碳纳米材料在引导骨再生膜中的应用研究进展_周洪玲.pdf

中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期牙周炎是一种常见的牙周支持组织慢性炎症性疾病，由口腔微生物与宿主免疫炎症反应之间相互作用失衡引起，影响着全球10.8%人口的口腔健康1。牙周炎会逐渐破坏牙周支持组织（牙龈、牙槽骨、牙周膜和牙骨质）的结构，导致牙槽骨吸收、牙周袋形成和牙周附着丧失，且与糖尿病、心脑血管疾病、消化道疾病等全身系统性疾病密切相关2。引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）是临床上治疗严重牙周组织缺损的主要手段，通过在骨缺损表面覆盖屏障膜，阻止竞争性上皮组织和结缔组织的侵入，从而促进具有再生潜力的骨祖细胞或干细胞由缺损处外周向中心迁移，并缓慢分化形成新的牙周组织，建立牙周新附着3。理想的GBR膜应具备以下特性：优异的机械强度、适当的降解速率、空间维持能力、细胞屏障作用、生物相容性、组织整合性、良好的成骨活性及抗菌活性4。目前，商品化的GBR膜分为以下两类。不可吸收膜：包括聚四氟乙烯膜和钛膜，植入后基金项目：国家自然科学基金（81973684；31670992）作者单位：1.口腔疾病研究国家重点实验室，国家口腔疾病临床医学研究中心，四川大学华西口腔医院正畸科，四川 成都610041；2.成都中医药大学附属医院口腔科，四川 成都 610072通信作者：赵立星，电子信箱：综述DOI：10.19538/j.kq.2023.01.016碳纳米材料在引导骨再生膜中的应用研究进展周洪玲1，吴也可2，赵立星1摘要：引导骨再生（guided bone regeneration，GBR）是临床上治疗严重牙周组织缺损的主要方法，目前常用的GBR膜存在机械性能差、降解速率不稳定、成骨活性差等问题。碳是生命的基本元素之一，碳纳米材料具有高比表面积、高机械强度、低细胞毒性及良好的成骨活性等特性。近年来，包括碳纳米管、石墨烯在内的碳纳米材料开始用于制备GBR膜以改善其性能，更好地促进牙周组织再生。文章重点介绍基于碳纳米管、石墨烯的碳纳米材料在GBR膜中的应用，并对其生物相容性进行总结，以期对GBR膜的研究提供帮助。关键词：引导骨再生；碳纳米材料；膜；牙周炎中图分类号：R78文献标志码：AApplication research progress of carbon nanomaterials in guided bone regeneration membranesZHOUHong-ling*，WU Ye-ke，ZHAO Li-xing.*State Key Laboratory of Oral Diseases&National Clinical Research Center forOral Diseases&Department of Orthodontics，West China Hospital of Stomatology，Sichuan University，Chengdu 610041，ChinaCorresponding author：ZHAO Li-xing，E-mail：Abstract：Guided bone regeneration（GBR）is the main method in the clinical treatment of severe periodontal tissue defects.Currently，the commonly used GBR membranes have some problems such as low mechanical strength，unstable degradation rate and poor osteogenic activity.Carbon is one of the basic elements of life.Carbon nanomaterials have highspecific surface area，excellent mechanical properties，low cytotoxicity and good osteogenic activity.In recent years，carbon nanomaterials including carbon nanotubes and graphene have been used to produce GBR membranes to improvetheir properties and promote periodontal tissue regeneration.This paper mainly introduces the application of carbon nanomaterials based on carbon nanotubes and graphene in GBR membranes，and summarizes their biocompatibility，aiming toprovide help for the research of GBR membranes.Keywords：guided bone regeneration；carbon nanomaterials；membrane；periodontitis93Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1需要二次手术取出，术后细菌感染的风险高，并可能对新的再生组织造成进一步的损害；生物可吸收膜，如Bio-Gide膜，稳定性和力学性能差，降解速度快，抗菌及骨再生能力有限。碳是生命的基本元素之一，碳纳米材料（carbon nanomaterials，CNMs）具有优越的力学性能、低细胞毒性、良好的生物活性和化学稳定性，在组织再生、药物释放等生物医学领域显示出巨大的应用潜力5。近年来，包括碳纳米管（carbon nanotubes，CNTs）、石墨烯在内的CNMs开始用于制备GBR膜，以改善膜性材料的机械强度、亲水性、成骨活性等性能，更好地促进牙周组织再生。本文重点介绍基于CNTs、石墨烯的CNMs在GBR膜中的应用，并对其生物相容性及生物活性进行总结，分析CNMs在GBR应用中存在的挑战以及未来的发展方向。1CNTsCNTs是由碳原子经sp2杂化形成的纳米级中空圆柱形管状结构，可分为单壁碳纳米管（single-walled CNTs，SWCNTs）和多壁碳纳米管（multi-walled CNTs，MWCNTs）两种形式。CNTs 的几何形态类似于胶原微原纤维，长度1 30 m，直径0.5 20.0 nm，具有高长径比和高比表面积6。由于其独特的结构和纳米形貌，CNTs表现出较高的机械强度、良好的化学稳定性、独特的导电性和导热性，在生物医学领域应用广泛6。研究表明，CNTs可以作为核心启动羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）的结晶，并加速矿化过程7。此外，在CNTs涂层的培养皿中培养成骨细胞，细胞黏附性增强，存活率及增殖率升高。CNTs独特的粗糙纳米结构增加了CNTs涂层培养皿表面的粗糙度，从而提高细胞的黏附性和活力8。Usui 等9将 MWCNTs 与骨形态发生蛋白 2（bonemorphogenetic protein 2，BMP2）、胶原蛋白均匀混合后，通过真空冷冻干燥制成复合颗粒。将材料异位植入小鼠背部皮下3周后，BMP2/胶原蛋白/MWCNTs组新生的骨组织面积、骨矿物质含量、骨体积比均高于BMP2/胶原蛋白组，表明MWCNTs能促进骨形成。此外，HE染色结果显示，含MWCNTs的复合颗粒被整合到新生骨组织中，未引起任何明显的排斥反应或炎症反应。这说明CNTs具有特殊的骨组织相容性，提示CNTs在GBR中具有潜在应用前景。Xu等10将SWCNTs均匀分散在透明质酸溶液中，通过抽滤制成CNTs膜，发现其表面呈纳米结构，拉伸强度（202 MPa）显著高于聚四氟乙烯膜（32 MPa），对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1细胞）增殖和大鼠颅骨缺损修复均有促进作用。CNTs除了可以作为GBR膜主体成分促进骨再生以外，还可用作增强剂，提高多组分生物复合材料的结构完整性和力学性能，如硬度、弹性模量、拉伸强度、压缩强度等11。另外，在HA、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）等生物材料中添加CNTs可显著促进细胞黏附、增殖、迁移和成骨分化12。Seo等13研究发现，将功能化碳纳米管（functionalized carbon nanotube，f-CNT）引入壳聚糖（chitosan，CS）/二氧化硅杂化膜后，复合膜的力学稳定性和骨再生能力显著提高，生物降解速率明显降低。Zhang等14采用真空冷冻干燥和静电纺丝方法制备了聚（乳酸-乙醇酸）poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA/MWCNTs/细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）双层复合膜，作为GBR膜修复比格犬上颌牙周缺损。结果表明，MWCNTs的加入不仅可以改善PLGA的力学性能，还可以提高 PLGA 的细胞亲和力和生物活性，PLGA/MWCNTs/BC双层复合膜可促进牙周组织再生。尽管CNTs有许多优异的性能，但潜在的细胞毒性可能会阻碍其临床应用。分散在溶液中的CNTs 可能通过产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）和激活炎症反应引起细胞毒性并限制细胞活性15。然而，通过共价功能化（引入氨基、羧基等特定官能团）或非共价功能化（利用聚合物、表面活性剂与CNTs的非共价结合）对CNTs进行表面修饰后，CNTs的分散性可得到改善，细胞毒性降低13。Zhang等16分别用羧基、聚乙烯醇（polyvinylalcohol，PVA）和仿生磷灰石对MWCNTs进行表面修饰后，将其与人成骨样细胞（MG-63细胞）共培养，结果表明MG-63细胞增殖活力提高，细胞形态没有明显变化。其中，在细胞增殖期，仿生磷灰石改性 MWCNTs 样品中的细胞存活率达 67.23%。Barrientos-Duran等17制备了羧基共价功能化修饰的SWCNTs，体外研究表明其在1 20 g/mL的质94中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期量浓度范围内对鼠胚胎干细胞和人胎儿成骨细胞的存活率影响很小。总之，需要对CNTs的细胞毒性进行更深入的研究，以设计出最佳的CNTs表面功能化方案，最大程度减轻CNTs的生物毒性。2石墨烯及其衍生物石墨烯材料是由碳原子以蜂窝状晶格结构排列而成的二维纳米材料，包括原始石墨烯、氧化石墨烯（graphene oxide，GO）、还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）等形式。石墨烯材料具有高比表面积、高机械强度、导电性、导热性及易于功能化修饰等性能，在组织工程、口腔医学等领域应用广泛18。2.1石墨烯石墨烯具有独特的六方晶格纳米结构，表面没有化学基团，主要采用机械剥离、化学气相沉积、化学剥离、外延生长、化学合成等方法制备19。石墨烯因机械强度高、比表面积大，常用于GBR膜的制备20。其中，石墨烯的机械增强效果与其在复合材料中的分布密切相关。均匀分布可以有效地增强复合材料的力学性能，但石墨烯分子之间的内聚力会阻碍这种分布21。石墨烯的高比表面积可以极大地提高细胞黏附力和成骨活性，也有利于石墨烯的进一步功能化，以赋予石墨烯更好的化学活性，并改善其亲水性和分散性22。Lu等23制备了一种多层石墨烯水凝胶薄膜，平均拉伸模量达到（69 5）MPa，接近骨皮质的机械强度。这种薄膜不仅能更好地促进成骨细胞黏附、蛋白吸附和磷灰石沉积，还可以作为GBR屏障膜，维持成骨空间，加速大鼠颅骨缺损区的早期成骨和矿化。Wu 等24通过将石墨烯结合到PLGA中，制备了具有成骨活性的GBR膜，提高了大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrow mesenchymal stem cells，rBMSCs）的碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，ALP）活性和成骨相关基因表达水平。该研究发现，石墨烯激活PI3K/Akt/GSK-3/-catenin信号通路可能是其具有良好的体外骨诱导性的机制。2.2GOGO为石墨烯的氧化形式，主要通过改进的Hummers方法制取，是目前在生物医学中应用较为广泛的石墨烯家族成员。氧化后，GO仍保持层状结构，表面有丰富的羟基、环氧基、羧基、羰基等含氧官能团，具有良好的分散性25。GO及表面修饰的GO能增强细胞黏附和增殖，促进HA矿化和成骨分化26。在改进商品化的GBR膜性能方面，GO涂层可用来增加钛膜的细胞黏附性和成骨分化能力。Park 等27制作了用于GBR的GO/钛膜，该膜能增强MC3T3-E1细胞的成骨能力，并促进大鼠颅骨缺损区新骨形成。Zhou等28比较了 GO 包覆钛（GO-Ti）底物和钛酸钠（Na-Ti）底物对牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）的体外生物活性。研究发现，与Na-Ti底物相比，GO-Ti底物上的PDLSCs增殖率、ALP活性，以及成骨相关标志物型胶原、ALP、骨涎蛋白、Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）和骨钙素（osteocalcin，OCN）基因表达水平显著提高。另外，生物可吸收胶原膜虽然操作方便、不需要二次手术取出，但仍需进行各种修饰以提高其力学性能和生物相容性。De Marco等29通过GO的含氧官能团与胶原的氢键之间的相互作用，使GO包被胶原膜。富含GO的胶原膜表现出更低的形变能力、更好的粗糙度和更高的刚度。在质量浓度为2 g/mL和10 g/mL的GO胶原膜上培养3 d后，人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，hGFs）的增殖率均显著高于对照组。Radunovic等30证实了GO涂层的胶原膜在第14天和第28天明显促进牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）增殖，并且促进BMP2、Runx2等成骨相关基因的表达，能诱导DPSCs更快地分化为成牙本质细胞/成骨细胞。近年来，GO与其他生物材料的结合一直是深入研究的重点。研究表明，极少量的GO即可在很大程度上提高复合材料的机械强度31。Wan等32利用GO纳米片增强PCL电纺膜的力学性能和生物活性。结果表明，添加质量分数为0.3%的GO，在使PCL膜保持超过94%高孔隙率的同时，使PCL膜的拉伸强度、杨氏模量分别提高了95%和66%，同时在生物矿化过程中提高了其生物活性。力学性能的增强归因于纤维形态的改变，以及GO对PCL纳米纤维的增强作用，而生物活性的改善则源于GO表面的阴离子官能团促进了生物矿化物的形成。此外，GO的加入能改善复合材料95Chinese Journal of Practical Stomatology Jan.2023 Vol.16 No.1的亲水性，这在一定程度上有助于提高复合材料的细胞黏附性和分子吸附能力。Luo等33将人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）与添加了GO的PLGA电纺纳米纤维膜共培养。研究发现，GO增强了PLGA的亲水性和对蛋白质及诱导剂的吸附能力。同时，与纯PLGA纳米纤维相比，GO可促进hMSCs的黏附和增殖，并诱导其成骨分化。在某些多组分复合生物材料的制备过程中，GO还可作为界面相，促进其他组分的界面结合。Chen等34利用GO与HA之间强大的相互作用，使GO和HA在聚乳酸 poly（lactic acid），PLA 基质中能均匀分散，即使在其填充质量分数高达30%时也是如此，其综合了HA的生物相容性和 GO 的高强度，与普通 PLA/HA 对照组相比，可使细胞活力提高85%，同时抗拉强度和韧性分别提高了2倍和7.9倍。Liu等35采用一步真空过滤和仿生矿化法制备的GO/CS/HA复合膜具有独特的仿生多孔结构、优异的力学性能和良好的骨再生能力，可以在没有内源性细胞因子作用的情况下加速骨再生。此外，GO具有优异的抗菌性能，使其适用于GBR膜的制备。Cao等36对18篇关于GO抑菌活性研究的文献进行分析发现，GO抑菌率平均为88.88%。其中，GO 对革兰阴性菌的抑菌率为88.2%，对 革 兰 阳 性 菌 的 抑 菌 率 为 90.64%。Prakash 等37制备了 CS/PVA/GO/HA/金（Au）纳米复合膜，用于引导骨再生。结果表明，复合膜不仅具有良好的生物相容性和成骨诱导能力，还能有效抑制大肠杆菌、变异链球菌和金黄色葡萄球菌的增殖。Zhang 等38受到天然珍珠层和常用的GBR膜（Bio-Gide）的启发，制备了一种由致密的珍珠层结构和多孔层组成的新型双层CS/GO/硅化钙（CaSi）复合膜，用于GBR修复骨缺损。双层CS/GO/CaSi 复合膜与人牙髓间充质干细胞（humandental pulp mesenchymal stem cells，hDPMSCs）体外培养时，细胞黏附率达到90%以上。同时，该抑菌实验结果显示，双层CS/GO/CaSi复合膜对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变异链球菌的24 h抑菌率分别为50%、30%和50%，优于纯CS膜的抑菌效果，表明GO具有较好的抗菌能力。2.3rGOrGO通过物理或化学方法消除含氧官能团而获得，具有促进细胞黏附和增殖、仿生矿化和成骨分化的能力。即使不使用成骨介质，rGO也能促进PDLSCs黏附和增殖，并能诱导hMSCs自发成骨分化39。rGO常与生物材料结合，形成具有良好生物相容性和成骨诱导能力的新型复合材料。Lee等40制备的rGO/HA纳米复合材料能促进细胞的自发成骨分化及骨形成。Liu等41采用两步电化学方法成功制备了三维rGO/HA双层复合膜，用于引导骨再生。复合膜的三维rGO/HA多孔层可促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化；致密的二维rGO层能防止牙龈上皮的侵入，并具有良好的生物相容性，可促进人脐静脉内皮细胞增殖。体内研究进一步证实三维rGO/HA双层复合膜使新形成骨的体积增加、矿化增多，促进了骨缺损的修复。rGO 还可通过改善复合材料的亲水性，促进细胞黏附。Jabbari等42将rGO与丝素蛋白、CS共混制备复合膜，发现rGO可以增加膜的亲水性。丝素蛋白、CS和rGO以84 7 9的质量比混合可以获得较佳的性能，增强人骨肉瘤细胞（G292细胞）的黏附和成骨能力。综上，石墨烯及其衍生物可改善膜性材料的机械强度、亲水性和成骨活性等性能，在GBR领域应用前景广阔。然而，生物相容性是石墨烯及其衍生物应用于临床的先决条件。虽然许多研究通过体外细胞共培养和体内代谢分析证明了石墨烯材料的生物相容性，但是石墨烯材料的理化性质会极大地影响石墨烯与活细胞的相互作用43。此外，石墨烯材料在基质中的剂量和浓度与其细胞毒性有关，小尺寸和高浓度更有可能诱导细胞毒性效应，而低于10 g/mL的质量浓度是相对安全的36。生物材料在体内应用的长期安全性还取决于其生物降解性。石墨烯及其衍生物的降解产物尚未显示会造成实质性的细胞损伤，酶促环境以及特定的化学修饰可调节其降解速率，从而降低石墨烯材料诱导的细胞毒性44。3结语GBR是治疗严重牙周炎引起的牙周组织缺损的常用方法。目前，商品化的GBR膜中，不可吸收膜植入后需二次手术取出；生物可吸收膜稳定性和力学性能差，降解速度快。CNMs具有高比表面96中国实用口腔科杂志 2023年 1月 第 16卷 第 1期积、高机械强度、良好的生物相容性和成骨活性的优点，可用于制备新型GBR膜，改善膜性材料的性能。与传统的屏障膜相比，基于CNMs材料的GBR膜具有更可控的生物降解性和空间维持能力，更好的力学性能、生物相容性和成骨能力45。尽管目前CNMs用于GBR膜的研究取得了可喜的进展，但在实现临床应用之前仍面临诸多挑战。首先，CNMs难以大规模合成，在溶液中容易聚集等问题限制了CNMs的广泛应用46。CNMs的生产和加工技术有待突破，如何促进CNMs在基质中的均匀分布也将是未来研究的重点。其次，基于CNMs的材料在体内使用的长期安全性仍不清楚，现有研究的观察期短且采用的动物模型多为鼠、兔等小型哺乳动物。最后，CNMs与体内环境的相互作用机制还有待进一步阐明。探讨CNMs的代谢降解机制及成骨机制有助于了解CNMs在体内的分布，更好地预测相关的急性和慢性不良反应。随着研究者更加深入的研究及相关技术的进步，相信CNMs在GBR领域将有更大的应用前景。参考文献1 Van Dyke TE，Bartold PM，Reynolds EC.The nexus betweenperiodontal inflammation and dysbiosis J.Front Immunol，2020，11：511.2 刘东娟，潘亚萍.牙周炎与炎症性肠病的相关性研究进展 J.中国实用口腔科杂志，2019，12（3）：173-177.3王佳岱，林莉.期牙周炎的临床诊断与治疗 J.中国实用口腔科杂志，2021，14（1）：16-20.4 Zahid S，Khan AS，Chaudhry AA，et al.Fabrication，in vitro andin vivo studies of bilayer composite membrane for periodontalguided tissue regenerationJ.J Biomater Appl，2019，33（7）：967-978.5 Peng Z，Zhao T，Zhou Y，et al.Bone tissue engineering via carbon-based nanomaterialsJ.Adv Healthc Mater，2020，9（5）：e1901495.6 Peretz S，Regev O.Carbon nanotubes 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