T_CI 121-2023 RNA定量测序技术规程.docx

ICS07.080CCSC 04 团体标准T/CI 1212023RNA 定量测序技术规程The technical procedure of RNA quantitative sequencing2023 - 08 - 31 发布2023 - 08 - 31 实施中国国际科技促进会发 布目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩 略语15 质量控制要求26 RNA 核酸样品采集方法37 总 RNA 核酸样品完整度检测48 RNA 建库59 高通量测序仪质控及测序1210 数据分析12前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国国际科技促进会提出并归口。 本文件起草单位：深圳承启生物科技有限公司、武汉承启医学检验实验室有限公司、暨南大学、华南理工大学、赛哲生物。 本文件主要起草人：张 弓、陈 洋、余 卓、王 鑫、卢少华、金静洁、杜红丽、卢 红、陈 杰。 RNA 定量测序技术规程1 范围本文件确立了用于高通量转录组测序的总RNA核酸类样品的转录组测序和质控全流程，包括样本采集、处理、运输、检测和数据产生和质量评估分析全流程。本文件适用于从新鲜动植物组织、新鲜可培养细胞、全血和细菌/真菌等样品中提取的真核生物和原核生物的总RNA样本的测序。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 35537-2017 高通量基因测序结果评价要求 GB/T 40664-2021 用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求 T/CHIA 21.4-2021 组学样本处理与数据分析标准 第4部分：转录组文库构建 3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1高通量基因测序 high-throughput gene sequencing区别于传统双脱氧（Sanger）测序，一种能够一次并行对大量核酸分子进行平行序列测定的技术，通常一次测序反应能产出不低于100 Mb的测序数据。来源：GB/T 30989-2014，3.19 3.2转录组定量测序 whole transcriptome quantitative sequencing是通过新一代测序技术全面测定某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，通过对序列的统计分析确定每种转录本的量。 3.3文库 library通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个重建分子群，如基因组文库、互补DNA文库、噬菌体展示肽文库等。 来源：GB/T 30989-2014，3.5 3.4测序片段 reads高通量测序平台产生的含有碱基序列和质量值的序列片段。 来源：GB/T 35890-2018，3.2 3.5Q30测序数据中，碱基识别质量值为30的碱基识别准确率为99.9%，或错误率为0.1%。 来源：GB/T 40226-2021，3.64 缩略语下列缩略语适用于本文件。 RNA：核糖核苷酸（Ribonucleic acid） DeoxyriboNucleic acid） rRNA：核糖体RNA（Ribosomal RNA） bp： 碱 基 对 （Base pair） OD：光密度（Optical density） Trizol：总RNA抽提试剂（TRIpure Reagent） PCR：聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction） DNB：DNB纳米球（DNA nanoball） NCBI：美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information） RefSeq：RNA参考序列库（RNA reference sequences collection） FANSe3 ： 超高精度的高速序列比对算法（ Fast and Accurate mapping algorithm for Next-generation Sequencing, the 3rd generation） 5 质量控制要求5.1 通用要求5.1.1 生物样本及相关数据的使用应遵守区域、国家和国际的伦理规范。 5.1.2 样本质量要求应通过完整性和样本浓度确定，达到 GB/T 40664-2021 的总 RNA 样品质量要求。 5.1.3 用于高通量测序的核酸类样本应根据 GB/T 35537-2017 中 4.1 和 4.2 中的碱基测序准确率的要求进行质量控制。 5.1.4 使用 MHCC97H 细胞来源的 RNA 标准品进行转录组测序，对测序仪状态进行评估：按测序仪推荐的上样量进行测序，测序采用 PE150 模式进行，对第一端数据进行分析，使用 FANSe3 将 reads 比对到NCBI refseq 人类标准参考转录组，FANSe3 设置参数为-E5 -I1，比对率80%，Q3080%，说明仪器和试剂状态良好，可进行待测样品的转录组高通量测序。 5.1.5 所有使用的化学试剂均要求至少分析纯。 5.2 动植物组织、培养细胞、全血和细菌/真菌样本量要求根据不同样品类型和不同测序目标准备足量样品，在条件许可情况下，尽量加倍准备样品量，并做好样品备份工作，表1为推荐样品量。 表1 推荐样品量样品类型 推荐样品量 新鲜动物组织 200 mg 新鲜植物组织 300 mg 新鲜培养细胞 3106 个 全血 1 mL 细菌/真菌菌体 300 mg 5.3 RNA 样品运输要求5.3.1 RNA 样品如果需要运输，应尽量溶于足量 Trizol 后运送（Trizol 的体积应不小于 RNA 溶液体积的 5 倍，并充分混合均匀），尽量送往距离最近的实验室进行后续实验操作。 5.3.2 如需低温运送，应使用足够多的冰袋和保温盒，保证整个运输过程中的温度。低温运送时不应使用干冰。 5.3.3 空运时可使用普通 0C 冰袋或-20C 封闭式冰盒，以防止温度过低而使塑料管变脆破裂。应使用旋盖密封管或气密性包装，以免因气压变化造成管盖弹开。 5.3.4 不同运送距离和时间，推荐运输条件见表 2。 表2 RNA 样品推荐运输条件距离到达时间建议运输条件小于 200 公里 当天 常温 200 公里至 1200 公里 当天 常温 陆运 2 天 常温，也可加 0C 冰袋 1200 公里至 2500 公里 陆运 3 至 4 天或空运 2 天 普通 0C 冰袋 大于 2500 公里 空运 3 天 普通 0C 冰袋 陆运 7 至 10 天（需谨慎） -20C 封闭式冰盒 5.4 总 RNA 核酸样本质量要求5.4.1 总 RNA 完整性本文件同时满足高完整度RNA样品和轻微降解RNA样品建库和测序要求。 对于高完整度RNA样品，总RNA样本的完整性应符合GB/T 40664-2021的要求。通过凝胶电泳分析总RNA的rRNA的28S/18S（真核样品）和23S/16S（原核样品）rRNA比值进行判断，rRNA条带亮度比值接近2:1，rRNA条带明亮完整，说明无明显降解。 若样品因较长时间暴露在空气中或反复冻融的轻微降解RNA样品，若经凝胶电泳显示样品的rRNA条带勉强能分辨，28S/18S（真核样品）或23S/16S（原核样品）rRNA亮度比值低于2:1，或有明显拖尾， 通常仍可按照本流程获得与未降解样品一致性较高的结果。 5.4.2 总 RNA 浓度和纯度样本总RNA浓度应大于1 ng/L。RNA样本纯度：OD260/280=1.82.05。提纯后的RNA中应确保无酚类污染，UV吸收光谱最高峰应在260 nm 3 nm。 5.5 转录组建库样本质量要求对常见的动物、真菌等物种，包括人、鼠、水稻、酵母等，推荐使用的投入总RNA量为10 ng-1 g。对于如水稻、拟南芥等植物mRNA丰度较低的物种，建议提高投入总RNA量至1 g-2.5 g。当样本轻微降解可适当增加投入量，总投入量一般不超过2.5 g。 6 RNA 核酸样品采集方法6.1 样品前处理不同样品种类，样品前处理操作见表3： 表3不同种类样品前处理方法样品类型处理方法无细胞溶液（如细胞培养上清、血清，包括已提纯好溶于水的RNA） 至少加入溶液体积5倍以上的Trizol，充分混匀。蛋白质浓度特别高时（如血清）建议至少加入10倍以上体积的Trizol。 动物细胞（培养细胞）、植物原生质体 直接溶于足量Trizol中。 动物组织、临床组织块 大块的组织不易溶解，需低温快速剪成或切成0.5 mm3以下的小块。由于组织离体后RNA会随着时间变化而变化，且RNA更易降解，因此若剪碎时间较长，请在液氮中研磨。Trizol 的量要加足，建议按10倍体积来加。部分组织可能较难溶解，可用涡旋振荡器剧烈振荡， 或用枪头、玻璃棒、金属棒等碾碎，使其均匀溶于Trizol，无沉淀。骨组织等无机盐含量高的组织块最终无法全部溶解，属正常现象。 细菌 微量台式离心机3000 rpm - 6000 rpm 3 min-10 min离心收菌，勿使用过高离心力。弃上清，溶于Trizol，可能需要剧烈涡旋振荡或枪头反复吹打才可完全溶解。部分细菌（尤以革兰阳性菌为甚）细胞壁非常厚，难以良好溶于Trizol，造成RNA提取效率极低。遇到这种情况请在收菌后用溶菌酶先进行破壁，再使用Trizol。极端情况下请于低温下使用细菌磨、French Press、Cell cracker等设备进行快速破壁后再溶于Trizol，但切记动作要快细胞破碎后RNA降解会很迅速，即便是在4C条件下。 样品类型处理方法植物组织 由于植物组织次生代谢产物极其复杂，常含有多糖多酚，不同组织差异极大，因此可先将组织在液氮中碾碎，然后溶于足量Trizol，离心取上清。若提取效率低下，建议采用试剂盒或CTAB法提取RNA，再按无细胞溶液溶于Trizol。 6.2 总 RNA 样品提取方法总RNA样品提取方法如下： a) 每 1000 微升 Trizol 加入 0.2 mL 氯仿，剧烈混匀（可涡旋）15 s，室温放置 3 min，可观察到样品开始分层； b) 12000 g， 4C 离心 15 min，使样品分成三层； c) 小心吸取上层水相，约 600 L，转移至新的 1.5 mL EP 管中，注意操作时不要吸取到中间层液体； d) 加入 800 L 异丙醇，倒置混匀；如样品中 RNA 很少，可加入 1 L 糖原帮助沉淀； e) 置于-20C 静置，如只需测定真核生物中的成熟体 mRNA，静置 1h；如果需测定原核生物 RNA 或真核生物的 lncRNA、小 RNA 等，需静置 8h； f) 12000 g，4C 离心 30 min，去除上清液； g) 加入 1 mL 75% 乙醇（需-20C 提前预冷 30 min）； h) 7500 g， 4C 离心 5 min，去除上清； i) 重复步骤 6.2 g)、6.2 h)一次； j) 去除残留的乙醇，打开管盖，风干约 5 min 至管底无明显液体残留； k) 加入无 RNA 酶的纯水溶解，此步骤得到总 RNA 样品，置于-80C 冰箱保存。 7 总 RNA 核酸样品完整度检测采用凝胶电泳分析法检测RNA完整度。凝胶电泳检测总RNA样本完整性结果见图1。 注： 左边第一泳道为指示核酸分子大小的一系列核酸分子，从上到下分子量大小分别为：2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp和100 bp；其余泳道为真核细胞总RNA样品。样品均为完整度高的总RNA样品，上样量为 2 g。图1 琼脂糖凝胶电泳评估总 RNA 提取的纯度和完整度8 RNA 建库8.1 基因组 DNA 去除RNA易被DNA污染，若不去除基因组DNA容易影响测序质量。需先用DNase I去除 DNA 并纯化后再开始后续实验，具体操作如下： a) 反应体系见表 4； 表4 DNA 去除反应液组分投入质量或体积Total RNA 1 g 10X reaction buffer with MgCl2 1 L DNase I，RNase-free 1 L（1U） RNase-Free Water to 10 L b) 37C 孵育 30 min； c) 加入 1 L 50 mM EDTA 60C 孵育 10 min 终止 DNase I 反应； d) 去除基因组后的 RNA 马上进行 mRNA 富集。 8.2 mRNA 富集（根据需要，两种方法选其一）8.2.1 rRNA 去除法富集 RNA非真核生物RNA样品或降解严重的RNA样品，推荐采用rRNA去除法对RNA进行富集。使用对应物种的rRNA去除试剂盒富集RNA后，直接进入步骤8.3 RNA片段化。 8.2.2 磁珠法富集 RNA一般情况下，完整或轻微降解的真核生物RNA样品推荐使用Vazyme的Library Preparation VAHTS mRNA Capture Beads进行mRNA捕获： a) 将 mRNA Capture Beads 从 2C-8C 取出，静置使其温度平衡至室温； b) 准备 RNA 样品：在一个 Nuclease-free PCR 管中，用 Nuclease-free H2O 将 0.01 g-12.5 g 总 RNA 稀释至 50 L，冰上放置备用； c) 涡旋振荡 mRNA Capture Beads 充分混匀，吸取 50 L 加入到总 RNA 样品中，用移液器吹打至少 10 次以彻底混匀； d) 将样品置于 PCR 仪中，65C 5 min，25C 5 min，4C hold，使 mRNA 结合到磁珠上； e) 将样品置于磁力架 5 min，使 mRNA 与总 RNA 分离；小心移除上清； f) 将样品从磁力架上取出，用 200 L Beads Wash Buffer 吹打 6 次以彻底混匀，在磁力架上静置 5 min，小心移除上清； g) 将样品从磁力架上取出，用 50 L Tris Buffer 重悬磁珠；用移液器吹打 6 次以彻底混匀； h) 将样品置于 PCR 仪中，80C 2 min，25C hold，将 mRNA 洗脱下来； i) 加入 50 L Beads Binding Buffer，用移液器吹打 6 次以彻底混匀； j) 室温放置 5 min，使 mRNA 结合到磁珠上； k) 将样品置于磁力架 5 min，使 mRNA 与总 RNA 分离；小心移除上清； l) 将样品从磁力架上取出，用 200 L Beads Wash Buffer 吹打 6 次以彻底混匀，在磁力架上静置 5 min，小心移除全部上清； m) 加入 12 L Nuclease-free H2O，用移液器吹打 6 次充分混匀，将样品置于 PCR 仪中，80C 2 min，立即置于磁力架上 5 min，待溶液澄清后，小心吸取 10 L 上清至一个新的 Nuclease-free PCR 管中； n) 剩余的 2 L 于 NanoDrop 仪器检测 mRNA 富集后浓度，一般浓度大于 0.5 ng/L 都可进入后续RNA 文库构建； o) mRNA 富集后样品可置于-20C 短暂保存，建议立即进入 RNA 文库构建。 8.3 RNA 片段化mRNA文库进行二代测序应将步骤8.3至8.10替换为T/CHIA 21.4-2021中4.1.3至4.1.9章节中的普通转录组建库流程进行；本流程基于MGIEasy mRNA文库制备试剂盒进行标准文库构建，最终将使用基于DNA纳米球与联合探针锚定聚合技术结合的测序技术平台对mRNA文库进行二代测序。其他二代测序技术与之大同小异，可参照执行。 a) 向 mRNA 富集后的 10 L 洗脱液中加入 4 L Fragmentation Buffer 吹打 10 次混匀，瞬时离心后放入 PCR 仪中； b) 根据插入片段大小的需要，选择相对应的片段化条件，片段化条件见表 5。 表5 片段化条件推荐插入片段片段化条件片段化时间150 bp 94C 8 min 250 bp 87C 6 min 8.4 反转录以及二链合成8.4.1 将 RT Buffer 从-20C 取出，解冻后颠倒混匀，在冰上配制反转录反应液，反应液体系见表 6。 表6 反转录反应液组分 体积 RT Buffer 5 L RT Enzyme Mix 1 L Total 6 L 8.4.2 用移液器吸取 6 L 配制好的反转录反应液加入上一个步骤的片段化后产物中吹打 10 次混匀， 瞬时离心将反应液收集至管底。 8.4.3 按照表 7 中的反应条件在 PCR 仪中进行反应。 表7反转录反应条件温度时间热盖 on 25C 10 min 42C 30 min 70C 15 min 4C Hold 8.4.4 反应结束后，将产物置于冰上，瞬时离心 10 s。 8.4.5 将 Second Strand Buffer 从-20C 取出，解冻后颠倒混匀，在冰上配制二链合成反应液，反应液体系见表 8。 表8二链合成反应液组分体积Second Strand Buffer26 LSecond Strand Enzyme Mix4 LTotal30 L8.4.6 用移液器吸取 30 L 配制好的二链合成反应液加入到上一步骤的反转录产物中吹打 10 次混匀， 瞬时离心将反应液收集至管底。8.4.7 按照表 9 反应条件在 PCR 仪中进行反应。 表9 二链合成反应条件温度 时间 热盖 on 16C 60 min 4C *Hold *不建议停止在此步骤，会降低产物回收效率，继续做完二连产物纯化后方可停止实验。 8.4.8 反应结束后，瞬时离心 10 s，将二链产物转移至新的 1.5 mL 离心管中，置于冰上待下步反应。 8.5 二链产物纯化8.5.1 提前 30 min 取出DNA Clean Beads 置于室温，使用前充分震荡混匀。8.5.2 用移液器吸取 75 L DNA Clean Beads 至步骤 8.4.8 中的二链产物中并轻轻吹打至少 10 次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入 1.5 mL 离心管。 8.5.3 室温孵育 5 min。 8.5.4 瞬时离心，将 1.5 mL 离心管置于磁力架，静置 5 min 至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。 8.5.5 保持 1.5 mL 离心管置于磁力架上加入 200 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置 30 s 后小心吸取并丢弃上清。 8.5.6 重复 8.5.5 步骤尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。 8.5.7 持 1.5 mL 离心管固定于磁力架上，打开 1.5 mL 离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。 8.5.8 将 1.5 mL 离心管从磁力架上取下加入 42 L TE Buffer 进行 DNA 洗脱用移液器轻轻吹打至少10 次以混匀 ，瞬时离心。 8.5.9 室温下孵育 5 min。 8.5.10 将 1.5 mL 离心管置于磁力架上静置 2 min-5 min 至液体澄清将 40 L 上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中。 8.5.11 停止点：二链产物纯化后，可置于-20C 冰箱储存。 8.6 末端修复及添加 dA 尾8.6.1 在冰上配制末端修复及添加 dA 尾反应液，反应液体系见表 10。 表10 末端修复及添加 dA 尾反应液组分 体积 ERAT Buffer 7.1 L ERAT Enzyme Mix 2.9 L Total 10 L 8.6.2 用移液器吸取 10 L 配制好的 末端修复&添加 dA 尾反应液加入步骤 8.5.10 的纯化后二链产物中并轻轻吹打至少 10 次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.6.3 按照表 11 反应条件在 PCR 仪中进行反应。 表11 末端修复及添加 dA 尾反应条件温度 时间 热盖 on 37C 30 min 65C 15 min 4C Hold 8.6.4 瞬时离心将反应液收集至管底。不建议在此处停止，请继续做步骤 8.7 如果必须停止，末端修复产物可以放在-20C 冰箱过夜，但产量可能下降 20%左右。 8.7 接头连接8.7.1 Total RNA 为 1 g 所以接头应该稀释 5 倍使用，反应液体系见表 12： 表12 Adapter 稀释组分 体积 Adapter 2 L TE Buffer 8 L Total 10 L 4 的 PCR 管中加入 5 L 对应的稀释后的 Adapter，用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.7.3 在冰上配制接头连接反应液，反应液体系见表 13： 表13 接头连接反应液组分 体积 Ligation Buffer 23.4 L DNA Ligase 1.6 L Total 25 L 8.7.4 用移液器缓慢吸取 25 L 配制好的接头连接反应液加入步骤 8.7.2 的 PCR 管中用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.7.5 按照表 14 反应条件进行在 PCR 仪中进行反应，反应体系见表 14： 表14 接头连接反应条件温度 时间 热盖 on 23C 30 min 4C Hold 8.7.6 瞬时离心将反应液收集至管底。 8.7.7 加入 20 L TE Buffer 至总体系 100 L，全部转移到新的 1.5 mL 离心管中。接头连接后产物可放置-20C 冰箱过夜储存，不超过 16 h。 8.8 连接产物纯化8.8.1 插入片段为 150 bp（RNA 片段化条件为 94C ，8 min）的纯化方法8.8.1.1 提前 30 min 取出 DNA Clean Beads 置于室温，使用前充分震荡混匀。 8.8.1.2 用移液器吸取 50 L DNA Clean Beads 至步骤 8.7.7 中的二链产物中并轻轻吹打至少 10 次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入 0.2 mL PCR 管中。 8.8.1.3 室温孵育 5 min。 8.8.1.4 瞬时离心，将 PCR 管置于磁力架，静置 5 min 至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。 8.8.1.5 保持 PCR 管置于磁力架上加入 200 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置 30 s 后小心吸取并丢弃上清。 8.8.1.6 重复 8.8.1.5 步骤尽量吸干管内液体，保持 PCR 管固定于磁力架上，打开管盖，室温干燥， 直至磁珠表面无反光、无开裂。 8.8.1.7 将 PCR 管从磁力架上取下加入 52 L TE Buffer 进行 DNA 洗脱用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀 ，瞬时离心，室温下孵育 5 min。 8.8.1.8 将 PCR 管置于磁力架上静置 5 min 至液体澄清将 50 L 上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中。连接产物纯化后，可置-20C 冰箱储存。 8.8.2 插入片段为 250 bp（RNA 片段化条件为 87C ，6 min）的纯化方法8.8.2.1 用移液器吸取 32.5 L DNA Clean Beads 至步骤 8.8.1.8 中的 50 L 上清产物中并轻轻吹打至少10 次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入0.2 mL PCR 管中，室温下孵育5 min。 8.8.2.2 瞬时离心，将 PCR 管置于磁力架上静置 5 min 至液体澄清将 80 L 上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中。 8.8.2.3 用移液器吸取 10 L DNA Clean Beads 至步骤 8.8.2.2 中的 80 L 上清产物中并轻轻吹打至少 10 次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入 0.2 mL PCR 管中，室温下孵育 5 min。 8.8.2.4 瞬时离心，将 PCR 管置于磁力架，静置 5 min 至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。 8.8.2.5 保持 PCR 管置于磁力架上加入 200 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置 30 s 后小心吸取并丢弃上清。 8.8.2.6 重复步骤 8.8.2.5 尽量吸干管内液体，保持 PCR 管固定于磁力架上，打开管盖，室温干燥， 直至磁珠表面无反光、无开裂。 8.8.2.7 将 PCR 管从磁力架上取下加入 23 L TE Buffer 进行 DNA 洗脱用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀 ，瞬时离心，室温下孵育 5 min。 8.8.2.8 将 PCR 管置于磁力架上静置 5 min 至液体澄清将 21 L 上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中。连接产物纯化后，可置-20C 冰箱储存。 8.9 PCR 扩增8.9.1 在冰上配置 PCR 反应液如表 15 所示。 表15 PCR 反应液组分 体积 PCR Enzyme Mix 25 L PCR Primer Mix 4 L Total 29 L 8.9.2 用移液器吸取 29 L 配制好的 PCR 反应液加入步骤 8.8.2.8 的 PCR 管中，用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.9.3 按照表 16 反应条件进行在 PCR 仪中进行反应： 表16 PCR 扩增反应条件温度 时间 循环数 热盖 on 1循环 95C 3 min 95C 30 s 10-14循环（1 g Total RNA设置12或13个循 环） 56C 30 s 72C 1 min 72C 5 min 1循环 4C Hold 8.9.4 瞬时离心将反应液收集置管底，吸取全部反应液转移到新的 PCR 管中。 8.9.5 PCR 产物质控：取 1 L PCR 产物琼脂糖凝胶电泳查看 PCR 产物片段大小以及文库浓度（图 2）， 若插入片段为 250 bp 则 PCR 产物主片段在 330 bp 左右，插入片段为 150 bp 则 PCR 产物主片段在 230 bp 左右，条带颜色均匀，说明不用继续加 PCR 循环数。 注： 左边第一泳道为指示核酸分子大小的一系列核酸分子，从上到下分子量大小分别为：500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、150 bp、100 bp和50 bp；其余泳道为PCR产物。 图2 PCR 产物质检8.10 PCR 产物纯化8.10.1 提前 30 min 取出 DNA Clean Beads 置于室温，使用前充分震荡混匀。 8.10.2 用移液器吸取 60 L DNA Clean Beads 至步骤 8.9.4 中的 PCR 产物中并轻轻吹打至少 10 次以，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入 0.2 mL PCR 管中。 8.10.3 室温孵育 5 min。 8.10.4 瞬时离心，将 PCR 管置于磁力架，静置 5 min 至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。 8.10.5 保持 PCR 管置于磁力架上加入 200 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁静置 30 s 后小心吸取并丢弃上清。 8.10.6 重复步骤 8.10.5 尽量吸干管内液体，保持 PCR 管固定于磁力架上，打开管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。 8.10.7 将 PCR 管从磁力架上取下加入 32 L TE Buffer 进行 DNA 洗脱用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀 ，瞬时离心，室温下孵育 5 min。 8.10.8 将 PCR 管置于磁力架上静置 5 min 至液体澄清将 30 L 上清液转移到新的 0.2 mL PCR 管中。PCR 纯化后产物，可置-20C 保存。 8.10.9 通过基于电泳分离原理的设备对 PCR 纯化后产物进行片段分布检测。使用基于花菁染料（DNA 双链特异性结合）原理的试剂和荧光计测定文库真实浓度。要求最终 PCR 产物的摩尔产量 1 pmol， 不同片段大小的 PCR 产物对应的产量请参考表 17。 表17 不同片段大小 PCR 产物 1 pmol 对应产量插入片段主片段大小（bp） PCR 产物主片段大小（bp） 1 pmol 对应产量（ng） 150 230 152 250 330 218 8.11 变性8.11.1 根据 PCR 产物的主片段分布，参考表 17，将 6-16 个样本混合环化（按照实际需求确定混合样本的数量），需根据 MGIEasy DNA Adapters 说明书使用规则设计混合方案，在 PCR 产物定量后进行不同 Adapters 样本混合，混合后总量为 1 pmol，用 TE Buffer 补充至总体积 48 L。例如：构建插入片段主片段为 150 bp 的文库，8 个样本混合测序时每个样本需要相等的数据量，则每个样本的 PCR 产物取 19 ng 混合共 152 ng 至新的 0.2 mL PCR 管中，用 TE Buffer 补充至总体积 48 L。 8.11.2 将步骤 8.11.1 所述 PCR 管置于 PCR 仪上，按照表 18 的条件进行反应： 表18 变性反应条件温度 时间 热盖 on 95C 3 min 8.11.3 反应结束后，立即将 PCR 管转移到冰上，静置 2 min 后瞬时离心。 8.12 单链环化8.12.1 在冰上配制单链环化反应液，见表 19： 表19 单链环化反应液组分 体积 Splint Buffer 11.6 L DNA Rapid Ligase 0.5 L Total 12.1 L 8.12.2 用移液器吸取 12.1 L 配制好的单链环化反应液加入步骤 8.11.3 的 PCR 管中，涡旋震荡 3 次， 每次 3 s，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.12.3 将 PCR 管置于 PCR 仪上，按照表 20 的条件进行反应： 表20 单链环化反应条件温度 时间 热盖 on 37C 30 min 4C Hold 8.12.4 反应结束后，瞬时离心，将 PCR 管转移到冰上，立即进入下步反应。8.13 酶切消化8.13.1 上一步反应时，提前在冰上配制酶切消化反应液，见表 21：表21 酶切消化反应液组分 体积 Digestion Buffer 1.4 L Digestion Enzyme 2.6 L Total 4.0 L 8.13.2 用移液器吸取 4 L 配制好的酶切消化反应液加入步骤 8.12.4 的 PCR 管中，涡旋震荡 3 次，每次 3 s，瞬时离心将反应液收集至管底。 8.13.3 将步骤 8.13.2 所述 PCR 管置于 PCR 仪上，按照表 22 的条件进行反应： 表22 酶切消化反应条件温度 时间 热盖 on 37C 30 min 8.13.4 瞬时离心将反应液收集至管底。 8.13.5 反应结束后，向 PCR 管中加入 7.5 L Digestion Stop Buffer，涡旋震荡 3 次，每次 3 s，瞬时离心将反应液收集至管底，吸取全部反应液转移到新的 1.5 mL 离心管中。 8.14 酶切消化产物纯化8.14.1 提前 30 min 取出 DNA Clean Beads 置于室温，使用前充分震荡混匀。 8.14.2 吸取 170 L DNA Clean Beads 至步骤 8.13.5 的酶切消化产物中，用移液器轻轻吹打至少 10 次以混匀，最后一次应确保将吸头中所有液体及磁珠都打入 1.5 mL 离心管中。 8.14.3 室温孵育 10 min。 8.14.4 瞬时离心，将 1.5 mL 离心管置于磁力架，静置 2min-5 min 至液体澄清，用移液器小心吸取并丢弃上清。 8.14.5 保持 1.5 mL 离心管置于磁力架上，加入 500 L 新鲜配制的 80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置 30 s 后小心吸取并丢弃上清。 8.14.6 重复步骤 8.14.5，最后一次漂洗后尽量吸干管内液体，有少量残留在管壁时可将离心管瞬时离心，在磁力架上分离后，用小量程的移液器将管底液体吸干。 8.14.7 保持 1.5 mL 离心管固定于磁力架上，打开 1.5 mL 离心管管盖，室温干燥，直至磁珠表面无反光、无开裂。 8.14.8 将 1.5 mL 离心管从磁力架上取下，加入 22 L TE Buffer 进行 DNA 洗脱，用移液器轻