不同剂量脂多糖对大鼠急性肺损伤效应的观察.pdf

文章编号:100025404(2004)1020871203论著不同剂量脂多糖对大鼠急性肺损伤效应的观察李 琦,钱桂生,张 青,王长征(第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所,全军呼吸病研究重点实验室,重庆400037)提 要:目的 观察脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤(ALI)大鼠血浆IL24含量变化,探讨其在ALI发生发展过程中的意义。方法 120只Wistar大鼠根据注射LPS剂量随机分为2、4、6和8 mg/kg组,并设立生理盐水对照组(NS组),伤后1、2、4和6 h观察大鼠的一般情况、动脉血氧分压(PaO2)、肺组织湿质量/干质量比值、肺组织病理改变,并检测血浆IL24含量。结果 梯度剂量LPS可以引发程度不同的大鼠ALI;当LPS6 mg/kg时,发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。LPS可以诱导大鼠血浆IL24含量升高;当LPS6 mg/kg时,血浆IL24含量峰值显著提高。结论 尾静脉注射LPS可以复制出大鼠ALI模型。LPS6 mg/kg是大鼠发生ARDS的临界剂量。LPS诱导大鼠血浆IL24含量升高可能与ARDS发生有关。关键词:急性呼吸窘迫综合征;急性肺损伤;脂多糖;白细胞介素24 中图法分类号:R392.11;R563.02;R977.7文献标识码:AEffects of different doses of lipopolysaccharide on acute lung injury in ratsLIQi,QIAN Gui2sheng,ZHANGQing,WANGChang2zheng(Institute of Respiratory Diseases,Xingqiao Hospital,Third Military Medi2cal University,Chongqing 400037,China)Abstract:ObjectiveT o investigate the changes of plasma interleukin24(IL24)in rats with acute lung injury(ALI)induced by lipopolysaccharide(LPS)and to explore the relationship between IL24 and ALI.MethodsA to2tal of 120 Wistar rats were randomly divided into 2,4,6,and 8 mg/kg groups according to different doses of LPSadministration at each observing time point.A control group(NS),receiving saline injection,was also employed.The indexes of respiratory rate,PaO2,wet weight/dry weight(W/D)of lung lobes,and pathological changes wereobserved at 1,2,4,and 6 h after injury.The plasma IL24 content was detected by enzyme2linked immunosorbantassay.ResultsVarious degrees of ALI in rats were induced by different doses of LPS.Acute respiratory distresssyndrome(ARDS)was induced under the condition of LPS6 mg/kg.LPS could induce increased plasma IL24in rats.The peak value of plasma IL24 in rats increased significantly under the condition of LPS6 mg/kg.Con2clusionALI model can be duplicated by injection of LPS.LPS6 mg/kg is the critical dosage for ARDS inrats.The obvious increase of plasma IL24 may be associated with the occurrence of ALI/ARDS.Key words:acute respiratory distress syndrome;acute lung injury;lipopolysaccharide;interleukin24 严重的革兰阴性菌感染所产生的内毒素血症,容易引发急性肺损伤(acute lung injury,ALI)。急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)是ALI的 严 重 形 式。ALI/ARDS的 发 病 基 础 是 基金项目:国家自然科学基金资助重点项目(39730210);全军医学科研“十五”计划重点课题(01Z074)Supported by the National Natural Science Foundation of China(30070334,39730210)and the Key Research Project of Medicine and Health of the“Tenth Five2year Plan”of PLA(01Z074)作者简介:李 琦(1965-),男,福建省永春县人,博士,副主任医师,副教授,主要从事急性肺损伤发病机制及治疗的研究,发表论文16篇。电话:[phone] 通信作者:钱桂生,电话:[phone] 收稿日期:2004202224;修回日期:2004204202全身炎症反应综合征(systemic inflammatory responsesyndrome,SIRS)1。目前认为,SIRS的本质是过度的炎症反应,其中不仅有炎症介质过度释放,而且伴有内源性抗炎介质的释放异常2。白细胞介素24(inter2leukin24,IL24)是一种重要的抗炎性细胞因子。本研究通过观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的ALI大鼠血浆IL24含量的变化,探讨其在ALI发生、发展过程中的意义。1 材料与方法111 动物分组与处理Wistar大鼠120只(本校实验动物中心提供),雌雄不拘,体质量(20050)g。178第26卷第10期2004年5月第 三 军 医 大 学 学 报ACTAACADEMIAEMEDICINAEMILITARISTERTIAEVol.26,No.10May.2004 盐酸氯胺酮(80 mg/kg)腹腔麻醉。经大鼠尾静脉注射LPS(O111B4,Sigma)致伤。按LPS剂量(2、4、6、8 mg/kg)及时相点(1、2、4、6 h)分组,并设时相对应的生理盐水对照组(NS2C)。每组均6只。各时相点采集颈动脉血并制备血浆,然后处死大鼠取肺。112 观察指标 观察大鼠的呼吸等一般情况;测定动脉血氧分压(PaO2)和左肺组织的湿质量/干质量比值;肺大体观察,肺组织常规光镜观察并作病理形态学积分;透射电镜检查;ELISA检测血浆IL24含量。113 肺组织含水量测定 游离大鼠左肺,称量湿质量(wet weight,W),经-0.06 kPa70 脱水24 h后,再称量干质量(dry weight,D),以湿质量/干质量(W/D)比值表示肺组织含水量。114 病理形态学积分方法3 取右肺上叶组织,经固定、包埋、切片、HE染色后,光镜下观察。主要依据肺间质水肿、肺泡水肿、炎细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成、肺不张改变的等级,按程度的“无、轻、中、重”分别计“0、1、2、3分”,然后累计总分。115 血浆IL24的测定 采用固相三明治夹心、酶联免疫吸附试验(ELISA2K it,Dia2clone Research,FRENCE)检测血浆IL24含量,具体操作参照试剂盒说明进行。116 统计学处理 数据用均以?xs表示,用SPSS10.0作单因素方差分析和均数间多重比较。2 结果211 呼吸频率及死亡率的变化LPS致伤以后,大鼠呼吸频率增快或呼吸困难;随着LPS剂量增大,呼吸困难程度加重。当LPS6 mg/kg时,主要表现为呼吸窘迫,常伴有粉红色泡沫样肺水肿液由鼻腔溢出,死亡率明显升高。212 动脉血氧分压(PaO2)的变化LPS可以诱导大鼠PaO2显著降低;LPS 6 mg/kg使PaO2早期低于8 kPa;LPS 8 mg/kg则导致严重而持久的低氧血症(PaO2 8 kPa),见表1。表1LPS致伤的ALI大鼠PaO2的变化(kPa,?xs,n=6)Tab 1Changes of PaO2in rats with ALI/ARDS induced by LPS(kPa,?xs,n=6)Post2injury time(h)Group1246NS2C12.090.9412.170.9912.130.9212.180.96LPS 2 mg/kg12.071.8911.020.51312.101.6011.731.46LPS 4 mg/kg11.551.8610.131.90310.351.33311.681.57LPS 6 mg/kg7.931.439.181.848.771.948.502.19LPS 8 mg/kg7.721.397.901.147.771.117.330.53NS2C:Normal saline control;3:P 0.05,vsNS2C at the sametime point;:P 0.01,vsNS2C at the same time point213 肺组织湿质量/干质量比值的变化LPS可以诱导大鼠肺组织湿质量/干质量值升高,即使是小剂量LPS,也可以使其早期升高,湿质量/干质量值升高依赖于LPS剂量增加;LPS6 mg/kg时,湿质量/干质量值升高显著高于较低LPS剂量组,见表2。表2LPS致伤的ALI大鼠肺组织湿质量/干质量值的变化(?xs,n=6)Tab 2Changes of lung W/D in rats with ALI/ARDS induced byLPS(?xs,n=6)Post2injury time(h)Group1246NS2C4.260.094.280.124.260.104.290.13LPS 2 mg/kg4.530.414.690.1434.690.5134.270.73LPS 4 mg/kg4.670.2634.740.3835.060.4335.240.813LPS 6 mg/kg4.830.35#5.540.43#5.880.53#6.400.71#LPS 8 mg/kg5.620.55#5.840.50#6.120.68#6.450.80#NS2C:Normal saline control;3:P 0.05,vsNS2C at the sametime point;#:P 0.01,vsNS2C at the same time point;:P0.05,vsLPS 2 mg/kg and LPS 4 mg/kg at the same time point214 肺大体观察、肺组织常规光镜和透射电镜检查NS2C大鼠肺外观色泽粉红,无明显异常改变。LPS致伤后,肺体积增大,重量增加,脏层胸膜张力较高,色泽暗红,可见包膜下点、片状出血,切面疏松,有黄色或淡红色液体溢出。LPS剂量越大,大鼠肺水肿等病变越重;当LPS6 mg/kg时,易见出血等严重改变。光镜下,NS2C各时点肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺泡隔无水肿、炎症等特殊改变。LPS致伤时,主要病变为水肿、炎症、出血等病变。当LPS 2 mg/kg时,肺泡隔轻度增宽、少量炎细胞浸润、组织结构完整,病理学积分显著高于NS2C(P 0.01);当LPS 4 mg/kg时,可见渗出、间质增宽及肺泡内带状、片状水肿,间质炎细胞浸润,分类以单个核细胞浸润为主,小支气管内偶见少量渗出物,积分也显著高于NS2C(P0101);当LPS6 mg/kg时,水肿、炎细胞浸润以及出血等病变均加重,伴局灶性肺不张和肺气肿,可见微血栓及透明膜形成,积分非常显著高于NS2C(P 0.01),且2 h点及其以后时点的积分显著高于相同时相的2、4 mg/kg组(P 0105),见表3。表3LPS致伤的ALI大鼠肺组织病理形态学积分的变化(?xs,n=6)Tab 3Pathomorphological changes of the lung tissues in ratswith ALI/ARDS induced by LPS(?xs,n=6)Post2injury time(h)Group1246NS2C1.651.031.831.171.691.211.711.18LPS 2 mg/kg4.011.8534.332.0734.591.9235.212.033LPS 4 mg/kg6.261.8136.311.5736.822.0536.771.293LPS 6 mg/kg7.632.8839.692.033 10.221.933 9.852.163 LPS 8 mg/kg8.892.213 11.462.573 12.582.623 13.183.443 NS2C:Normal saline control;3:P 0.01,vsNS2C at the sametime point,:P 0.05,vsLPS 2 mg/kg and LPS 4mg/kg at thesame time point278 第 三 军 医 大 学 学 报 第26卷 超微结构改变主要表现为肺泡上皮细胞水肿、核周间隙扩大、内质网扩张及退行性变;型肺泡上皮细胞轻度肿胀,呈退行性变;型上皮微绒毛脱落减少或变短,板层体排空,可见胞体脱落或胞质崩解;血管内皮细胞肿胀,吞饮小泡增多,染色质边集;肺泡隔间质明显增宽,电子密度减低。肺泡腔还可见红细胞、多形核白细胞、坏死细胞碎片和血浆样物质。大剂量LPS致伤的超微病理改变明显加重。215 血浆IL24含量的变化LPS致伤组的血浆IL24含量非常显著或显著升高(P0101,P 0105,与NS2C相比)。LPS致伤剂量越大,相同时相组血浆IL24含量越高;2、4 mg/kg LPS致伤后,血浆IL24含量高峰在4 h点;而6、8 mg/kg LPS致伤后,血浆IL24含量高峰提前到2 h点,而且高峰值非常显著升高(P 0.01,与2、4 mg/kgLPS相同时点及4 h组峰值相比),达到(167.9811.51)ng/L以上。各致伤组高峰以后仍然保持在较高水平,见表4。表4LPS致伤的ALI大鼠血浆IL24含量的变化(ng/L,?xs,n=6)Tab 4Changes of plasma IL24 in rats with ALI/ARDS induced by LPSLPS(ng/L,?xs,n=6)Post2injury time(h)Group1246NS2C61.2513.2664.1214.1768.3316.2665.5215.08LPS 2 mg/kg89.6910.97#112.9310.143126.6810.553124.5412.623LPS 4 mg/kg98.6611.253132.4611.713142.6211.693132.4513.343LPS 6 mg/kg106.4413.133167.9811.513 158.5210.953154.5210.613LPS 8 mg/kg115.1514.553187.2713.133 165.5112.673160.4215.043NS2C:Normal saline control;3:P 0.01,vsNS2C at the same timepoint,#:P 0.05,vsNS2C at the same time point;:P 0.05,vsLPS 2 mg/kg and LPS 4 mg/kg at 2 h or 4 h3 讨论 革兰阴性菌感染是重症监护室十分常见的院内感染,由此而产生的内毒素血症,是引发ALI或ARDS的主要原因。合并革兰阴性菌感染的危重患者多数预后不良,死亡率很高。研究显示,以过度的全身炎症反应为特征的SIRS是ALI或ARDS的发病基础,而代偿性抗炎反应综合征(compensatory anti2inflammatory responsesyndrome,CARS)也是重要的发病机制之一,其特点就是内源性抗炎因子过度释放4。目前认为,ALI就是SIRS在肺脏的主要表现,ARDS是其严重的结果。LPS是内毒素的主要成分,参与构成革兰阴性菌的胞壁外膜,是强有力的致伤剂,具有激活免疫应答的能力,使免疫细胞活化分泌细胞因子。通常,LPS用于静脉注射致伤小动物,复制感染性损伤模型5。本研究采用梯度剂量LPS致伤Wistar大鼠,通过递增强度致伤,模拟临床严重感染引发脓毒症的发生、发展过程6。IL24是由单核细胞、淋巴细胞产生和释放的抗炎细胞因子,能够抑制LPS诱导的炎性细胞因子产生7,8。在ALI大鼠肺组织中,有大量炎症细胞扣押,含有较多的单核细胞和淋巴细胞,是肺组织产生、释放IL24的主要来源。如果机体产生IL24过多,可以引起继发性免疫抑制9。观察梯度剂量LPS诱导的ALI大鼠的病理、病理生理变化10,以及血浆IL24含量的变化,对于研究ALI的发生与发展有着十分重要的意义。本研究表明:梯度剂量LPS可引起不同程度的ALI;当LPS6mg/kg时,大鼠呼吸窘迫,死亡率显著升高,PaO2早期低于8 kPa,肺水含量非常显著高于较低LPS剂量组,病理变化显著加重,透明膜形成,符合ARDS的基本特征,说明LPS 6 mg/kg是诱导大鼠发生ARDS的临界剂量。本研究还表明,LPS可导致大鼠血浆IL24含量升高;当LPS6 mg/kg时,大鼠血浆IL24含量,尤其是峰值含量显著高于较低LPS剂量组,说明LPS6 mg/kg可以引发大鼠抗炎因子释放显著增多。研究结果表明,由大鼠尾静脉注射LPS可以复制出不同程度的ALI模型;当LPS6 mg/kg时,大鼠血浆IL24含量异常升高;血浆IL24含量的异常变化与ALI发生、发展可能有密切关系。参考文献:1钱桂生.呼吸系统疾病研究进展与展望J.第三军医大学学报,2001,23(2):123-124.2 Bone R C.Immunologic dissonance:a continuing evolution in our under2standing of the systemic inflammatory response syndrome(SIRS)and themultiple organ dysfunction syndrome(MODS)J.Ann Intern Med,1996,125(8):680-687.3 Sun D,Zhao M,Ma D,et al.Protective effect of interleukin21 receptorantagonist on oleic acid2induced lung injuryJ.Chin MedJ(Engl),1996,109(7):522-526.4 Bone R C,Sir Isaac Newton.Sepsis,SIRS and CARSJ.Crit Care Med,1996,24(7):1125-1128.5Yamasawa H,Ishii Y,K itamura S.Cytokine2induced neutrophil chemoat2tractant in a rat model of lipopolysaccharide2induced acute lung injuryJ.Inflammation,1999,23(3):263-274.6胡 森.MODS动物模型研究进展J.中国危重病急救医学,1999,11(8):504-507.7 Choi P,Reiser H.IL24:role in disease and regulation of productionJ.Clin Exp Immunol,1998,113(3):317-319.8 Hart P H,Bonder C S,Balogh J,et al.Differential responses of humanmonocytes and macrophages to IL24 and IL213J.J 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