使神经递质的释放完全被抑制,大量囊泡集聚在活动区,说明抑制环节发生在囊泡集聚之后。大量的研究表明,Synaptotagmin 在神经递质的释放中起 着 钙离 子 依 赖 性的#制 动 作 用。当 无 钙 离子 与synaptotagmin结合时,它抑制突触囊泡与突触前膜的完全融合;当 synaptotagmin 与钙离子结合后,此抑制作用被解除,导致囊泡与突触前膜的完全融合及神经递质的释放。中枢神经递质的释放呈现两个动力学时相:一个是与刺激基本同步的快速释放相,占递质释放总量的 80%;另一个是出现于快速相之后的慢时相。Synaptotagmin 基因突变型动物中枢神经递质释放的慢时相并无改变,但快速释放相不再出现,提示 synaptotagmin 是介导神经递质快速释放相的重要蛋白质。Synaptotagmin是一种低亲和力的钙离子感受蛋白,当突触前膜兴奋时,钙离子通道开放,大量的钙离子内流引起细胞内钙离子水平急剧升高,可以激活对钙离子亲和力较低的 synaptotagmin,引起突触囊泡递质的快速释放。当细胞内钙离子水平高峰过后,较低浓度的钙离子仍然能够与高亲和力的钙离子感受蛋白结合,引起递质的缓慢释放,因此神经递质的慢释放相与 synaptotagmin 无关。虽然并非所有 Lambert?Eaton 肌无力综合征患者血清中都有 synaptotagmin抗体,但部分患者既存在抗钙离子通道蛋白的抗体,又存在抗 synaptotagmin的抗体。2?3?6?Neurexin 是神经毒素的作用位点?Neurexin 是一类存在于突触 前膜的 神经 特异性 蛋白质。Neurexin 家族 中,neurexin 1 与黑寡妇蜘蛛毒素?latrotoxin 具有很高的亲和力,两者的结合依赖于钙离子。?latrotoxin 与 neurexin 结合后,促进 neurexin 与囊泡膜蛋白 synaptotagmin 的结合,并调节synaptotagmin的磷酸化水平,引起大量囊泡释放神经递质,从而导致神经递质的耗竭及神经传导的不可逆阻滞。虽然?latrotoxin与 neurexins 1 的结合是 钙离子 依赖性的,但?latrotoxin还可以不依赖于钙离子导致神经递质的释放,提示neurexin可能并非黑寡妇蜘蛛毒素的唯一作用位点。3?神经递质作用的终止神经递质释放后,还需要及时终止作用和在末梢内形成新的囊泡,为下一次兴奋做好准备。神经递质被释放到突触间隙发挥作用后,主要通过弥散和重摄取方式终止作用,但乙酰胆碱主要是由乙酰胆碱酯酶水解终止作用的。神经递质向周围的简单扩散方式是释放即刻降低突触间隙递质浓度的限速步骤,除了简单扩散外,释放到突触间隙的神经递质还可以被神经末梢和神经胶质细胞膜上的递质转运蛋白重新摄取并转运出突触间隙。神经胶质细胞对递质的重摄取作用对于防止神经递质扩散到邻近神经末梢非常重要,这样可以避免产生非特异性作用。如果突触前膜释放递质过多,重摄取机制将发生饱和,会产生递质#溢出现象,#溢出的递质激活邻近突触的受体产生非特异性的作用,特别是高亲和力的突触前膜受体。经计算,中枢神经单个囊泡释放的神经递质足以饱和突触后膜的受体,而多囊泡释放神经递质产生的中枢效应一般是递质作用于突触后膜和周围突触的综合效应。神经递质的重摄取主要是由钠离子依赖性的转运蛋白介导的。钠离子依赖性转运蛋白可以分为两个家族:Na+?K+依赖性的谷氨酸转运蛋白家族:此家族转运蛋白具有 8次跨膜的结构,其 C 和 N 末端都位于细胞内,在第 3 和第 4跨膜片段之间形成一个位于细胞外的环,此环为神经递质和一些药物、毒物的结合位点。!Na+?Cl-依赖性的转运蛋白家族:此家族转运蛋白具有 12次跨膜的结构,其 C 和 N 末端也位于细胞内,在第 3和第 4 跨膜片段之间也形成一个位于细胞外的环,可以转运多种递质,如 GABA、甘氨酸及乙酰胆碱降解产物胆碱等。神经毒素 1?甲基?4?苯?1,2,5,6?四氢吡啶(MPTP)是广泛用来制造帕金森病模型的工具药,MPP+是 MPTP 发挥毒性作用的分子形式,MPTP 需首先氧化成 MPDP+,然后在星形胶质细胞中重构为 MPP+,发挥作用。MPP+被 DA 转运蛋白摄入神经元后,进而破坏线粒体。神经元对 MPP+的敏感性取决于两个因素:一是神经元末梢囊泡是否可以将 MPP+转运进入囊泡内,使其与线粒体隔离,削弱它的作用;二是神经元内是否存在浓缩 MPP+的神经黑色素(neuromelanin)。黑质神经元中存在大量神经黑色素,因此对MPP+尤为敏感。值得指出的是,多巴胺转运蛋白同时也是可卡因受体,可卡因可以阻断 DA 的重摄取(Ki=1 mol/L)。三环类抗抑郁药可与 5?HT 和 NA 的转运蛋白结合,氟西酊是 5?HT 重摄取的选择性阻滞剂。4?突触囊泡的再循环用囊泡膜蛋白 synaptotagmin 的抗体进行免疫化学染色,可以显示整个囊泡膜在递质释放过程中均融合到突触前膜上。由于神经末梢不存在蛋白质的合成机制,所以囊泡的快速再生必须依赖于突触前膜上囊泡蛋白的再循环。如果没有突触囊泡的再循环,在刺激频率为 10 times/s 的情况下,大约在 100 s 内将耗竭神经肌肉接头处的囊泡。正常情况下,除了融合到突触前膜上的囊泡可以通过胞吞的方式再生外,释放入突触间隙的神经递质也可以被突触前膜的转运蛋白重摄取,用于囊泡的重新充盈,因此即使刺激频率较高时,也不会发生囊泡和神经递质耗竭的情况。Synaptotagmin 基因缺陷型动物的囊泡回收出现障碍,突触囊泡数目剧减,提示 synaptotagmin 除了参与囊泡与突触前169第六讲?神经递质的释放?孙刚,何平,万顺伦膜的融合外,还参与囊泡的再生过程。除了 synaptotagmin外,囊泡膜蛋白动力素和细胞浆 Rab3A 也参与了突触前对囊泡的胞吞过程。4?1?动力素(dynamin)?动力素基因突变后,神经末梢的囊泡再循环过程被阻断,提示动力素在囊泡胞吞过程中起着关键作用。动力素是一种可以与GTP 结合的神经元特异性蛋白,具有GTP 酶的活性,可以被 PKC、酪蛋白激酶%磷酸化。酪蛋白激酶%磷酸化动力素后,不影响动力素的 GTP 酶活性,却可阻止 PKC 对动力素的磷酸化。神经元兴奋时,突触前膜发生大量的钙离子内流,钙离子一方面导致囊泡释放递质,另一方面激活磷酸酶 calcineurin,后者催化动力素发生去磷酸化。去磷酸化后的动力素的GTP 酶活性减弱,使动力素形成与GTP 结合的复合物。融合到突触前膜的囊泡表面衣被着神经元特异性的网格蛋白(clathrin),GTP?动力素复合物可以与囊泡壁上的网格蛋白相互作用,促进囊泡膜的胞吞过程。突触膜被胞吞后,网格蛋白从囊泡壁上脱落,动力素结合的GTP 也发生水解,形成 GDP?动力素复合物,并与囊泡分离。4?2?Rab3A?Rab3A 是一种小 G 蛋白,具有 GTP 酶的活性。细胞浆内的Rab3A 主要以 GDP?Rab3A 的状态存在,GDP 解离抑制因子(GDI)起着稳定 GDP?Rab3A 复合物的作用。当 GTP与 Rab3A 结合时,GTP?Rab3A 可以与囊泡壁结合,并使囊泡与突触前膜呈结合状态。当 GTP 被 Rab3A 本身的 GTP 酶水解为GDP 后,Rab3A 与囊泡解离,并进入细胞浆,囊泡得以胞吞和再循环(Fig 4)。Fig 4?Role of Rab3A in the endocytosis of vesicles from presynapticmembrane?敲除 Rab3A 基因小鼠的神经元,单刺激引起的神经递质释放正常,但重复 刺激导致的 神经递质 释放减少,提 示Rab3A 蛋白在突触囊泡再循环中起重要作用。5?突触囊泡的重新充盈突触前膜不存在神经肽的重摄取机制,突触前膜的神经肽被释放后一般被酶水解。因此,含有神经肽的囊泡主要依靠胞体新合成的神经肽进行补充和重新充盈。经典递质被释放后,大部分被重摄取进入神经末梢,因此经典递质囊泡的重新充盈主要依靠神经末梢处重摄取的神经递质。囊泡对经典递质的重摄取是由囊泡壁上的转运蛋白完成的,含经典神经递质的囊泡壁存在 H+?ATP 酶,在其作用下,囊泡内的质子浓度很高,经典递质进入囊泡的动力来源于囊泡内氢离子的同时反向转运(antiport)。乙酰胆碱可以在神经末梢内合成,然后被囊泡壁上的乙酰胆碱转运蛋白摄取。乙酰胆碱的转运蛋白(VAChT)是由unc?17基因编码的。由 unc?17 基因表达的 VAChT 转运蛋白与已知的单胺类转运蛋白(VMAT)有 40%的结构同源性,都具有 12 次跨膜的结构,它们形成一个独特的转运蛋白家族。unc?17除了编码VAChT 外,还编码胆碱乙酰转移酶,但它们的转录起始位点不一样。参考文献 1Revest P,Longstaff A.Molecular Neuroscience M .NY:BioScientific Publishes,1998,127?149.2ZuckerRS,KullmannDM,BennettM.ReleaseofNeurotransmitter.In:Fundamental NeuroscienceM.eds ZigmondMJ,Bloom FE,Landis SC,et al.Academic Press,1999,155?192.3顾勤?神经末梢?见陈宜张,分子神经生物学M?北京:人民军医出版社,1995,149?170?170中国神经科学杂志 2001 年 5月?第 17 卷?第 2 期?ChinJ Neurosci,May 2001,17(2)