宣肺止嗽合剂中4种生物碱的含量测定方法研究_李岩.pdf

基金项目:甘肃省药品科研项目(No.2019GSMPA018);甘肃省药品产业技术扶持项目(No.2019KF011);中药材及饮片质量控制重点实验室项目 2022GSMPA KL12，2022GSMPA KL10;甘肃省药品科研项目 2022GSMPA0017;兰州市科技计划项目资助(2022 3 41)。作者简介:李岩(1979)，女，汉族，本科，高级工程师，研究方向为中药质量标准研究工作。E mail:499578985 通信作者:张明童(1987)，男，汉族，硕士研究生，主管药师，研究方向为中藏药检验研究工作。E mail:zhangmingtong2010 宣肺止嗽合剂中 4 种生物碱的含量测定方法研究李岩1李成明2张明童3*李冬华3马潇31 甘肃省药品监督管理局审核查验中心，甘肃兰州730030;2 甘肃省中医院药学部，甘肃兰州730050;3 甘肃省药品检验研究院(甘肃省中藏药检验检测技术工程实验室，国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室)，甘肃兰州730070;【摘要】目的:建立同时测定宣肺止嗽合剂中 4 种生物碱含量的高效液相色谱分析方法。方法:色谱柱为安捷伦SB C18(250 mm 4.6 mm，5 m);流动相:乙睛 0.1%磷酸溶液(397);检测波长:210 nm;流速:1.0 mLmin1;柱温:30;进样量:10 L。结果:吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱 4 种生物碱成分在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数 r20.9960，平均回收率分别为 97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，对应的 SD 分别为 1.2%、1.2%、1.6%、1.4%(n=9)。10 批宣肺止嗽合剂样品中吗啡的含量为 0.078 0.160 mgmL1、磷酸可待因的含量为0.008 0.025 mgmL1、蒂巴因的含量为 0.0002 0.0013 mgmL1、盐酸罂粟碱的含量为 0.010 0.025 mgmL1。结论:该方法操作简便，结果准确，可用于宣肺止嗽合剂的质量控制，为其质量标准的提升提供参考依据。【关键词】宣肺止嗽合剂;吗啡;磷酸可待因;蒂巴因;盐酸罂粟碱;含量测定;高效液相色谱法【中图分类号】284.1【文献标志码】A【文章编号】1007 8517(2023)01 0043 05Determination of Four Alkaloids in Xuanfei Zhisuo MixtureLI Yan1LI Chengming2ZHANG Mingtong3*LI Donghua3MA Xiao31 Audit and inspection center of Gansu Drug Administration，Lanzhou 730050，China2 Department of Pharmacy，Gansu Hospital of Traditional Chinese Medicine，Lanzhou 730050，China;3 Gansu Provincial Institute of Drug Inspection(Gansu Provincial Chinese and Zang Medicine Inspection and TestingAbstract:Objective To establish a HPLC method for simultaneous determination of four alkaloids in Xuanfei Zhisuo mixtureMethods Chromatographic column:Agilent SB C18(250 mm 4.6 mm，5 m);mobile phase:ethylene 0.1%phosphoric acidsolution(397)，detection wavelength:210 nm;Flow rate:1.0 mLmin1;column temperature:30;injection volume:10L esults The linearity of morphine，codeine phosphate，tibaine and papaverine hydrochloride in the range of their respective massconcentrations was good with correlation coefficient r 0.9960 The average recoveries were 97.8%，96.9%，97.4%and 97.5%，respectively The corresponding SD were 1.2%，1.2%，1.6%，1.4%(n=9)The contents of morphine，codeine phosphate，dibaine and papaverine hydrochloride in 10 batches of Xuanfei Zhishou mixture were 0.078 0.160 mgmL1，0.008 0.025 mgmL1，0.0002 0.0013 mgmL1and 0.010 0.025 mgmL1 Conclusion The method is simple and accurate，which can beused for the quality control of Xuanfei Zhisuo mixture and provide reference for the improvement of its quality standardKey words:Xuanfei Zhisuo Mixture;Morphine;Codeine Phosphate;Tibaine;Papaverine Hydrochloride;Content Determina-tion;HPLC宣肺止嗽合剂收录于 2020 年版 中国药典(一部)中，由蜜罂粟壳、荆芥、前胡、桔梗等 10味中药组成，具有疏风宣肺、止咳化痰之功，用于治疗风邪犯肺证咳嗽，症见咳嗽、咽痒、鼻塞34中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1Technology Engineering Laboratory，National Medical Products Administration Key Laboratory ofQuality Control of Chinese Medicinal Materials and Decoction Pieces)，Lanzhou 730070，China;流涕、恶寒发热、咯痰1。该制剂中含有蜜罂粟壳，其主要成分为吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱等多种生物碱成分。吗啡具有镇痛、镇咳和抑制呼吸等药理作用2 4，磷酸可待因、蒂巴因和盐酸罂粟碱也具有显著的止咳、镇痛作用5，说明罂粟壳是通过多种成分发挥作用。但是，吗啡及其其他生物碱成分连续服用易产生依赖性、瘾癖，超剂量使用会出现呃逆、呼吸困难、昏迷等中毒症状。因此，为了确保制剂的安全性及有效性，需要确定可供质量控制的特征成分，制定质量控制标准。2020 年版 中国药典(一部)对宣肺止嗽合剂含量测定项中，采用高效液相色谱(HPLC)法控制蜜罂粟壳中的吗啡含量，且前处理过程繁琐、费时，并易造成样品中生物碱的损失，同时由于样品中吗啡含量较低，其他成分对其影响较大。因此，本实验采用 HPLC 法同时测定宣肺止嗽合剂中 4 种生物碱(吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱)含量，以完善、提升宣肺止嗽合剂的质量控制标准。1仪器与材料1.1仪器Waters e2695 型高效液相色谱仪(美国 Waters 公司);ME24 102 型万分之一电子天平、XS205DU 十万分之一型电子天平(瑞士梅特勒 托利多公司);KQ 250E 数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。1.2材料吗啡对照品(批号:171201 201324，含量93.9%)、磷酸可待因(批号:171203 200303，含量96.9%)、蒂巴因(批号:171216 200403，含量 100.0%)、盐酸罂粟碱(批号:171214 200404，含量99.9%)均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯，磷酸为优级纯，甲醇为分析纯，水为超纯水。宣肺止嗽合剂 10 批(甘肃普安制药有限公司提供)。2方法与结果2.1溶液的制备2.1.1对照品溶液精密称取吗啡 0.01130 g、磷酸可待因 0.01047 g，蒂巴因 0.01660 g、盐酸罂粟碱 0.01088 g，分别置于 25 mL 量瓶中，加甲醇超声使其溶解，并定容至刻度，摇匀，制成对照品储备液。再各取适量置50 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得含吗啡 8.4886 gmL1、磷酸可待因 2.0293 gmL1、蒂巴因 0.3220 gmL1、盐酸罂粟碱 0.5217 gmL1的混合对照品溶液。2.1.2供试品溶液精密量取宣肺止嗽合剂样品 1mL，用氨试液10 mL 调节 pH 值至 10 11，用水饱和的正丁醇振摇提取 3 次，每次 25 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解，转移至10 mL 棕色量瓶中，加 5%磷酸的 20%甲醇至刻度，摇匀，即得。同时制得空白对照溶液。2.2色谱条件色谱柱:安捷伦 SB C18(250 mm4.6 mm，5 m);流动相:乙睛 0.1%磷酸溶液(397);检测波长:210 nm;流速:1.0 mLmin1;柱温:30;进 样 量:10 L。色 谱 图 如 图 1所示。(A)对照品色谱图(B)供试品色谱图(C)空白溶液色谱图1.蒂巴因;2.吗啡;3.盐酸罂粟碱;4.磷酸可待因图 1HPLC 色谱图2.3方法学考察2.3.1线性关系考察精密吸取对照品储备液适量，加甲醇溶液配制成吗啡含量为 0.849 gmL1、1.698 gmL1、3.395 gmL1、8.489gmL1、16.977 gmL1、84.886 gmL1，磷酸可待因含量为 0.203 gmL1、0.406 gmL1、0.812 gmL1、2.029 gmL1、4.059gmL1、20.293 gmL1，蒂巴因含量为 0.033gmL1、0.066 g mL1、0.133 g mL1、0.332 g mL1、0.664 g mL1、3.320 g mL1，盐酸罂粟碱含量为 0.052 gmL1、0.104gmL1、0.209 gmL1、0.522 gmL1、1.043gmL1、5.217 gmL16 个梯度浓度的混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱条件分析，分别进样10 L。按外标两点法，以峰面积为横坐标，进样量(gmL1)为纵坐标，得出 4 种成分的回归方程、相关系数 r2及线性范围，结果表明，各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。见表1。44中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1表 14 种生物碱的回归方程、线性范围和相关系数表化合物回归方程线性范围/gmL1r2吗啡y=2 07x+0.00050.849 84.8860.9999磷酸可待因y=5 08x 0.00020.203 20.2930.9960蒂巴因y=7 08x+0.00230.033 3.3200.9980盐酸罂粟碱y=5 07x 0.00050.052 5.2170.99882.3.2精密度试验精密吸取浓度为吗啡 8.4886gmL1、磷酸可待因 2.0293 gmL1、帝巴因 0.3320 gmL1、盐酸罂粟碱 0.5217 gmL1混合对照品溶液 10 L，连续重复进样 6 次，测得峰面积积分值的 SD 在 0.22%0.45%，表明仪器精密度良好。见表 2。表 24 种生物碱成分的精密度、重复性及稳定性结果表(n=6)化合物SD/%精密度重复性稳定性吗啡0.222.810.61磷酸可待因0.372.110.59蒂巴因0.261.490.56盐酸罂粟碱0.451.350.652.3.3重复性试验取编号 1 的供试品溶液，按照“2.1.2”项下方法平行制备 6 份供试品溶液，“2.2”项下色谱条件分析测定，分别测定并计算各成分的含量。测定结果 SD 在 1.35%2.11%，表明方法重复性良好。见表 2。2.3.4稳定性考试验取编号1 的供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h 进样10 L 进行测定，测得各成分的含量 SD 在0.56%0.65%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。见表2。2.3.5加样回收率试验采用加样回收法，取已知 4 种生物碱含量的宣肺止嗽合剂(编号 1)样品9 份，分 3 组，取样量各为 1 mL，精密加入低、中、高(0.5 倍、1 倍、1.5 倍)3 个浓度的混合对照品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2”项下色谱条件进行测定，计算回收率。详见表 3。吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂 粟 碱 的 平 均 加 样 回 收 率 分 别 为 97.8%、96.9%、97.4%、97.5%，SD 分 别 为 1.2%、1.2%、1.6%、1.4%。表 3加样回收率实验结果表(n=9)成分原有量/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均值/%SD/%0.1340.0670.19997.010.1340.0670.19895.520.1340.0670.20098.510.1340.1340.26597.76吗啡0.1340.1340.26698.5197.81.20.1340.1340.26799.250.1340.2010.33198.010.1340.2010.33097.510.1340.2010.33298.510.0120.0060.017998.330.0120.0060.017896.670.0120.0060.017795.000.0120.0120.023898.33磷酸可待因0.0120.0120.023595.8396.91.20.0120.0120.023696.670.0120.0180.029697.780.0120.0180.029496.670.0120.0180.029597.220.00090.000450.0013395.560.00090.000450.0013497.78蒂巴因0.00090.000450.0013395.5697.41.60.00090.00090.0017998.890.00090.00090.0017897.7854中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1表 3(续)成分原有量/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均值/%SD/%0.00090.00090.0017695.56蒂巴因0.00090.001350.002297.7897.41.60.00090.001350.002499.260.00090.001350.002398.520.0210.01050.031499.050.0210.01050.031398.100.0210.01050.031196.190.0210.0210.041597.62盐酸罂粟碱0.0210.0210.041296.1997.51.40.0210.0210.041095.240.0210.03150.051897.780.0210.03150.052199.050.0210.03150.052098.412.4样品的测定取 10 批次宣肺止嗽合剂，分别精密量取 2 mL，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，以“2.2”项下色谱条件进行测定，按外标法计算样品中吗啡、磷酸可待因、蒂巴因、盐酸罂粟碱的含量。结果见表 4。表 4样品含量测定结果表(n=4)批号吗啡/mgmL1磷酸可待因/mgmL1帝巴因/mgmL1盐酸罂粟碱/mgmL110.1340.0120.00090.02120.0820.0110.00040.01830.0830.0130.00060.01040.1470.0220.00100.02350.1600.0250.00130.02560.1560.0230.00130.02470.1270.0170.00090.01680.1250.0110.00070.01890.0780.0080.00030.013100.0810.0160.00020.0133讨论3.1供试品溶液制备条件的优化本方法采用加浓氨试液，在碱性条件下将生物碱盐转变成游离生物碱，用水饱和的正丁醇提取，去除脂溶性杂质，再用含 5%磷酸的 20%甲醇溶液提取。为了优化提取的条件，以 A(供试品溶液取样量)、B(氨试液使用量)和 C(水饱和正丁醇提取量)为3 个因素，设计 L9(34)正交试验。各因素的 3 水平分别为:A(1 mL、2 mL、3 mL);B(5 mL、10 mL、15 mL);C(15 mL、25 mL、35 mL)。样品液的制备:精密量取宣肺止嗽合剂样品 A 取样量，用氨试液提取量 B 调节 pH 值至 10 11，用水饱和的正丁醇振摇提取 3 次，每次使用量 C，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加流动相适量使溶解，转移至 10 mL 棕色量瓶中，加 5%磷酸的20%甲 醇 至 刻 度，摇 匀，即 得。经 微 孔 滤 膜(0.45 m)过滤，弃去初滤液，取续滤液进行测定分析。极差()结果表明，3 个因素中样品量对提取率影响最大，其次是氨试液提取量，影响最小的是样品水饱和正丁醇提取量。试验表明，以宣肺止咳合剂取样量为1 mL，加入氨试液10 mL后用25 mL 水饱和正丁醇提取量条件最佳，提取率最高，故确定为供试品制备方法。3.2测定波长的选择通过 DAD 检测器进行全波长扫描(200 400 nm)，考察了 4 个组分的最大紫外吸收波长，结果发现吗啡、磷酸可待因、蒂巴因都在 210 nm 波长处有最大吸收、盐酸罂粟碱250 nm 波长处具有最大吸收，考虑可待因与蒂巴因含量较低，为获得更大灵敏度，最终确定 210nm 作为检测波长，四种生物碱均有良好的响应，64中国民族民间医药2023 年1 月第32 卷第1 期Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy，2023，Vol.32，No.1灵敏度较高。3.3流动相的优化中国药典选用 0.05 mol/L 磷酸二氢钾溶液 0.005 moL/L 庚烷磺酸钠溶液 乙腈(552)作为流动相，考虑到庚烷磺酸钠对色谱系统污染较大，并且样品对色谱柱的要求较高。因此通过优化方法降低了对色谱系统的污染。经查阅相关文献资料6 10，本实验主要考察了甲醇 0.05%磷酸水、乙腈 0.1%磷酸水、乙腈 0.1%磷酸的 0.01 moLL1磷酸二氢钾缓冲液、乙腈 0.1%甲酸的 0.02 molL1乙酸铵溶液 4 种流动相，结果表明，乙睛 0.1%磷酸溶液样品中，虽然吗啡和盐酸罂粟碱的色谱峰出峰时间较为接近，但各色谱峰的分离度均大于 1.5，且各色谱峰的峰形较好，故以此流动相比例进行测定，后续实验将进一步对流动相进行优化。3.4结果分析10 批宣肺止嗽合剂测定结果显示，吗啡的含量为 0.078 0.160 mgmL1、磷酸可待因的含量为 0.008 0.025 mgmL1、蒂巴因的含量为 0.0002 0.0013 mgmL1、盐酸罂粟碱的含量为 0.010 0.025 mgmL1，且 4 种成分间存在一定的变化趋势:即吗啡含量高，其他 3 个成分的含量也随之增加;可见 中国药典以吗啡的含量测定对宣肺止嗽合剂质量进行控制，具有一定的意义，但不够用全面。本研究建立了高效液相色谱同时测定宣肺止嗽合剂中 4 种成分的含量测定方法，具有前处理简单，灵敏度高的特点，为较为全面的控制宣肺止嗽合剂质量，提供了数据支持，同时对修订完善其质量标准，保证药品有效性和安全性提供了实验基础。参考文献 1 国家药典委员会中华人民共和国药典(一部)M 北京:中国医药科技出版社，2015:369 2 谢书俊 宣肺止嗽合剂治疗感冒后遗咳嗽 100 例的效果评价 J 大家健康(下旬版)，2013，7(5):40 41 3 史广超，邢亚恒，李景钊 宣肺止嗽合剂治疗细菌性肺炎 的 疗 效 观 察 J 中 国 实 用 医 药，2012，7(26):166 167 4 陈鸣 罂粟壳的临床应用与管理现状 J 中国药房，2016，27(25):3461 3463 5 中国医药科学院药物研究所中药志(第 3 册)M 北京:人民卫生出版社，1984:685 6 李永庆，陈蕾，赵文，等 中国药典中阿片系列品种吗啡含量测定方法的研究与建立(三、四)J 中国药品标准，2004，5(1):18 21 7 季申，王柯 GC 法测定中药罂粟壳中吗啡、可待因和罂 粟 碱 的 含 量 J 中 草 药，1998(8):526528 8 王实强，首弟武 高效毛细管电泳法测定罂粟壳中生物碱的含量 J 色谱，1997，15(5):438 439 9 刘永利，袁浩，李冬梅，等 UPLC 法测定罂粟壳中 3种生物碱类成分含量 J 中药材，2011(9):13861388 10 黄红梅，苏菊，王芳，等 HPLC 法同时测定咳速停糖浆中 5 个生物碱的含量 J 药物分析杂志，2018(4):688 695(收稿日期:2022 05 09编辑:陶希睿檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾檾)(上接第 40 页)16 LI X Q，TIAN W，LIU X X，et al Corosolic acid inhib-its the proliferation of glomerular mesangial 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