大黄鱼FcRs基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析.pdf

第 卷 第 期应 用 海 洋 学 学 报，年 月 ，大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析杨玉生，程安怡，张亚萌，崔正伟，陈新华 收稿日期：资助项目：福州海洋研究院基金（）；国家自然科学基金（）作者简介：杨玉生（），男，硕士研究生；：通讯作者：陈新华（），男，教授；：（福建农林大学海洋学院、福建省海洋生物技术重点实验室，福建 福州）摘要：受体（，）是一类与免疫球蛋白的 段特异性结合，介导多种免疫反应的受体分子。本研究克隆得到了大黄鱼（）个 基因，分别是、和，其开放阅读框（）大小分别为 、。大黄鱼的 个 都具有一个信号肽和 个免疫球蛋白（）结构域，、和 还包含一个跨膜区。实时荧光定量 结果显示、和 主要在鳃或肠等黏膜组织中表达，而 和 主要在脾和头肾等系统免疫组织中表达；革兰氏阴性细菌细胞壁脂多糖（）刺激后，这 个 基因头肾和脾脏中的表达在不同时间出现了显著上调；双链 病毒类似物（：）刺激后，个 在头肾和脾脏中的表达出现不同程度的上调，而 在脾脏中的表达显著上调，在头肾中则明显下调，提示大黄鱼 可能在 和（：）诱导的免疫反应中起着重要但又不同的作用。关键词：海洋生物学；大黄鱼；免疫球蛋白；分子克隆：中图分类号：文献标识码：文章编号：（）受体（，）是一类能够特异性识别免疫球蛋白（，）结构域的分子，属于免疫球蛋白超家族（，）成员，在免疫系统中起着极其关键的作用。在各种免疫细胞包括肥大细胞、单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、嗜中性粒细胞和 淋巴细胞均有表达。同时，也以可溶性蛋白形式存在于体液中参与免疫应答的调节。通常，细胞膜上的 与 分子重链上的 结构域相互作用，引起多种免疫反应，如调控吞噬效应、清除免疫复合物、抗体分泌、肥大细胞脱颗粒、抗原呈递、介导抗体依赖的细胞毒作用（，）、介导免疫抑制、释放炎性细胞因子和活性氧等。人和小鼠中，经典的 包括、和，它们分别为、和 的受体。这些经典的 主要位于免疫细胞表面，与抗原抗体复合物结合后介导多种免疫应答，其中 又可根据与 亲和力的高低分为高亲和力的（、和），以及低亲和力的（、和）与（和），。除了传统的 外，在哺乳动物中还发现一些新的 家族成员，包括初生（，）、样分子（，）和多聚免疫球蛋白受体（，）。分子是一类新发现的 家族成员，在人体中，包含六个跨膜受体（）和两种胞内受体（和），主要表达于 细胞。在鸟类和两栖类中也相继发现与哺乳动物 家族基因序列和功能相似的。在硬骨鱼中，自从鲤（）中首次发现与小鼠 期杨玉生，等：大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析 序列相似的 后，相继在斑点叉尾鮰（）、牙鲆（）、斑 马 鱼（）、虹 鳟（）等硬骨鱼中发现了经典的 和 的同源基因。斑点叉尾鮰自然杀伤细胞（，）表面存在的 可与 结合并介导 作用。牙鲆 能够促进 细胞的吞噬和杀菌功能。由于鱼类免疫球蛋白与哺乳动物差异较大，鱼类 的功能与哺乳动物也就存在较大的不同，虽然部分 已在不同鱼类中报道，但其功能尚待进一步研究。大黄鱼（）作为我国重要的海水经济鱼类，其养殖产量在逐年增加，然而伴随而来的是各种细菌性和病毒性疾病的频繁爆发，致使大黄鱼养殖业遭受巨大损失，严重制约了大黄鱼养殖业的持续健康发展。近年来，针对大黄鱼免疫的相关研究愈加受到关注。大黄鱼免疫球蛋白 和 的研究已有报道，但是有关大黄鱼的 的研究尚未见报道。在本研究中，我们克隆鉴定了大黄鱼中 种 家族成员，并分析了它们在健康大黄鱼各组织，以及 和（：）刺激后在脾脏和头肾中的表达变化，为更好地理解大黄鱼 的免疫功能奠定基础。材料与方法 实验材料大黄鱼购自福建省宁德市富发水产有限公司，每条大黄鱼体重 。大黄鱼于 水温下适应性养殖一周后用于实验。基因克隆根据美国国家生物技术信息中心（，；：）上公 布 的 大 黄 鱼 基 因 组（登 录 号 为）预测信息，筛选得到 个大黄鱼 受体，分别为、和。根据大黄鱼 受体 序列设计引物（表），以大黄鱼头肾和脾脏 作为模板扩增各 受体的开放阅读框（），程序如下：；，共 个循环；并在 下延伸 。产物经 琼脂糖凝胶电泳检测目的条带，胶回收将其连接至 载体中，转化 感受态细胞，阳性克隆由上海生工测序验证。生物信息学分析利用 进行信号肽预测（：），核酸及氨基酸序列比对使用 在线程序（：）。使 用 在 线 程 序（：）预测蛋白功能结构域，结果通过 软件展示。系统进化树通过使用核苷酸替换的 模型，在最大似然法（）框架下通过 对蛋白质氨基酸全序列进行分析，自举置换 次验证各分支的置信度。表 文中所用引物序列 引物名称引物序列（）用途 分子克隆 应 用 海 洋 学 学 报 卷续表引物名称引物序列（）用途实时荧光定量 在健康大黄鱼各组织中的表达取 条健康的大黄鱼，麻醉后取脑、鳃、头肾、心脏、脾脏、肝脏、胃、肠、肌肉、皮肤和血液等 个组织，使用 总 提取试剂 盒（，上 海）提 取 总，并 使 用 试剂盒（，上海）将其反转 为。通 过 实 时 荧 光 定 量 （）检测 在大黄鱼各个组织中的相对表达量，引 物 见 表，反 应 体 系 和 程 序 同 文 献一致。各基因相对表达水平采用 法计算。在 和（：）后大黄鱼脾脏和头肾中的免疫应答随机取 尾健康的大黄鱼分 组，每组各 尾，分别以腹腔注射的方式注射 无菌（对 照 组）、（）和（：）（），注射后于、各取 尾鱼，分离头肾和脾脏组织，按照“”中提到的方法检测 在不同时间点的表达水平变化，检验对数据进行统计分析（为显著差异，为极显著差异）。结果与讨论 序列分析本研究中 个大黄鱼 基因分别命名为、和，其大小分别为 、，分别编码、和 个氨基酸（表）。大黄鱼 一般包含一个信号肽、个 结构域和一个跨膜区，在结构域上与人体中 比较相似，但也存在一定的差异。和人体中 不同，和 缺乏跨膜区，具有 个 结构域（图）。大黄鱼 个 分别位于 和 号染色体，人同源 基因分布在 号染色体上。而在小鼠、热带爪蟾（）以及硬骨鱼中这些基因分布在 条或更多的染色体上。此外，在多种硬骨鱼中发现 存在多个拷贝并分布于不同的染色体上（图）。系统进化树 显 示 、与其他硬骨鱼 归为一个分支，与人 亲缘关系较近。与黄 期杨玉生，等：大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析 鳍棘鲷（）、虹鳟 聚为一簇。硬骨鱼 均与哺乳动物 亲缘关系较远（图）。表 大黄鱼 分子特征 基因名称序列全长 编码氨基酸数量 个 登录号预测分子量 预测等电点 图 人和大黄鱼 的功能结构域分析 各物种 的 登录号：人（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、大黄鱼（）、（）、（）、（）、（）、（）。应 用 海 洋 学 学 报 卷图 脊椎动物 的染色体定位 在 数据库中查询了大黄鱼和其他脊椎动物物种的 的染色体位点，核苷酸序列长度和染色体位点信息用于确定和计算不同基因的大小和基因之间的距离，用于绘制染色体区域的比例图。图中使用的 序列的 序列号：人（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、小鼠（）、（）、（）、（）、（）、热带爪蟾（）、（）（）、（）、斑点叉尾（）、（）、红鳍东方鲀 （）、（）、（）、（）、（）、（）、斑马鱼 （）、（）、（）、（）、（）虹鳟（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、大黄鱼（）、（）、（）、（）、（）、（）。组织表达分析本研究中的 个 在大黄鱼 个组织中表达较为广泛（图）。其中 在大黄鱼肠中的表达远高于在其他组织中，但在心、肝和肌肉中没有检测到其表达。在鳃中的表达水平最高，在脾、头肾和脑中中等表达，在肠和肌肉中表达量较低。在鳃中表达量最高，在肌肉、心和肠中表达量较低。在肠中的表达远高于在其他组织中，在肌肉、皮肤和心中表达量较低。在头肾和脾脏中表达量较高，而在肌肉表达量最低。主要表达于头肾和脾脏中，在肠和胃中表达较低。和（：）刺激大黄鱼后 表达分析 刺激后，、和 等 在头肾 期杨玉生，等：大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析 图 大黄鱼和其他物种 的系统进化树分析 图中使用的 序列的 登录号：人（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）；小鼠（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、牛（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、热带爪蟾（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、斑点叉尾（）、（）、虹鳟（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、鲤鱼（）、（）、黄鳍棘鲷（）、（）、（）、眼斑双锯鱼（）、（）、（）、（）、（）、大黄鱼（）、（）、（）、（）、（）、（）。和脾脏中的表达均有显著上调（图）。刺激后，、和 在脾脏中的转录水平均呈现先上调后下降再上调的趋势，分别在、表达量最高，上调倍数分 应 用 海 洋 学 学 报 卷图 大黄鱼 的组织表达分析 别为 、和 。而 和在脾脏中的转录水平则呈现先上调下降的趋势，都在 达到峰值，上调倍数分别为 和。、和 在头肾中的表达则先下调再上调，在 达到峰值，上调倍数分别为、和 和。在 达到峰值，为。在 达到峰值，上调倍数为。图 刺激下大黄鱼脾脏和头肾中 表达变化 检测分析脾和头肾中 的表达，为内参基因；“”表示，“”表示，下同。（：）刺 激 后，在 脾 脏 中，、和 的转录水平均先上调，随后出现下降，之后再次上调，而 和 的表达在、出现上调，随后恢复到正常水平（图）。在头肾中，、和 的表达水平先出现增加，随后下降，之后再增加；和 的表达在、显著下调，但在 显著上调，而 期杨玉生，等：大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析 的表达在、则显著下调。图 （：）刺激下大黄鱼脾脏和头肾中 表达变化 （：）讨论 基因序列及进化分析 是免疫系统的重要组成部分，通过与不同的免疫球蛋白结合来介导多种免疫效应。与 在硬骨鱼至哺乳动物等脊椎动物都有发现，而在软骨鱼则缺少相应的同源基因，这意味着 的首次进化过程可能出现在硬骨鱼中，。相比之下，受体仅在胎盘哺乳动物中发现。和 受体首先在单孔目动物中观察到，例如鸭嘴兽（）。仅在有袋动物和胎盘哺乳动物中发现了 和 的可明确识别的经典受体，这表明 第二次演化可能发生在相对较晚早期哺乳动物中。其中，在哺乳动物中大部分经典的 受体可能是从 基因座的 分子发展而来的。虽然硬骨鱼尚未发现存在，但与 特异性结合的 已在多种鱼类中报道，比如在牙鲆中报道的膜型，虹鳟和香鱼（）中报道的分泌型，。本研究从大黄鱼基因组数据库中检索并克隆出 个 的 亚基，分别是、和。和 包含有跨膜区和胞内区，是膜型，且 胞内段含有一个免疫受体酪氨酸抑制基序（，），与人 结构相似。而 和 没有跨膜区和胞内区，属于分泌型。膜型 结合抗体复合物后将信号传递给 亚基介导多种免疫反应，分泌型 可以阻遏抗 体 复 合 物 与 膜 型 的结合，下调 细胞的增殖和抗体分泌。作为一类新发现的 受体家族成员，其在鱼类中也有报道。在牙鲆中发现 个 分子，它们包含 个 结构域。在本研究中，我们克隆了两个 基因，分别是 和。与哺乳动物不同，多种硬骨鱼 被发现存在多个拷贝，而在本研究中我们只克隆了一个 基因，至于大黄鱼中是否存在多个 尚需进一步研究。与人 不同的是，本研究克隆的 包含 个 结构域，而人 包含 个 结构域。此外，我们还克隆了，其结构和人 相似，包含两个 结构域，无跨膜区，是一种胞内。系统进化树分析发现硬骨鱼的 与哺乳动物亲缘关系较远。其中，大黄鱼 个传统 与 可聚为一支，与人 亲缘关系稍近。而大黄鱼 与黄鳍棘鲷 以及虹鳟 则单独聚为的一簇。两栖类的非洲爪蟾形成一个独立的分支，这与之前的报道一致。应 用 海 洋 学 学 报 卷 组织分布表达及诱导表达分析大黄鱼 个 基因在各组织中的表达有较大差异，和 在肠中表达最高，而 和 则在鳃中表达最高，在肠中的表达较低，这暗示不同的 可能在不同的黏膜组织中发挥功能。分泌型的 在头肾中也有较高水平的表达，但在脾中的表达较低，而 在头肾和脾中的表达水平都比较低。在香鱼中，分泌型 在鳃中的表达最高，而在脾脏中较低，与 的表达模式较为一致。而在虹鳟中的研究则有很大不同，其分泌型 主要在脾和头肾中表达，而在鳃和肠等黏膜组织中表达较低。这些结果表明，鱼类中不同的 可能具有不同的功能，因此其表达模式具有较大差异。和 主要在 细胞分布较多的头肾和脾中表达，这与哺乳动物相似。牙鲆中的 个 分子同样在头肾和脾中表达最高，这预示着硬骨鱼 与哺乳动物可能具有保守的结构和功能。在虹鳟中，和（：）刺激后，显著上调了虹鳟 在头肾中的表达水平，且均在 达到峰值。迟缓爱德华氏菌（）刺激牙鲆后，牙鲆 的表达水平在 内表现出上升后下调再上升的趋势，在 达到峰值。这些研究的结果预示着 可能参与了硬骨鱼免疫的初期应答。本研究的 个大黄鱼 在刺激后，多数在 内已表现出显著的表达上调甚至达到峰值。其中，、和 在 和（：）刺激后在头肾和脾脏中均表现出较为相似的趋势。在 刺激后在脾脏表达水平较高，而在（：）刺激后在头肾中表达水平较高，且峰值均在 后达到。脾脏中 和 在 和（：）刺激下均有显著上调，而在头肾中，（：）刺激后 的表达被抑制，在 刺激后的表达先被抑制后发生上调。在我们早期的转录组结果中显示，大黄鱼在溶藻弧菌（）感染后，头肾中的 的表达水平受到了显著的抑制。这与本研究结果类似，刺激后大黄鱼头肾中 仅在 有上调，其他时间被显著抑制或无显著性变化。大黄鱼不同的 在 和（：）刺激下表现出不同的应答模式，意味着它们在 和（：）诱导的大黄鱼免疫反应中发挥重要作用，但其功能则可能有所不同。结论本研究克隆鉴定了大黄鱼经典 和 两类受体中的 个基因，发现它们与人类相应 的序列结构具有较高的相似性。荧光定量 分析了它们在不同组织中的表达水平，结果显示它们在不同免疫组织中的表达水平存在明显差异，表明它们在不同组织中发挥的功能可能有所差异；用 和（：）分别模拟细菌和病毒刺激大黄鱼后，在脾脏和头肾组织中的表达均发生上调，这表明大黄鱼 参与了 和（：）诱导的免疫反应。本研究为进一步了解硬骨鱼 的分类以及免疫功能奠定了基础。参考文献：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，：，期杨玉生，等：大黄鱼 基因的克隆及其在免疫应答中的初步功能分析，（）：，（）：，：（），：，（）：，（）：，（），（）：，（），（）：，（），：，（）：王鹏，张弩，张旭杰，等 虹鳟 受体 的 和 亚基基因的克隆及表达分析 水生生物学报，（）：，（），（）：，（），：，（）：，（），：，（），：，（），（）：，（）：，（）（），：，（）：，：，：，（）：，（）：程安怡，王永阳，翁华松，等 转录组分析揭示溶藻弧菌感染早期大黄鱼的免疫应答特征 水生生物学报，（）：，（），（）：（），（，）：（）应 用 海 洋 学 学 报 卷 ，（），（：），（：）：；：（：）（责任编辑：杜俊民）