TZAP蛋白在乳腺导管癌中的表达及临床意义.pdf

第 36 卷第 3 期2023 年 6 月华 夏 医 学Acta Medicinae SinicaVol.36 No.3Jun.2023DOI:10.19296/ki.1008-2409.2023-03-004论 著ORIGINAL ARTICLETZAP 蛋白在乳腺导管癌中的表达及临床意义秦亚萍a,杨明清a,杨 帆a,刘 祎a,张小玲b,肖胜军a(桂林医学院 a.第二附属医院病理科,b.基础医学院生理学教研室,广西 桂林 541199)摘要 目的:观察端粒锌指相关蛋白(TZAP)在乳腺导管癌及癌旁非瘤组织中的表达及其临床意义。方法:采用免疫组化法检测 145 例乳腺浸润性导管癌、35 例导管原位癌及癌旁正常乳腺组织中TZAP 的表达,分析其表达与临床病理特征的关系。结果:与癌旁正常乳腺组织 100%强阳性相比(180/180),TZAP 蛋白在乳腺导管内癌中虽然都有着色(总阳性率 100%,35/35),但总体表达下调(其中强阳性率5.71%,2/35;中等阳性率68.57%,24/35;弱阳性率25.71%,9/35);在浸润性导管癌中表达下调更明显(阳性率为 45.52%,66/145;阴性率为 54.48%,79/145)。TZAP 阴性的病例具有组织学分级较高、肿瘤体积较大、有淋巴结转移、HER2 基因有扩增、Ki67 增殖指数较高、TNM 分期较高的特点,表明 TZAP 表达下调与乳腺导管癌的发生和进展有关。结论:TZAP 在乳腺导管癌组织中表达下调,可能在其发生和恶性进展中起重要作用。关键词:乳腺癌;浸润性导管癌;端粒锌指相关蛋白;免疫组织化学中图分类号:R737.9 文献标志码:A 文章编号:1008-2409(2023)03-0019-06Expression and clinical significance of TZAP protein in patients withbreast ductal carcinomaQIN Yapinga,YANG Mingqinga,YANG Fana,LIU Yia,ZHANG Xiaolingb,XIAO Shengjuna(a.Dept.of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guilin Medical University,b.Dept.ofPhysiology,College of Basic Medical Sciences,Guilin Medical University,Guilin 541199,China)Abstract Objective:To detect the expression and clinical significance of telomere zinc finger-associatedprotein(TZAP)in breast ductal carcinoma tissues and paired paraneoplastic noncancerous breast tissues.Methods:145 cases of invasive ductal carcinoma tissues,35 cases of breast intraductal carcinoma tissuesand paired paraneoplastic noncancerous breast tissues were subjected to immunohistochemistry.Therelationship between the expressions of TZAP and its clinicopathological parameters were analyzed.Results:Compared with paraneoplastic noncancerous breast tissues(100%strong stained,180/180),91基金项目:国家自然科学基金项目(82060500)。第一作者简介:秦亚萍,硕士研究生在读,研究方向为鼻咽癌化疗。通信作者:肖胜军,E-mail:xiaoshengjun 。第 3 期华 夏 医 学第 36 卷TZAP protein was stained in intraductal carcinoma(100%positive,35/35),but its overall expressionwas down-regulated(with strong positive rate of 5.71%,2/35;moderate positive rate of 68.57%,24/35;weak positive rate of 25.72%,9/35).TZAP protein was more significantly downregulated in invasiveductal carcinoma tissues(with positive rate of 45.52%,66/145;negative rate of 54.48%,79/145).TZAP negative cases were characterized by higher histological grade,larger tumor size,positive lymphnode metastasis,amplification of HER2 gene,higher proliferation index of Ki67 and higher TNM clinicalstage,indicating that the downregulation of TZAP protein was associated with the carcinogenesis andprogression of breast ductal carcinoma.Conclusion:The downregulated TZAP in breast ductal carcinomatissues may be involved in carcinogenesis and progression of breast ductal carcinoma.Keywords:breast carcinoma;invasive ductal carcinoma;telomere zinc finger-associated protein;immunohistochemistry 端粒锌指相关蛋白(telomere zinc finger-associatedprotein,TZAP),是一个端粒长度负性调节因子,能直接 结 合 端 粒 双 链 5-TTAGGG-3 重 复 序 列1。TZAP 通过启动端粒环化来调节端粒长度,防止异常延长的端粒累积2。TZAP 可以作为转录因子结合启动子区,调节一系列靶基因的表达,包括 MTFP1、SNX15、CCDC106 等3。TZAP 通过特异性激活 P53通路(ARF-MDM2-P53-P21WAF/CDKN1A)来抑制细胞增殖4。在多个肿瘤中 TZAP 表达与端粒反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)表达呈正相关,表明了 TZAP 在肿瘤中的重要作用5。有研究表明,TZAP 突变的乳腺癌患者预后较差6,但TZAP 在乳腺癌中的表达未见报道。本研究通过免疫组化检测发现 TZAP 在乳腺导管癌中表达下调,其表达下调与进展期临床病理特征和高增殖指数相关。1 材料与方法1.1 材料选取2015 年1 月至2019 年12 月桂林医学院第二附属医院收治的 180 例需进行手术切除的乳腺癌患者,其中浸润性导管癌 145 例,乳腺导管原位癌 35例。患者均为女性,年龄 2882 岁。患者临床资料完整,术前均未行放化疗及免疫治疗。本研究获桂林医学院第二附属医院医学伦理委员会审核批准,患者知情并签署知情同意书。兔抗人 TZAP 多克隆抗体(浓缩型,1 200 稀释,Abcam 公司);ER、PR、HER2、Ki67(即用型抗体,福州迈新生物技术有限公司);HER2 基因扩增FISH 检测试剂盒(安必平医药科技公司);二抗免疫组化检测试剂(福州迈新生物技术有限公司)。1.2 方法1.2.1 组织芯片制备 组织芯片由桂林泛谱生物技术有限公司制备。具体方法如下:镜下观察 HE 切片,标记 1 个肿瘤组织区域和 1 个癌旁组织区域,然后通过组织芯片制作机打孔采集组织,并转移至空白蜡块阵列孔中,孔芯直径 1.5 mm,制作组织芯片蜡块 3 个,每个蜡块含 121 个点(60 个癌组织、60 个癌旁组织、1 个标志点)。1.2.2 免疫组化及 FISH 检测 蜡块4 m 厚连续切片,60 烤片1 h,二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化。免疫组化后续过程如下:0.1 mol/L 柠檬酸溶液(pH 6.0)中高温高压热修复 3 min,其他步骤按试剂盒说明书进行,DAB 显色,苏木精复染,盐酸乙醇分化,脱水透明封固。以 PBS 代替一抗作阴性对照。切片脱蜡水化后进行 FISH 检测,FISH 检测步骤严格按照试剂盒说明书进行。1.2.3 结果判读 由病理科的 2 位主治医师采用双盲法独立阅片。判断标准:TZAP 几乎表达于所有乳腺上皮或肿瘤细胞,因此根据染色强度计分:棕黄色,强阳性,计 3 分;棕黄色,中等阳性,计 2 分;浅黄色,弱阳性,计 1 分;不着色,阴性,计 0 分。ER、PR、HER2根据染色强度和阳性细胞百分比来判定。ER5%、PR5%的细胞核着色为阳性;Ki6730%的细胞核02第 3 期秦亚萍等:TZAP 蛋白在乳腺导管癌中的表达及临床意义第 36 卷着色为高表达。HER2 免疫组化及 FISH 结果判读:HER2 免疫组化 3+和/或 FISH 检测显示 HER2 基因扩增,即为 HER2 基因扩增阳性7。乳腺癌分子分型根据 ER、PR、HER2 结果进行替代分子分型8。1.3 统计学方法采用 SPSS 22.0 统计学软件分析数据,浸润性导管癌中 TZAP 表达与临床病理特征及各蛋白表达及 HER2 扩增之间的关系采用2检验。P0.05 表示差异具有统计学意义。2 结果2.1 TZAP 蛋白在乳腺导管内癌、浸润性导管癌及癌旁非瘤乳腺组织中的表达TZAP 阳性细胞细胞质和细胞核均着色,在癌旁正常乳腺组织中表达阳性率为 100%(180/180),表现为强阳性。在乳腺导管内癌中其阳性率为 100%(35/35),但是阳性强度较低,其中强阳性率仅 5.71%(2/35),中等阳性率 68.57%(24/35),弱 阳 性 率25.71%(9/35),在浸润性导管癌中阳性率为 45.52%(66/145),其中强阳性率 6.90%(10/145),中等阳性率23.45%(34/145),弱阳性率 15.17%(22/145),阴性率 54.48%(79/145),表明 TZAP 在乳腺导管内癌及浸润性导管癌中表达下调,见图 1、表 1。A.TZAP 在癌旁乳腺导管及小叶上皮中强阳性表达;B.TZAP在高级别导管内癌中中等阳性表达;C.TZAP 在组织学 I 级浸润性导管癌中强阳性表达;D.TZAP 在组织学级浸润性导管癌中表达缺失图 1 TZAP 蛋白在乳腺导管内癌、浸润性导管癌及癌旁非瘤乳腺组织中的表达(200)表 1 TZAP 在乳腺导管内癌、浸润性导管癌和癌旁非瘤组织中的表达(n,%)组织类型nTZAP 表达强阳性中等阳性弱阳性阴性导管内癌癌组织352(5.71)24(68.57)9(25.71)0癌旁组织3535(100.00)000浸润性导管癌癌组织14510(6.90)34(23.45)22(15.17)79(54.48)癌旁组织145145(100.00)0002.2 浸润性导管癌中 TZAP 蛋白表达的临床意义乳腺浸润性导管癌中,TZAP 表达与组织学分级、肿瘤大小、淋巴结转移、HER2 扩增、Ki67 增殖指数、TNM 分期相关。TZAP 阴性的病例组织学分级较高、肿瘤体积较大、有淋巴结转移、HER2 基因有扩增、Ki67 增殖指数较高、TNM 分期较高,以上数据提示 TZAP 表达下调与进展期临床病理特征有关,见表 2。12第 3 期华 夏 医 学第 36 卷表 2 乳腺浸润性导管癌中 TZAP 蛋白表达与临床病理参数的关系(n,%)临床病理参数nTZAP 表达阳性阴性2P年龄(岁)6679604524(53.33)21(46.67)0.05组织学分级I5642(75.00)14(25.00)5419(35.19)35(64.81)355(14.29)30(85.71)35.7192,55218(34.62)34(65.38)5206(30.00)14(70.00)8.6850.05淋巴结转移N06939(56.52)30(43.48)N1-37627(35.53)49(64.47)5.6100.05ER 表达阳性11055(50.00)55(50.00)阴性3511(31.43)24(68.57)2.9820.05PR 表达阳性9948(48.48)51(51.52)阴性4518(40.00)27(60.00)0.7630.05HER2 扩增阳性4012(30.00)28(70.00)阴性10554(51.43)51(48.57)4.5340.05Ki67 增殖指数(%)305415(27.78)39(72.22)309151(56.04)40(43.96)9.8090.05TNM 分期I4430(68.18)14(31.82)7128(39.44)43(60.56)308(26.67)22(73.33)14.7740.0522第 3 期秦亚萍等:TZAP 蛋白在乳腺导管癌中的表达及临床意义第 36 卷3 讨论乳腺浸润性导管癌是一组异质性较大的疾病,目前通过免疫组化检测和分子检测对其进行分子分型,不同分子类型的浸润性导管的治疗和预后不同8。然而,针对相同分子亚型的特定治疗方案,也存在敏感性和耐药性的问题。因此,探讨乳腺浸润性导管癌的发生发展分子机制,仍然有重要的意义9。端粒位于染色体末端,包含 DNA 重复序列,在有丝分裂过程中逐渐缩短,端粒缩短至一定程度激活 DNA 损伤反应,导致细胞周期阻滞和复制性细胞老化10。而异常延长的端粒是导致细胞肿瘤性转化、促进肿瘤发生的重要分子机制之一11。TZAP是一个端粒相关蛋白,对于维持端粒的长度具有重要作用1。TZAP 能优先结合长端粒,竞争性抑制端粒重复因子 1/2,启动端粒环化机制,快速切除端粒重复序列2。因此,TZAP 结合于长端粒启动了端粒环化开关,设定端粒长度的上限。TZAP 异常可能促进肿瘤性转化,导致肿瘤发生。相关研究发现6,TZAP 在乳腺癌中突变率为7.81%(10/128)。与无突变的病例比较,突变的乳腺癌病例具有较长的端粒长度,生存期较短,预后较差,这些突变导致 TZAP 蛋白的功能缺失。本研究通过免疫组化检测发现,在乳腺导管内癌中,TZAP表达强度明显低于癌旁正常乳腺组织,表明 TZAP下调可能参与乳腺癌的发生。这些结果与 TZAP 突变的数据相符,一起揭示 TZAP 表达下调和突变所致的功能缺失参与乳腺导管上皮的转化,导致乳腺癌的发生。此外,有研究表明,TZAP 还可以作为转录激活因子调节一系列靶基因的表达,从而促进恶性肿瘤的进展,其靶基因包括 MFTP1、ARF 等3-4。MFTP1参与线粒体分裂,功能丧失会导致细胞色素 C 释放,导致细胞凋亡。ARF 能抑制细胞周期进展12。以上数据表明,TZAP 通过靶基因调节细胞增殖和存活。本研究通过免疫组化检测发现,TZAP 蛋白在乳腺浸润性导管癌组织中表达明显下调。TZAP 阴性的病例具有中晚期的临床病理特征:组织学分级较高、肿瘤体积较大、有淋巴结转移、HER2 基因有扩增、Ki67 增殖指数较高、TNM 分期较高。以上结果表明 TZAP 下调参与乳腺癌的进展。本研究结果显示,乳腺浸润性导管癌中 TZAP 蛋白下调的病例,Ki67 增殖指数较高,提示 TZAP 下调可能参与肿瘤的增殖和凋亡。TZAP 如何调控肿瘤的侵袭和转移仍不明确,TZAP 的非端粒功能目前缺乏研究数据,有待于进一步研究以全面揭示其抑癌功能。总之,TZAP 下调在乳腺浸润性导管癌发生发展过程中起重要作用,TZAP 是乳腺浸润性导管癌治疗和预后的潜在分子标记。参考文献:1 LI J S Z,MIRALLES FUST J,SIMAVORIAN T,et al.TZAP:a telomere-associated protein involved in telomerelength controlJ.Science,2017,355(6325):638-641.2 GARCIA-EXPOSITO L,OSULLIVAN R J.TZAP-ing telo-meres down to sizeJ.EMBO Rep,2017,18(6):861-863.3 JAHN A,RANE G,PASZKOWSKI-ROGACZ M,et al.ZBTB48 is both a vertebrate telomere-binding protein and atranscriptional activatorJ.EMBO Rep,2017,18(6):929-946.4 BIE Y N,GU P,CHEN Y T,et al.TZAP plays an inhibi-tory role in the self-renewal of porcine mesenchymal stromalcells and is implicated the regulation of premature senes-cence via the p53 pathwayJ.JTransl Med,2019,17(1):72.5 DOS SANTO S G A,VIANA N I,PIMENTA R,et al.Telomeric zinc-finger associated protein(TZAP)in cancerbiology:friend orfoe?J.Mol Biol Res Commun,2021,10(3):121-129.6 HEO Y R,LEE M H,KWON S Y,et al.TZAP mutationleads to poor prognosis of patients with breast 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