快速生化需氧量微生物传感器的应用.pdf

第2 9 卷第7 期2 0 1 2 年7 月应用化学C H l N E S EJ O U R N A LO FA P P U E DC H E M l 铘YV 0 1 2 9k s 7J u l y2 0 1 2快速生化需氧量微生物传感器的应用赵利民4 郏建波6 刘长字(。长春市环境监测中心站长春1 3 0 0 2 2；中国科学院长春应用化学研究所长春1 3 0 0 2 2)籀萎采用混合菌B O D 鲥甜制备微生物传感器快速监测生化需氧量(B O D)，研究了矫正溶液选择、样品自降解及恒温装置对测量准确度的影响。结果表明，采用葡萄糖谷氨酸矫正溶液测得污水处理厂污水结果较B O D。方法偏低5 0 以上，而以污水本身制作矫正曲线取得了与B O D，一致的测试结果；样品在保存6h 后有机物自降解会使测量结果偏低4 0；快速B O D 在线监测时不仅需要对微生物传感器恒温同时也需要对样品及缓冲溶液恒温，这有利于样品快速接近缓冲溶液温度，减少空气饱和时间，从而提高监测效率，提升测试准确度。关键词生化需氧量，微生物传感器，恒温装置，在线矫正溶液中图分类号：0 6 5 2文献标识码：A文章编号：1 0 0 0 J D 5 1 8(2 0 1 2)0 r 7 m 8 1 9 埘D o I：I O 3 7 2 4 s P J 1 0 9 5 2 0 1 2 0 0 4 9 3水体有机污染物监测是评价水质的重要指标之一，它直接反应了水体受污染的程度。在自然条件下，可生化降解有机物能够被水中好氧微生物利用，同时消耗水中溶解氧，而溶解氧含量直接关系到水生生物的生命活动。因此，监测水体可生物降解有机物的耗氧量，即生化需氧量(B i o c h e m i c a lo x y g e nd e 咖n d。B O D)，至关重要。目前，国标规定的监测方法为5d 培养法，即B O D 5，是指在一定条件下，将待检测样品培养5d，通过检测5d 前后溶解氧含量的变化进行B O D 的计算。这种方法费时、误差大、且平行性差。因此快速B O D 监测方法的研究得到了诸多科研工作者的关注。快速B O D 方法泛指在短时间内可以得到水样B O D 值的一种新方法，包括微生物传感器、微生物反应器、微生物燃料电池及媒介体反应器等诸多方法，其中以微生物传感器方法最具有代表性口。它将微生物固定成膜后贴于氧电极表面构建微生物传感器，通过比较微生物传感器在可生化降解有机物含量改变时的输出信号的变化程度计算样品的B O D【2。在此基础上，也发展了一些商品化的快速B O D 监测仪器及相关行业标准 1。B O D 微生物传感器方法发展3 0 余年，已经取得诸多进步。然而在实际水样监测中，它依然不能有效地代替B 0 如方法。除了核心元件微生物传感器性能需要提高外，测试方法也影响快速B O D 在实际应用中的表现。快速B O D 的研究热点主要集中于新方法的研究。如在微生物传感器方法中，包埋材料及菌种的选择决定着微生物传感器一系列的特性，因而被普遍研究1。而研制出的微生物传感器的应用研究却很局限。本文着重研究快速B O D 方法在实际应用中的表现，如环境温度、样品储存时限及矫正溶液选择对测量准确度的影响，这些研究结果或对快速B O D 监测仪器的发展及B O D 监测方法的国标及行业标准的修订有一定的促进作用。1 实验部分l：l 试剂和仪器硅溶胶(s o l-g e l)和聚乙烯醇接枝4 乙烯基毗啶(P v A 苫-P(4 V P)按照文献 1 0 一1 1 方法制备。B O D s e e d(美国C o l e P 锄I e r)，营养肉汤培养基(德国C A s 0b r o t h，n u k a)，透氧膜(美国0 r b i s p h e r e，2 9 5 6 A)，透气膜(0】【y p h e n，G m b H，D 即s d e n，德国)，葡萄糖(C。H，：0。，北京鼎国)，谷氨酸(C 5 H，N 0 t，北京鼎国)。葡萄糖谷氨酸(G G A)溶液按文献 1 报道的方法配制，其B O D，值为1 9 8-n g L。磷酸氢二钠2 0 1 l l l J 吩收稿，2 0 1 2 m 1 2 9 修回通讯联系人：刘长宇，助理研究员；1 斟：O”l _ 8 5 2 6 2 7 4 8；F：0 4 3 1 8 5 鹋9 7 l l E m a i l：c y I i u c i a c j I c n；研究方向：污水在线监测方法万方数据应用化学第2 9 卷(N 如H P 0。1 2 H：O)和磷酸二氢钾(K H 2 P 0。)配制成0 1m 彬L 的磷酸缓冲溶液(p H=7 O)。水样取自长春市第二污水处理厂、河水及湖水。根据实验需要，进行稀释、灭菌等处理。本实验中所采用的试剂均为分析纯，实验用水为去离子水。分析天平，恒温水浴锅，高压灭菌锅，5 8 0 4 R 型离心机(德国E p p e n d o f f)，2 0 0 B 型摇床(上海智诚分析仪器制造有限公司)。c H l 8 3 0 型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)。B T l o o 型蠕动泵(保定兰格恒流泵有限公司)，D O-l 型型溶解氧电极(江苏江分电分析仪器有限公司)。l _ 2 微生物膜的制备将一粒B O D s e e d 胶囊溶解于5 0m L 灭菌的磷酸缓冲溶液中，摇床中震荡活化2h。取2 0 此活化好的上清液，接种于4 0 0m L 已灭菌的营养肉汤培养基中震荡培养1 2h。将扩大培养好的B O D 的e d 菌经4 0 0 0r m i n 离心分离后，按湿菌体重量配制成1 Og m L 的悬浮液。S o l-g e l、P v A 苫一P(4 一V P)、菌悬浮液按质量比1：2：1 混合均匀。取1 0“L 滴涂于透气膜表面，存于4 冰箱保存。1 3 装置及流程溶解氧电极是以金为工作电极(直径为o 8m m)，A g A g C l(支持电解质为O 1m o L LK C l)为参比电极，铂丝为对电极的三电极系统。工作电极表面覆盖一层透氧膜以防止电极受到样品污染。将制备好的生物膜固定于溶解氧电极表面便构建出用于快速B O D 监测的微生物传感器。将它配以流通池构成流通体系，以蠕动泵为动力，以二位三通阀控制缓冲溶液及样品的更替，以电化学工作站进行电化学信号的监测。测量B O D 时，缓冲溶液首先流经微生物传感器，微生物内源呼吸消耗一定溶解氧后，微生物传感器表面的氧含量达到平衡，记录此时溶解氧电极的稳态电流i。；当样品流经微生物传感器时，微生物降解有机物同时迅速消耗溶解氧，一段时间后，微生物传感器表面的氧含量达到另一平衡时，记录此时氧电极新的稳态电流i。稳态电流的差值越代表了微生物传感器表面溶解氧含量的变化，这是由于微生物与可生物降解有机物发生生化降解作用消耗溶解氧造成的，它与样品的B O D 值在一定范围内线性相关(图1)。p e n g“眦p u m p图l 快速B O D 监测流程图F i g 1s c h e m 砒i cd i a 私蛐0 fm p i dB O Dd e 把皿i 腿t i 仰2 结果与讨论2 1 矫正曲线选择对测量的影响在快速B O D 测定中，G G A 通常被当作矫正溶液使用。首先测定一系列浓度G c A 的氲值，绘制B O D，和i 的矫正曲线(图2 曲线口)。测量样品时，根据得到的缸值，通过矫正曲线计算样品的B O D值。但是在实际样品测定中，因G G A 的组分与水样中有机物种类的差异，导致测量不准确悼1，因此限制了快速B O D 的应用。另一方面，需要在线监测的污水虽然其有机物浓度会在一定程度内波动，但总体有机物组成变化有限。因此，我们在一段时问内，从长春市第二污水处理厂不同处理阶段取来若干份水样进行B o D 测试，其信号响应出与B o D，的关系如图2 曲线6 所示。从图2 可以看出，采用G G A 溶液测得的矫正曲线口的斜率是采用水样测得的矫正曲线6 的斜率的2 倍多，这说明G G A 的组成更容易被万方数据第7 期赵利民等：快速生化需氧量微生物传感器的应用微生物所降解。因此，若以G G A 曲线计算该水样的B O D 会得到低于实际B O D，5 0 以上的测试结果。图2 曲线6 显示出样品的有机物浓度是变化的，但其微生物传感器的信号响应和B O D，是线性相关的，说明水样的有机物组成没有发生明显变化。因此，在实际水样在线监测中，采用水样的矫正曲线用于快速B O D 的计算，会得到更准确的测最结果。图3 为以上述水样曲线6 为矫正曲线，连续监测该污水处理厂初沉池污水的测量结果。从图3 可以看出，整体监测结果与B O D，值具有良好的一致性。该初沉池污水B O D 基本保持在1 2 0m g L 附近。2d 时快速测量结果和B O D，均略有偏低，这可能与当日的采样时间有一定关系。7d 时的B O D，值同样偏低，分析原冈是当日气温低，初沉池开启了加热装置并提高了曝气量所致。图3 采用快速B O D 方法(口)和B O 玩方法(6)连续监测污水处理厂污水结果比较(误差棒为3 次连续测量的标准偏差)F i g 3c o“p 秭s o ft I l ew l e w a l e rp r o l i kf i 哪am u n i c i p a lw 鹊t e w a t e rt r e a t m e n tp l a I l tm e 鹤u r e d 诵t h 叫rB o D n w(口)勰w e l l 鹅W i t l I t h ec 0 I l v e“o l l a l B o 耽(6)T h ee n l I 培惜a l t l l e 矧【a n d a l dd t H i a t i o n 80 ft l l I I，圮融l c o B 鼹i w图2G G A(口)和污水(6)的矫正曲线比较F i g 2c a l i b m 6 0 nc u r v w i t hG c A 舳l u t i 0 I l(n)粕dw a m e w a l e 腰(6)口6口B日-日口CG G A呷l e s0 0 AO2468I O1 21 1 n ，h图4 生物传感器对G G A(o)和水样(灭菌6。未灭菌c)的信号响应F i g 4s e n 鲫r 嘲p o n s e sf o rG G A(口)a n d 删呷k s(s I e r i l i z e d(6)du m t e I i l i z e d(c)哪p l 啼诵t h6 I r 峨：帅g 俩I i z e d 娜p l 鄂；：P 诧5 l e 五I i z e dp 1；口：p(0 2)=1 6 0 m L2 2 水样自降解对测量结果的影响因B 0 取分析前期准备工作较多等因素，国标规定取来的水样可在低温下保存1 2h 内分析。另外，采用微生物传感器进行B O D 测量时，需要对待测水样进行空气饱和以保证其溶解氧含量与缓冲溶液一致。但实际水样中往往含有大量的好氧微生物，因此，水样在保存及空气饱和过程中存在有机物自降解问题，导致测量结果偏低。我们采用长春市第二污水处理厂污水为水样，以高温灭菌的水样为对照，测量水样得到的i 如图4 所示。从图4 可以看出，连续测萤未灭菌的水样，测量结果逐步降低。当水样保存6h 后进行测量，其测量结果降低接近4 0。同时莺要的是，灭菌的水样及G G A 溶液在测量前后信号响应值均未发生明显变化。这说明，微生物传感器具有良好的稳定性，而水样在保存及测量前空气饱和过程中存在显著的有机物降解过程。因此，在实际应用中，若需重复测量某一水样时，需要采用加入浓酸溶液抑制微生物呼吸，并采用碱水清洗的空气进行空气饱和等方法抑制水样的自降解过程。万方数据应用化学第2 9 卷2 3 恒温装置对测量结果的影响温度影响微微生物的活性及溶解氧在水中的溶解度。标准条件下，温度每差一度，水中溶解氧相差接近0 2m g L。快速B O D 监测的行业标准中规定，为了维持微生物活性的稳定，微生物传感器需置于恒温装置中。为了获得样品与缓冲溶液一致的溶解氧含量，二者在测量开始前均需要空气饱和。因此，首先应保证二者温度的一致。对于在线仪器，样品的温度更是严重依赖于大气环境温度。实验表明，一个3 0 0m L 的4 的样品至少需要6 0m i n 才能接近室温2 0 5 下缓冲溶液的温度，而在这一过程中，样品中的有机物存在自降解，这对实验结果将造成巨大的影响。为了解决这一问题，我们首次提出采用恒温装置对样品及缓冲溶液进行恒温并空气饱和，使二者在短时间内达到一致溶解氧含量的方法“。在这一改进的实验条件下，从大气环境温度为5 的条件下取来3 种实际水样，初沉池污水、河水和湖水，进行测试，结果如表l 所示。从表l 可以看出，未加恒温装置的测量结果均比B O D，测试结果低而湖水实际水样的测试结果更出现了负值。这一结果说明未经恒温的水样经空气饱和一段时间后温度依旧低于室温下缓冲溶液的温度，进而溶解氧含量高于缓冲溶液水平，即使微生物传感器降解水样中的有机物消耗了一定程度的溶解氧，剩余的溶船氧含量依然高于缓冲溶液溶解氧含量；或因为未经恒温的水样经空气饱和一段时间后水样出现较为明显的自降解作用，导致水样中有机物浓度降低。因此，对于湖水这样低B O D 含量的水样便可能出现负的测量结果。表l 恒温装置对测量结果的影响T a b I elE f f e c to f l e n n o s t a t kd e v i o e0 nt h em 吼s u r e m e n t s 聊l t s3 结论采用混合菌B o D 鲍e d 制备微生物传感器用于B O D 的快速监测。结果表明，采用污水制作的矫正曲线在在线监测中取得了与B O D，一致的测试结果。同时，证明了样品在保存及空气饱和过程中有机物自降解会使测量结果偏低。另外，实验数据表明快速B O D 监测行业标准中要求的快速B o D 在线监测时仅对微生物传感器恒温是欠缺的，同时对样品及缓冲溶液恒温有利于样品快速接近缓冲溶液温度，减少空气饱和时间，从而提高监测效率，提升测试准确度。参考文献 1 A m e r i c 髓P u b l i cH e a I t hA s 咖i a t i o nS t a l l d a r dM 讪0 d sf o r h l I I l i r I 丑l i 佣0 fw a t e I 釉dw 邪t 删a l e r M 1 9 t I lE d W 舾h i n g t o n，D c：A m e r i c 明P I l b l i cH 划t hA s 咖i a t i o n，1 9 9 r 7 2 K 珊b e l，M a t s u n a 弘T，M 妇u d as。“耐A M i c b i a lE l e c t l o d e B O DS e n 曙 J 嚣幻姚 肋f B l i D e 增，1 9 r 7 7，1 9(1 0)：1 5 3 5 1 5 4 7 3 D s o u 砚SF M i c m b i a lB i o I l s o 瑙 J 口如卯琳弧k c 押m 2 0 0 1，1 6(6)：3 3 7-3 5 3 4 J I AJ i 蚰b 0，D O N Gs h 舯j u n 1 1 l eP r o g r e s 80 fM i c m b i a lB i o 跎n B 啪f o rB i o c h e I I l i c a lo x y 学朗D e m 蛐d J 血i 嗍，A 删C k m，2 0 0 3，3 l(6)：7 4 2 7 4 8(i nC h i n e s e)郏建波，董绍俊生化需氧量微生物传感器的研究进展 J 分析化学，2 0 0 3，3 l(6)：7 4 2 刑&5 u uJ M a t t i a s nB M i c-o b i a lB O Ds e n 娜f o r w a s t e w 砒e r A l l a l y s i s J 矾岍脓，2 0 0 2，3 6(1 5)：3 7 8 6-3 8 0 2【6 N o m u mY，c h e cCJ，k r u b e1 B i e n s 盯1 k h I l o l 0 影f o rD e t e 啪i n a l i o no fB O D J 屁砌A 眦z 劬e m 扎c ，耐，1 9 9 8，2(6)：3 3 3-3 4 0 7 P r a e t E，R e u t e r V，G a i l l a r d T，村讲B i o r e 船t 0 侣a dB i o m 啪b 珊l 髓f 曲B i o c h e I I l i c a lo】【y g e n m l m 柚dE 8 t i 咖m 佣 J 丁k 础A n 耐C 抛m 1 9 9 5，1 4(7)：3 7 l-3 7 8 8 u uJ B j 6 m s 枷L，M a t t i 粕nB I 娜I o b i l i s e dA c 虹v a t e ds l u d g eB 雠dB i 蛳脚rf o rB o DM 螂眦呲r I t J】8 妇m历k l r D n。2 0 0 0，1 4(1 2)：8 8 3-明3、9 T 蚰TC，U mEWC m a I l yl c i u e dC e l l so fC 伽P l e xM i c r o b i a lC u h u 咒f o rB i 雠n s o rM 嘲u r e m e n t0 fB O D0 fw a s l e w a t e r J&瑚胁眦加日，2 0 0 5，1 0 7(2)：5 4 6-5 5 I 万方数据第7 期赵利民等：快速生化需氧量微生物传感器的应用 1 0 D O N GS I I a o j I I l l，uB i n，w A N GB i n g q I I 锄F 曲r i c 砒i 蚰o fs e n 瑁B a s e d 叽s o l g e l()I g H n i c i 啪学l I I i cH y dM 8 t e r i a l：c N，9 7 1 1 7 2 6 6 8 P 1 9 9 9 0 3 2 4(i nc h i n e)董绍俊，李彬，王炳全溶胶一凝胶包埋酶制备生物传感器的方法：中国，9 7 1 1 7 2 6 6 8 P 1 9 9 9 0 3 j 2 4 “uB i n，K o uw e n p e n g，D o N GS h 面蛐G 枷j J l gc o y I n 盯0 fP 柚y(v i n y J a l c n M)a 蒯4 V i n d p y 莉i n eH y d m g e l鲫d l e s i z e：C N，9 6 1 2 3 5 2 7 6 P 1 9 9 8 研_ o l(i nc h i n e s e)李彬，寇文朋，董绍俊聚乙烯醇接枝4-乙烯基吡啶的制备方法：中国。9 6 1 2 3 5 2 7 6 P 1 9 9 8 研_ 0 1 1 2 k h m a 蚰M，c h“c，I J 0A，d“M e 鼬u r e m t0 fB i o d 唧d n b l es u 岫彻c e su s i I l gt h es a l t 一“e 咖tY e 鼬tA 玎【l I l BA d e h i I l i v 咖s 盯aM i c r o b i a lS e n 帅rl 眦帅b i l i z e dw 汕P o l y(c a r b a m o y l)s u 临n a 崦(P C S)P a n：A p p l i c“硼o f 吐陀N o v e lB i e n 鲥t oR e a IS 帅p l e 8 饷mC s t a l 锄dI B l 船dR e g i 加s J】彤n 卵肿威础唧m n，1 9 9 9，1 4(3)：2 9 5 3 0 2 1 3】u uc h 蛐g y u，J I AJ i 趼b o，D O N Gs h a o j 吼AB i o r l s 町T y p eB i o c h e m i c a l()x y g e nD e 删m dO I l l i 耻A r l a l y 钟r：c N，1 0 1 0 0 0 3 4 lB P 2 0 l l 瑚-2 8(i nC h i n e)刘长宇，郏建波，董绍俊一种传感器式生化需氧量在线监测仪：中国1 0 1 0 3 4 lB P 2 0 l l 明-2 8 A p p l i c a t i o no fR a p i dB i o c h e m i c a lO x y g e nD e m a n dB i o s e n s o rZ H A 0“I I l i n 4，J l AJ i a I l b 0 5，U UC h a n g”(“c 口n g c l I l 叭眦M 硎睡耐舶础o 昭嘶，C 地n g 以帆1 3 0 0 2 2，劬i 胁；6 c 舰，神姗疵姗矿却如d 仍册蠡打y，c 越嬲eA 如砂矿S c 如，蹦，c 玩咿，l1 3 0 0 2 2，C 亿船)A b 劬r a c tM u l t i p l e 喝p e c i 幅B O D s dw 幽u df o r 胁r i c a t i n gb i o c h e m i c a lo x，r g e nd e m 卸d(B O D)b i o n s o 玛f b r 瑚p j d0 1 1 l i n eB O Dd e t e 删j 刀a l i 伽哪ef 如t o r st oa e c u m c yw e 陀s t u d i e d8 u c h 嬲c a l i b r a t i o ns o l u t i 伽l e c t i，s 锄p l e n b i o d e g m d a t i o n，粕dt h e 册o s t a t i cd e“c e(捌瑚u l t sw e r eo b t a i n e dw h e nw 鹅t e w a t e rw 鹊u s e d 黯c a l i b r a t i o ns o l u t i o ni n s t e a do fd u c o 跎册dd u t i l I l i ca c i d(G G A)T h es e n b i o d 删a 血np r o c e 船m a d et h em p i dm e 黔u 陀m e n t si n a c c u m t e B e s i d e s，t I l e m o s t a t i cd e v i c eu s e do n l yf 曲b i o 辩n s o r si sd e f e c t i v e，蚰d“8 h 叫l db e 印p l i e df o rm a i n t a i l l i n gac s t a n tt e m p e r a t u 托0 f 出e 蛐p l e s 锄db u&r，p m m o t i n gd l ee m c i e n c y 粕da c c u m c yo fo r I l i n em o 西t o r i n g K e y 帅r d sb i o c h e m i c a lo x y g e nd e I I l a I I d，b i o 舱n r，t h e 册o s t a t i cd e V i c e，o n l i m，c a l i b 船t i s o l u t i o n万方数据