海博麦布结构确证.pdf

Chinese J Magn Reson,2024,41(1):43-55 第 41 卷第 1 期 2024 年 03 月 Vol.41 No.1 Mar.2024 波波 谱谱 学学 杂杂 志志 Chinese Journal of Magnetic Resonance doi:10.11938/cjmr20233065 海博麦布结构确证 徐肖杰，陈延安，李旭飞，张云才，张勇，詹冬凯，潘婷 浙江海正药业股份有限公司，浙江 台州 318000 摘 要：本文采用紫外吸收光谱、红外吸收光谱、质谱、核磁共振波谱（包含1H NMR、13C NMR、DEPT、1H-1H COSY、1H-1H NOESY、1H-13C HSQC 和1H-13C HMBC）以及单晶衍射等方法对海博麦布进行结构分析，对其所有的1H NMR 和13C NMR 谱信号进行了归属，还通过差示扫描量热法、热重分析及粉末 X-射线衍射分析对海博麦布晶型进行研究 关键词：海博麦布；核磁共振；质谱；红外吸收光谱；结构确证 中图分类号：文献标识码：A Structural Elucidation of Hybutimibe XU Xiaojie，CHEN Yanan*，LI Xufei，ZHANG Yuncai，ZHANG Yong，ZHAN Dongkai，PAN Ting Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.,LTD,Taizhou 318000,China Abstract:The structure of hybutimibe was analyzed by ultraviolet absorption spectroscopy,infrared absorption spectroscopy,mass spectrometry,nuclear magnetic resonance(1H NMR,13C NMR,DEPT,1H-1H COSY,1H-1H NOESY,1H-13C HSQC and 1H-13C HMBC)spectroscopy and single crystal diffraction.The 1H and 13C NMR signals of hybutimibe were assigned.The crystal structure of hybutimibe was studied by differential scanning calorimetry(DSC),thermogravimetric analysis(TGA)and powder X-ray diffraction(PXRD).Keywords:hybutimibe,nuclear magnetic resonance(NMR),mass spectrometry,infrared absorption spectroscopy,structural elucidation 收稿日期收稿日期:2023-04-24;在线在线发表发表日期日期:2023-08-03 基金项目基金项目:“十二五”“重大新药创制”科技重大专项项目(2013ZX09402101).通信作者通信作者(Corresponding author):*Tel:[phone],E-mail:.44 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 引 言 海博麦布是由浙江海正药业股份有限公司自主研发的 1 类新药，于 2021 年批准上市，是国内近二十年唯一获批上市的心血管 1 类新药，全球第二款胆固醇吸收抑制剂，用于治疗原发性高胆固醇血症疾病，化学名为 1-(4-氟苯基)-3(R)-3-(4-氟苯基)-4-羟基丁基-2(Z)-烯-4(S)-(4-羟基苯基)-2-氮杂环丁烷酮，分子结构如图 1 所示1目前，国内外关于海博麦布的研究主要是工艺制备、晶型和药理学1-4，完整的波谱学数据和结构解析还未见报道本文采用紫外吸收光谱（UV 光谱）、红外光谱（IR 光谱）、质谱（MS）和核磁共振波谱（NMR）等方法对海博麦布的结构进行解析，对其所有的1H 和13C NMR 信号进行详细的归属，从而提供完整的波谱数据，并通过差示扫描量热法（DSC）、热重分析（TGA）及粉末 X-射线衍射（PXRD）分析对海博麦布的晶型进行研究5-7依折麦布是全球第一个上市的胆固醇吸收抑制剂，与海博麦布结构类似，因此本文将两者的 NMR 数据进行了对比，二者结构见图 1 hybutimibe ezetimibe 图 1 海博麦布和依折麦布的化学结构 Fig.1 The chemical structure of hybutimibe and ezetimibe 1 实验部分 1.1 试剂 氘代氯仿（CDCl3,99.8 atom%D）和氘代二甲亚砜（DMSO-d6,99.8 atom%D）购自北京伊诺凯公司；甲醇（色谱纯）购自 MERCK 公司 1.2 样品制备2 以羧酸酮酯为原料，经过格氏加成，立体选择性脱水，酯基还原，羟基保护，与手性助剂缩合后再与亚胺加成，最后关环，脱保护即得，合成路径见图 2以正庚烷和乙酸乙酯为溶剂重结晶，得到纯品对纯化后的样品进行高效液相色谱（HPLC）分析，结果表明纯度为 99.95%，符合结构鉴定所需纯度将样品用丙酮溶解，放置于石油醚中扩散培养得到单晶 1.3 测定条件 UV 光谱采用 SHIMADZU UV-2401PC 紫外分光光度计获得，扫描波长范围为 190400 nm，仪器狭缝宽度为 1 nm.IR 光谱采用 Bruker VECTOR22 红外分光光度计测定，KBr 压片，波数扫描范围为 4 000400 cm1.第 1 期 45 徐肖杰等：海博麦布结构确证 图 2 海博麦布的合成路径 TsOH：对甲苯磺酸；TsNHNH2:对甲苯磺酰肼；DBU：1,8-二偶氮杂双螺环5.4.0十一-7-烯；DMAc:N,N-二甲基乙酰胺；DIPEA：N,N-二异丙基乙胺；BSA：N,O-双（三甲基硅基）乙酰胺；TBAF：四丁基氟化铵 Fig.2 Synthetic route of hybutimibe.TsOH:p-toluenesulfonic acid;TsNHNH2:p-toluenesulfonyl hydrazide;DBU:1,8-diazabicyclo 5.4.0undec-7-ene;DMAc:N,N-dimethylacetamide;DIPEA:N,N-diisopropylethylamine;BSA:N,O-bis(trimethylsilyl)acetamide;TBAF:Tetrabutylammonium fluoride MS 采用 Agilent 1260-6540QTOF 液质联用仪，ESI 源.TGA 采用 Perkin-Elmer TGA-4000 热重分析仪测定，温度范围为 30300，升温速率为 10/min.DSC 采用 NETSCH 200F3 差热分析仪测定，温度范围为30300，升温速率为 10/min.PXRD 分析采用 Rigaku D/max2200 X 射线衍射仪，电压为 40 kV，电流为 40 mA，Cu 靶，范围为 360，扫描速率为 6/min.单晶测试采用布鲁克 Smart-apex-2 单晶衍射仪，石墨单色仪，波长为 1.541 78.1H NMR、13C NMR、1H-1H COSY、1H-13C HSQC 和1H-13C HMBC 均在 Bruker Avance 400 MHz 核磁共振波谱仪上完成以 CDCl3为溶剂，1H NMR、13C NMR 的观测频率分别为 400.133 MHz 和 100.623 MHz，一维谱谱宽分别为 8 278 Hz 和 26 178 Hz.二维谱均采用标准脉冲程序采集，1H-1H COSY 的 F2（1H）和 F1（1H）维谱宽均为 6 410 Hz，采集数据点阵 t2*t1=2 048*128，累加次数 10；1H-13C HSQC 的 F2（1H）和 F1（13C）维谱宽分别为 6 410 Hz 和 26 162 Hz，采集数据点阵 t2*t1=2 048*256，累加次数 10；1H-13C HMBC的 F2（1H）和 F1（13C）维谱宽分别为 6 410 Hz 和 26 162 Hz，采集数据点阵 t2*t1=4 096*128，累加次数 40.为了验证活泼质子的存在、氟原子个数及位置和相对空间构型，另以 DMSO-d6为溶剂在 Agilent 400M DD2 核磁共振波谱仪上进行1H NMR、19F NMR 和1H-1H NOESY 实验，1H NMR 的观测频率为 399.77 MHz，谱宽为 6 410 Hz；19F NMR 的观测频率为 376.13 MHz，谱宽为 89 285.7 Hz；1H-1H NOESY 的 F2（1H）和F1（1H）维谱宽均为 4 112Hz，采集数据点阵 t2*t1=617*200，累加次数 16.46 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 2 结果与讨论 2.1 UV 光谱分析 在甲醇溶液中，海博麦布样品的最大吸收波长为 236.45 nm 和 202.95 nm，分别为苯环 B 和 E 吸收谱带 2.2 IR 光谱分析 海博麦布的 IR（cm1）：3 393（br,s），2 938（w），1 723（s），1 598（m），1 512（s），1 385（s），1 226（s），1 164（m），1 015（m），833（m）3 393 cm1强宽峰，为羟基 O-H 伸缩振动；2938 cm1为亚甲基 C-H 伸缩振动；1 723 cm1为酰胺基 C=O 伸缩振动；1 5981 512 cm1为苯环骨架伸缩振动；1 385 cm1为羟基 O-H 弯曲振动；1 226 cm1为 C-F 伸缩振动；1 1641 015 cm1为 C-O 伸缩振动；833 cm1为不饱和C-H 弯曲振动 图 3 海博麦布红外光谱图 Fig.3 IR spectrum of hybutimibe 2.3 MS 谱图分析 在正离子模式下得到 m/z=404.145 8 的离子峰为MH2O+H+的峰，m/z=422.156 7 的离子峰为M+H+的峰，m/z=444.138 5 的离子峰为M+Na+的峰，与海博麦布的元素组成 C25H21F2NO3（与理论值偏差1.09106）相符 Wavenumber/cm1100806040200Transmittance/%350030002500200015001000500第 1 期 47 徐肖杰等：海博麦布结构确证 m/z 图 4 海博麦布质谱图 Fig.4 Mass spectrum of hybutimibe 2.4 单晶结果 单晶检测结果表明本品为 Z 式，C-2 为 R 构型，C-3 为 S 构型晶胞结构见图 5 图 5 海博麦布晶胞结构 Fig.5 Cell structure of hybutimibe 2.5 晶型分析 由 TGA 和 DSC 结果（见附件材料图 S1 和 S2）可知，本品不含结晶水，熔点为 154.3（onset）由PXRD 结果（见附件材料图 S3）可知，本品为结晶性粉末 48 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 2.6 核磁共振谱图分析 2.6.1 信号归属信号归属 1H NMR（CDCl3，图 6）中共有 10 组峰，19 个氢（活泼氢未出峰，推断可能是氯仿含有的酸性杂质促进活泼氢的交换），1H NMR（DMSO-d6，图 7）中共有 11 组峰，21 个氢，与海博麦布分子结构相符.19F NMR 谱如图 8 所示，可见两个峰，分别为F 116.10 116.18 和F 118.61 118.68，对应结构中与苯环相连的两个氟 图 6 海博麦布1H NMR 谱（CDCl3）Fig.6 1H NMR spectrum of hybutimibe(CDCl3)图 7 海博麦布1H NMR 谱（DMSO-d6）Fig.7 1H NMR spectrum of hybutimibe(DMSO-d6)HH6.66.87.07.27.47.68.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.50H8.07.57.06.56.05.55.04.54.03.53.02.52.01.51.00.59.08.510.09.510.5第 1 期 49 徐肖杰等：海博麦布结构确证 图 8 海博麦布19F NMR 谱 Fig.8 19F NMR spectrum of hybutimibe 根据化学位移值的估算方法，结合 DEPT 谱（图 9）和1H-13C HSQC 谱（图 10）可推知C 59.6 为 C-7，H 4.50、4.58 为 H-71H-1H COSY 谱（图 11）表明H 2.85（2H，m）、3.25（1H，m）、4.73（1H，d，J=2.0 Hz）和 5.84（1H，t，J=8.1 Hz）为一个自旋体系，有如下关系：H 4.733.252.855.84，其中H 5.84 在1H-13C HMBC 谱（图 12）上与 C-7 远程相关，可判断为 H-5，H 2.85、3.25、4.73 则分别归属为 H-4、H-2、H-3.再根据1H-13C HSQC 谱，H 2.85、3.25、4.73 分别与C 26.9、59.9、60.3 直接相连，可确定C 26.9、59.9、60.3 分别为 C-4、C-2、C-31H-1H COSY 谱表明，H 6.84（2H，d，J=8.4 Hz）和H 7.18（2H，d，J=8.4 Hz）相关，H 6.92（2H，t，J=8.6 Hz）和H 7.26（2H，dd，J=4.6/8.9 Hz）相关，H 6.98（2H，t，J=8.6 Hz）和H 7.38（2H，dd，J=5.5/8.5 Hz）相关，对应 3 个对位取代苯环上的 3 组氢，因为有 2 个苯环上对位取代为氟原子，受氟原子的耦合产生不同的峰形，所以结合峰形，可以推知H 6.84 和H 7.18 为对羟基苯的氢根 图 9 海博麦布 DEPT-135（上）和13C NMR（下）谱 Fig.9 DEPT-135(top)and 13C NMR(bottom)spectrum of hybutimibe F10811211612012410 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 2001003020FC160150170130120140100901107060804030501002050 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 图 10 海博麦布的1H-13C HSQC 谱 Fig.10 1H-13C HSQC spectrum of hybutimibe 图 11 海博麦布1H-1H COSY 谱 Fig.11 1H-1H COSY spectrum of hybutimibe HCHH第 1 期 51 徐肖杰等：海博麦布结构确证 图 12 海博麦布的1H-13C HMBC 谱(a)及其局部放大谱(b)Fig.12 1H-13C HMBC spectrum(a)and partial enlarged spectrum(b)of hybutimibe HC(a)HC(b)52 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 据1H-13C HSQC 谱可知，H 6.84 与C 116.2 相连，H 7.18 与C 127.4 相连，再根据1H-13C HMBC 谱，C 116.2与H 6.84 远程相关，C 127.4 与H 7.18 和H 4.73 远程相关，可以推知H 6.84 为 H-16、H-18，C 116.2 为C-16、C-18，H 7.18 为 H-15、H-19，C 127.4 为 C-15、C-19对氟苯基上 2 组氢的归属则需要对其季碳归属后再确定根据耦合常数和1H-13C HMBC 谱，C 137.0（d，J=4 Hz）与 H-7 和 H-5 远程相关，可以推知其为 C-8，那C 133.6（d，J=2 Hz）则可确定为 C-20由1H-13C HMBC 谱可知，C-8 还与H 6.98 相关，结合H 6.98（2H，t，J=8.6 Hz）的峰形和耦合常数，可以推知其为 H-10、H-12，H 7.38（2H，dd，J=5.5/8.5 Hz）则为 H-9、H-13，同理可以推知H 6.92（2H，t，J=8.6 Hz）和H 7.26（2H，dd，J=4.6/8.9 Hz）分别为 H-22、H-24 和 H-21、H-25 根据氟对相邻苯环上碳原子耦合常数约为 250 Hz，可以确定C 159.2（d，J=243 Hz）、162.3（d，J=245 Hz）为与氟直接相连碳原子，再根据 HMBC 谱，C 159.2 与 H-22、H-24、H-21、H-25 远程相关，C 162.3 与 H-10、H-12、H-9、H-13 远程相关，可以确定为C 159.2 为 C-23，C 162.3 为 C-11根据化学位移和 HMBC 谱，C 167.8 与 H-2、H-3、H-4 相关，可以确定为 C-1；C 156.3 与 H-15、H-19、H-16、H-18 相关，可以确定为 C-17；C 141.2 与 H-4、H-5、H-7 相关，可以确定为 C-6；C 128.8 与 H-2、H-16、H-18 相关，可以确定为 C-14 1H-1H NOESY（图 13）中，H-4 与 H-7 相关，H-5 与 H-9、H-13 相关，推断双键为 Z 式H-3 的耦合常数为 2.4 Hz，非对映异构体中 H-3 的耦合常数为 5.5 Hz，与 H-2 和 H-3 二面角大小（海博麦布为 136.7，非对映异构体为 5.9）相符 图 13 海博麦布1H-1H NOESY 谱 Fig.13 1H-1H NOESY spectrum of hybutimibe HH第 1 期 53 徐肖杰等：海博麦布结构确证 综上，可以对海博麦布进行 NMR 信号归属，具体见表 1.表表 1 海博麦布样品的海博麦布样品的 NMR 信号信号归属归属*Table 1 Assignment of NMR data of hybutimibe*Assignment C DEPT HMBC H H(DMSO-d6)COSY NOESY(DMSO-d6)4 26.9 CH2 3.25(H2),4.73(H3),5.84(H5)2.85(m,2H)2.75(m,2H)3.25(H2),5.84(H5)3.20(H2),4.36(H7),4.90(H3),5.77(H5)7 59.6 CH2 5.84(H5)4.50,4.58(d,J=12.4 Hz,2H)4.36(d,J=5.3 Hz,2H)4.84(OH,t,J=5.3 Hz,1H)/2.75(H4),7.38(H9,H13)2 59.9 CH 4.73(H3),5.84(H5)3.25(m,1H)3.20(m,1H)2.85(H4),4.73(H3)2.75(H4)3 60.3 CH 2.85(H4),3.25(H2),7.18(H15,H19)4.73(d,J=2.0 Hz,1H)4.90(d,J=2.4 Hz,1H)3.25(H2)2.75(H4),7.19(H15,H19)10,12 115.3(d,J=22 Hz)CH 6.98(H10,H12),7.38(H9,H13)6.98(t,J=8.7 Hz,2H)7.12(m,2H)7.38(H9,H13)/22,24 115.9(d,J=23 Hz)CH 6.92(H22,H24)6.92(t,J=8.6 Hz,2H)7.12(m,2H)7.26(H21,H25)/16,18 116.2 CH 6.84(H16,H18)6.84(d,J=8.4 Hz,2H)6.70(d,J=8.6 Hz,1H)7.18(H15,H19)/21,25 118.7(d,J=8Hz)CH 7.26(H21,H25)7.26(dd,J=4.6/8.9 Hz,2H)7.19(m,2H)6.92(H22,H24)/5 126.1 CH 2.85(H4),3.25(H2),4.50(H7),4.58(H7)5.84(t,J=8.1 Hz,1H)5.77(t,J=7.7 Hz,1H)2.85(H4)7.38(H9,H13)15,19 127.4 CH 4.73(H3),7.18(H15,H19)7.18(d,J=8.4 Hz,2H)7.19(m,2H)6.84(H16,H18)4.90(H3)9,13 128.1(d,J=8Hz)CH 7.38(H9,H13)7.38(dd,J=5.5,8.5 Hz,2H)7.38(m,2H)6.98(H10,H12)4.36(H7),5.77(H5)14 128.8 C 3.25(H2),6.84(H16,H18)/20 133.6(d,J=2Hz)C 6.92(H22,H24),7.26(H21,H25)/8 137.0(d,J=4Hz)C 4.50(H7),4.58(H7),5.84(H5),6.98(H10,H12)/6 141.2 C 2.85(H4),4.50(H7),4.58(H7),5.84(H5),7.38(H10,H12)/17 156.3 C 6.84(H16,H18),7.18(H15,H19)/9.48(OH,s,1H)/6.70(H16,H18)23 159.2(d,J=243Hz)C 6.92(H22,H24),7.26(H21,H25)/11 162.3(d,J=245Hz)C 6.98(H10,H12),7.38(H9,H13)/1 167.8 C 2.85(H4),3.25(H2),4.73(H3)/*：除括号内特别标注，其余实验数据均以 CDCl3为溶剂.54 波 谱 学 杂 志 第 41 卷 2.6.2 与依折麦布与依折麦布 NMR 数据对比数据对比 海博麦布和依折麦布（结构见图 1）结构区别主要在海博麦布 5、6 号位变为双键，6 号位的羟基变为羟甲基，体现在 NMR 图谱上是多了一个连羟基的仲碳（C 59.6,H 4.50,4.58），5 号位由一个饱和仲碳（C 36.36,H 1.73）变为不饱和叔碳（C 126.1,H 5.84），6 号位由连羟基的饱和叔碳（C 71.05,H 4.50）变为不饱和季碳（C 141.2），8 号位季碳因为苯环与 5、6 号位双键形成共轭，化学位移向高场移动（C 142.19 vs.137.0），4 号位氢受相邻双键影响向低场移动（H 1.73,1.83 vs.2.85）具体数据见表 2 表表 2 海博麦布海博麦布和依折麦布和依折麦布8NMR 数据比较数据比较（溶剂均为（溶剂均为 CDCl3）Table 2 Comparison of NMR data of hybutimibe and ezetimibe8 in CDCl3 Assignment C H hybutimibe ezetimibe hybutimibe ezetimibe 4 26.9(CH2)24.50(CH2)2.85(m,2H)1.73,1.83 7 59.6(CH2)/4.50,4.58(d,J=12.4 Hz,2H)2 59.9(CH)59.40(CH)3.25(m,1H)3.09 3 60.3(CH)59.58(CH)4.73(d,J=2.0 Hz,1H)4.81 10,12 115.3(CH,22)114.64(CH,21.0)6.98(t,J=8.7 Hz,2H)7.11 22,24 115.9(CH,23)115.79(CH,22.5)6.92(t,J=8.6 Hz,2H)7.13 16,18 116.2(CH)115.71(CH)6.84(d,J=8.4 Hz,2H)6.76 21,25 118.7(CH,8)118.22(CH,8.0)7.26(dd,J=4.6/8.9 Hz,2H)7.22 5 126.1(CH)36.36(CH2)5.84(t,J=8.1 Hz,1H)1.73 15,19 127.4(CH)127.52(CH)7.18(d,J=8.4 Hz,2H)7.18 9,13 128.1(CH,8)127.50(CH,9.0)7.38(dd,J=5.5/8.5 Hz,2H)7.32 14 128.8(C)127.88(C)/20 133.6(C,2)133.98(C,2.3)/8 137.0(C,4)142.19(C,2.9)/6 141.2(C)71.05(CH)/4.50 17 156.3(C)157.42(C)/1.73,1.83 23 159.2(C,243)157.05,158.96(C,240.2)/11 162.3(C,245)160.06,161.98(C,241.5)/3.09 1 167.8(C)167.33(C)/4.81 3 结论 本文通过 IR 光谱、UV 光谱、MS 和 NMR 波谱等方法对海博麦布的结构进行了全面的分析，IR 图谱表明样品分子结构中含有羟基、亚甲基、酰胺基、苯环、氟等基团；UV 图谱表明样品分子结构中含有苯环；高分辨 MS 推测分子式与海博麦布分子式相符，NMR 氢谱、碳谱及二维谱等均与结构相符 通过 DSC、TGA 和 PXRD 分析，确证了海博麦布不含结晶水，为结晶性粉末 利益冲突 无 第 1 期 55 徐肖杰等：海博麦布结构确证 附件材料（可在波谱学杂志期刊官网 http:/ 获取）图 S1 海博麦布 TGA 图 图 S2 海博麦布 DSC 图 图 S3 海博麦布 PXRD 图 参考文献：1 浙江海正药业股份有限公司.氮杂环丁酮类化合物及医药应用:中国,CN201080035472P.2012-05-19 2 浙江海正药业股份有限公司.氮杂环丁酮类化合物制备方法及其中间体:中国,201410251262.5P.2016-02-03 3 浙江海正药业股份有限公司.氮杂环丁烷酮化合物的晶型及其制备方法:PCT,WO2014036956P.2015-06-05 4 浙江海正药业股份有限公司.用于预防和/或治疗丙型肝炎的氮杂环丁酮化合物及其组合物:CN201480002991.5P.2015-07-15 5 ZHAO R S,YANG R F,YUN L H,et al.Spectroscopic data derived structure of lafutidineJ.Chinese J Magn Reson,2006,23(3):313-319.赵如胜,杨日芳,恽榴红,等.拉呋替丁的波谱学数据和结构确证J.波谱学杂志,2006,23(3):313-319.6 ZHAO X Y,HAN D,LUO H J,et al.Spectroscopic studies of delafloxacin meglumineJ.Chinese J Magn Reson,2021,38(2):268-276.赵心怡,韩冬,罗红军,等.德拉沙星葡甲胺波谱学数据解析J.波谱学杂志,2021,38(2):268-276.7 宁永成.有机化合物结构鉴定与有机波谱学(第二版)M.北京:科学出版社,2000.8 KATARZYNA F,KRZYSZTOF B,KATARZYNA S,et al.Physicochemical characterization of ezetimibe and its impuritiesJ.J Mol Struct,2011,991(1-3):162-170.9 浙江海正药业股份有限公司.海泽麦布中间体及其制备方法:PCT,WO2022262768P.2022-06-15.