农杆菌介导遗传转化原理.pdf

农杆菌介导的 植物遗传转化农杆菌的分类按侵染植物的后果分为：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）形成冠瘿（crown gall）发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）形成发根（hairy root）革兰氏阴性菌、杆状；按合成/代谢冠瘿碱（Opine）的种类，根癌农杆菌分为：章鱼碱（Octopine）型 胭脂碱（Nopaline）型 农杆碱（Agropine）型冠瘿碱：农杆菌的碳源及氮源，其他物种不能代谢利用，使农杆菌拥有了独特的生态位。未侵染时栖息于土壤表层，侵染植物导致冠瘿病（根癌病）；侵染植物受伤部位（嫁接、修剪或其他外力伤害等）；冠瘿瘤一般位于主根与茎的结合部（树干基部，即冠、Crown），但侧根、茎、枝上也有发病。The Plant Cell,Vol.18,33503352冠瘿病的害处：苗木感病后发育受阻；生长缓慢；植株矮小；严重时叶片萎蔫、早衰，甚至死亡；大树受害后树势衰弱，生长不良，提前落叶，果实变小，树龄缩短。主干受害降低材质及工艺价值。根癌农杆菌含有Ti质粒 Ti：tumor-inducing 发根农杆菌含有Ri质粒 Ri：rhizogenic 天然农杆菌都含有Ti（或者Ri）质粒农杆菌能够导致植物产生冠瘿病的原因：Ti（Ri）质粒天然Ti质粒的结构 200800 Kb 含有冠瘿碱合成基因、生长素合成基因、细胞分裂素合成基因等；真核启动子；T-DNA区（Transferred DNA）：农杆菌Ti质粒中向植物中转移并整合进植物基因组中的部分；T-DNA区大小：1030 Kb 有的Ti质粒只含有一个T-DNA区，有的则含有多个；T-DNA区的左右边界序列高度保守，为25bp的正向重复序列；http:/ 附着（chvA、chvB）VirA/G的双组分系统感受受伤信号 （signal to A Pi to G）其他Vir基因的表达 T-DNA链的切出（VirD1+VirD2；Border to Border）T-complex的形成 运输（从细菌中输出、进入植物细胞、入核）整合植物受伤后的分泌物中含有酚类物质（包括乙酰丁香酮，acetosyringone，AS）；这些酚类物质可以被农杆菌感知，借助于趋化性迁移至植物受伤部位；在ChvA、ChvB（染色体毒性基因）等的帮助下，附着到受伤部位；农杆菌的附着农杆菌在ChvA、ChvB等蛋白帮助下附着在植物细胞表面A.tumefaciens形态http:/ 25bp边界序列，利用外切核酸酶的在第3、4碱基之间形成缺刻;VirD2的Tyr29与缺刻的5端共价结合；随着DNA的合成生成T-DNA单链，与VirD2和VirE2结合形成T-complex；http:/bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.htmlT-complex形成http:/www.defra.gov.uk/environment/acre/uti/03.htmT-complex:VirC1突变后导致毒性丧失，其作用可能是与T-DNA右边界附近的overdrive序列结合；Overdrive序列促进T-DNA向植物的转移；T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白和VirD4组成的通道从农杆菌向外输出VirD2：含有NLS，并可与Importin-以NLS依赖的方式结合，引导T-complex进入细胞核，并帮助T-DNA插入植物染色体中；（Importin-is a component of one of the protein nuclear transport pathways found in eukaryotes）T-complex在植物细胞内的运输及整合VirE2：非特异DNA结合蛋白，包裹T-DNA单链，使DNA由随机卷曲状态成为与电话听筒线相似的规则螺旋；这种形状使T-complex容易穿过核孔；VirE2将T-DNA包裹，可避免T-DNA从细菌向植物转移过程中被降解；VirE2可在植物细胞膜上形成通道，使T-complex进入植物细胞；VirE2可与Importin-以不依赖NLS的方式结合，促进T-complex向核的定向转运；VirE2的NLS与其DNA结合位点重叠，在T-complex向核的转运中可能不起作用；VirE1：VirE2的分子伴侣，可能帮助VirE2与T-DNA单链进行结合；http:/bs.shinshu-u.ac.jp/botany/Crown_Gall.htmlT-complex进入植物细胞核的模型The Plant Cell(1996)8:1699-1710 农杆菌向植物中转移的DNA长度可达到30150Kb；在T-DNA的左右两边界中，右边界相对更重要，其缺失将导致转基因失败；有时候，T-DNA左右边界之外的载体序列也有可能被转到植物基因组中。原因是：1）T-DNA单链在形成过程中越过了左边界；2）T-DNA的转移从左边界起始；补充几点：农杆菌特异性的将T-DNA区转入植物的基因组中，其转移由T-DNA边界决定，与T-DNA区内的DNA序列无关。利用这种特性，我们就可以将外源基因插入到T-DNA区中，达到转基因的目的。农杆菌载体系统的演化解甲（disarmed）共整合载体（co-integrated plasmid）双元载体系统（binary vector system）农杆菌介导的植物转化 对自然从发现到认识到利用解甲：去除对转基因有不良影响的生长素、细胞分裂素合成等基因；Ti质粒只有被解甲之后才能运用到人工转基因实验中。农杆菌被解除武装，成了我们的俘虏，从而为人类服务。共整合载体Vir区及T-DNA区的反式作用?双元载体的发明 存在于工程菌株中的大质粒（Vir区）；方便体外操作的小质粒（含T-DNA区，大约十几个Kb）；Binary vector systemABC农杆菌载体系统的演化过程：从野生型质粒 到共整合载体 到双元载体系统植物农杆菌转化的发展农杆菌的天然寄主：双子叶植物；植物的农杆菌转化由双子叶植物开始 已被转化的双子叶植物：烟草、马铃薯、番茄、茄子、大豆、甜菜、拟南芥菜等；单子叶植物转化：20世纪90年代之后；已被农杆菌成功转化的单子叶植物：石蒜科、百合科、鸢尾科、薯蓣科和禾本科；禾本科植物的转化 水稻：Hiei等（1994）水稻能被成功转化是其成为禾本科模式植物的基础。玉米：Ishida等，1996 大麦：Tingay等，1997 小麦：Cheng等，1997；Xia等，1999禾本科植物转化的几个经典实验Hiei et al(1994)The Plant Journal 6(2):271-282The Plant Journal(1994)6(2):271-282Tingay et al(1997)The Plant Journal 11(6):1369-1376Cheng et al(1997)Plant Physiol.115:971-980从以上实验可总结转基因植株的鉴定方法有：抗生素抗性标记；GUS染色（组织化学染色）；Southern杂交；PCR检测；RT-PCR检测；Northern杂交；蛋白电泳；等等；PCR（A）、RT-PCR（B）和 Southern（C）鉴定结果ABC影响植物农杆菌转化效率的因素植物品种（基因型效应）；农杆菌菌株及载体；起始材料；侵染所用菌浓度（OD值）；共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分)；共培养之后的筛选方式；等等；