过表达BIRC5基因对氧糖剥夺_复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响.pdf

本文引文格式:黄建敏,陈海燕,云艳芳,等.过表达B I R C5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及V E G F表达的影响J.右江民族医学院学报,2 0 2 4,4 6(1):1-6,1 2.【论著与临床报道】过表达B I R C5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及V E G F表达的影响黄建敏,陈海燕,云艳芳,杨桂新,蒋勇明,李晓岚,韦宝莹,周莹杰,彭立志,莫芬,李雪斌(右江民族医学院附属医院神经内科,广西 百色 5 3 3 0 0 0)摘 要:目的 探讨过表达B I R C5基因对氧糖剥夺/复氧(OG D/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法 将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养2 4h,随后OG D 3 h/R 3 h损伤细胞)、B I R C 5干预组(细胞预先转染腺病毒-B I R C 5质粒并培养2 4h,随后OG D 3 h/R 3 h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养2 4h,随后OG D 3 h/R 3 h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MT T法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用R T-P C R和免疫印迹法分别检测各组细胞B I R C5和V E G FmR NA及蛋白表达。结果 正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;B I R C 5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达B I R C5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、B I R C 5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P0.0 5);与细胞损伤组相比,B I R C 5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P0.0 5)。与正常对照组相比,细胞损伤组、B I R C 5干预组和阴性对照组的B I R C5和V E G F的mR NA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P0.0 5);与细胞损伤组相比,B I R C 5干预组细胞B I R C5和V E G F的mR NA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P0.0 5)。结论 过表达B I R C5基因对OG D/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调V E G F表达有关,提示B I R C 5调控V E G F表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。关键词:过表达B I R C5基因;脑微血管内皮细胞;存活;凋亡;氧糖剥夺/复氧;血管内皮生长因子中图分类号:R 7 4 3 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 1-5 8 1 7(2 0 2 4)0 1-0 0 0 1-0 7d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-5 8 1 7.2 0 2 4.0 1.0 0 1E f f e c t o fo v e r-e x p r e s s i o no fB I R C5g e n eo nt h ea c t i v i t ya n dV E G Fe x p r e s s i o no f c e r e b r a lm i c r o v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s i n d u c e db yo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n/r e o x y g e n a t i o nH u a n gJ i a n m i n,C h e nh a i y a n,Y u nY a n f a n g,Y a n gG u i x i n,J i a n gY o n g m i n g,L iX i a o l a n,W e iB a o y i n g,Z h o uY i n g j i e,P e n gL i z h i,M oF e n,L iX u e b i n(D e p a r t m e n t o fN e u r o l o g y,T h eA f f i l i a t e dH o s p i t a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yF o rN a t i o n a l i t i e s,B a i s e5 3 3 0 0 0,G u a n g x i,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t e t h ep r o t e c t i v ee f f e c to fo v e r-e x p r e s s i o no fB I R C5g e n eo nm i c r o v a s-c u l a re n d o t h e l i a lc e l l i n j u r yi n d u c e db yo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n/r e o x y g e n a t i o n(OG D/R)i nm o u s eb r a i n,a n dt oa n a l y z e i t sp o s s i b l em e c h a n i s m.M e t h o d s A c c o r d i n gt od i f f e r e n t i n t e r v e n t i o nm e t h o d s,m o u s eb r a i nm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a l c e l l sw e r ed i v i d e d i n t on o r m a l c o n t r o l g r o u p(n o r m a l c e l l c u l t u r e),c e l l d a m a g eg r o u p1第4 6卷 第1期 右江民族医学院学报 V o l.4 6N o.12 0 2 4年2月 J o u r n a l o fY o u j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t yf o rN a t i o n a l i t i e s F e b.2 0 2 4基金项目:国家自然科学基金项目(8 1 8 6 0 2 2 6)第一作者:黄建敏,博士,主任医师,硕士研究生导师,研究方向:缺血性脑卒中发病机制及治疗学研究,E-m a i l:b s h u a n g j i a n m i n1 2 6.c o m 通讯作者:李雪斌,博士,教授,博士/硕士研究生导师,研究方向:卒中后抑郁发病机制研究,E-m a i l:y y f y l x b 1 6 3.c o m(n o r m a l c e l l c u l t u r e f o r 2 4h o u r s,f o l l o w e db yOG D 3 h/R 3 h i n j u r y),B I R C 5 i n t e r v e n t i o ng r o u p(T h e c e l l sw e r et r a n s f e c t e dw i t hB I R C 5p l a s m i d so f a d e n o v i r u s a n dc u l t u r e d f o r 2 4h o u r s a n d t h e nu n d e r w e n tOG Df o r 3h o u r s/Rf o r3h o u r s.)a n dn e g a t i v ec o n t r o l g r o u p(T h ec e l l sw e r e t r a n s f e c t e dw i t he m p t yp l a s m i d so f a d e n o v i r u sa n dc u l t u r e df o r2 4h o u r sa n dt h e nu n d e r w e n tOG Df o r3h o u r s/Rf o r3h o u r s.).L a s e rc o n f o c a lm i c r o s c o p ew a su s e dt oo b s e r v e t h em o r p h o l o g i c a l c h a n g e so f c e l l s i ne a c hg r o u p.T h e c e l l s u r v i v a l r a t e a n da p o p t o s i s r a t ew e r ed e t e c t e db yMT Ta n df l o wc y t o m e t r y,r e s p e c t i v e l y.T h emR NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n so fB I R C5a n dV E G Fw e r ed e t e c t e db yR T-P C Ra n d W e s t e r nb l o t,r e s p e c t i v e l y.R e s u l t s T h ec y t o s k e l e t a lm i c r o f i l a m e n t so ft h en o r m a l c o n t r o l g r o u pw e r e c o n n e c t e dw i t he a c ho t h e r a n d r e g u l a r l yd i s t r i b u t e d i na no r d e r l yn e t w o r k.I n t h e i n-j u r yg r o u pa n dn e g a t i v ec o n t r o l g r o u p,t h em i c r o f i l a m e n t so f t h ec e l l sw e r eb r o k e n,a n dt h ec o n t r a c t i o no f t h ec e l l sb e c a m es h o r t e ro rm o v e d t o t h ep e r i p h e r y;t h em i c r o f i l a m e n t sw e r e a r r a n g e d i nad i s o r d e r e dn e t w o r k;t h ec e l l a p p e a r a n c ew a ss h r u n k,t h eg a pe n l a r g e da n das m a l ln u m b e ro fm i c r o f i l a m e n t sm i s s i n gw i t hg a p s;I nt h eB I R C 5 i n t e r v e n t i o ng r o u p,t h em i c r o f i l a m e n t so fc e l l sw e r ec o n n e c t e d,s p i n d l es h a p e dw i t hr e g u l a ra r r a n g e-m e n t a n dr e d u c e dg a pb e t w e e nc e l l s,i n d i c a t i n gt h a t t h eo v e r e x p r e s s i o no fB I R C5g e n ec o u l dr e d u c e t h ed i s o r-d e ro f c y t o s k e l e t a lm i c r o f i l a m e n t so f d a m a g e dc e l l s.C o m p a r e dw i t ht h en o r m a l c o n t r o l g r o u p,t h e c e l l d a m a g eg r o u p,t h eB I R C 5i n t e r v e n t i o ng r o u pa n dt h en e g a t i v ec o n t r o lg r o u ph a ds i g n i f i c a n t l yr e d u c e dc e l ls u r v i v a lr a t e s,b u th a ds i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e da p o p t o s i sr a t e s,s h o w i n gs i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s(P0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h o s eo f t h e c e l l d a m a g eg r o u p,t h e c e l l s u r v i v a l r a t eo f t h eB I R C 5 i n t e r v e n t i o ng r o u pw a s s i g n i f i c a n t l y i n-c r e a s e d,w h i l e t h ea p o p t o s i s r a t ew a s s i g n i f i c a n t l yr e d u c e d,a n dt h ed i f f e r e n c e sw e r es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t(P0.0 5).A s c o m p a r e dw i t hn o r m a l c o n t r o l g r o u p,B I R C5a n dV E G FmR NAa n dp r o t e i n i nc e l l d a m a g eg r o u p,B I R C 5 i n t e r v e n t i o ng r o u pa n dn e g a t i v ec o n t r o l g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yr e d u c e d,a n dt h ed i f f e r e n c ew a ss t a t i s t i-c a l l ys i g n i f i c a n t(P0.0 5).C o m p a r e dw i t ht h ec e l l d a m a g eg r o u p,t h eB I R C 5 i n t e r v e n t i o ng r o u ph a ds i g n i f i-c a n t l y i n c r e a s e dmR NAa n dp r o t e i ne x p r e s s i o n so fB I R C5a n dV E G F,s h o w i n gs i g i n i f c a n td i f f e r e n c e s(P0.0 5).C o n c l u s i o n O v e r e x p r e s s i o no ft h eB I R C5g e n eh a sap r o t e c t i v ee f f e c to nm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l i n j u r y i n d u c e db yo x y g e ng l u c o s ed e p r i v a t i o n/r e o x y g e n a t i o n,a n dt h em e c h a n i s m m a yb er e l a t e dt o i t su p-r e g u l a t i o no fV E G Fe x p r e s s i o n s,s u g g e s t i n gt h a tB I R C 5sr e g u l a t i o no fV E G Fe x p r e s s i o n st op r o m o t ea n g i o-g e n e s i sm a yb eo n eo f t h e i m p o r t a n tm e c h a n i s m s f o r t h e e s t a b l i s h m e n t a n d f o r m a t i o no f g o o dc e r e b r a l c o l l a t e r a lc i r c u l a t i o n.K e yw o r d s:o v e r e x p r e s s i o no fB I R C5g e n e;c e r e b r a lm i c r o v a s c u l a re n d o t h e l i a lc e l l s;s u r v i v a l;a p o p t o s i s;o x y g e na n ds u g a rd e p r i v a t i o n/r e o x y g e n a t i o n;v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r 缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率、高致死率的特点,在我国,已经成为首位致死的原因,而且发病率呈现逐年上升趋势,不仅严重威胁国民的生命健康,同时还给家庭及社会带来了沉重负担。在临床病例中发现,缺血性脑卒中患者预后好坏跟软脑膜侧支循环代偿存在密切相关1。研究显示,血管内皮生长因子(v a s c u l a re n d o t h e l i a l g r o w t hf a c t o r,V E G F)是迄今为止发现最强、最有特异性的促血管生成的生长因子,在生理和病理性的血管生成中均发挥着重要的作用,在缺血性血管性 疾病治疗中 的应用已经 受到广泛关注2。研究已经证实,软脑膜微血管是在遗传基因调控下,由胚胎期的中胚层细胞分化而来的血管内皮细胞(v a s c u l a re n d o t h e l i a l c e l l s,V E C s)经过血管生成形成原始的毛细血管丛,随后在V E G F等环境因素影响下对该血管丛进行重塑修剪并逐步成熟,显示遗传因素对软脑膜侧支循环形成起决定性作用3。杆状病毒I A P重复序列蛋白5(b a c u l o v i r a lI A Pr e p e a t-c o n t a i-n i n gp r o t e i n5,B I R C 5)是近年来新发现的一种分子量最小、作用最强的凋亡抑制蛋白,由B I R C5基因编码。研究发现,B I R C5基因可以参与V E C s增殖、迁移、侵袭以及抵抗细胞调亡和血管新生的调控,克服V E C s自身功能缺陷,促进新生微血管生成,提示该基因在侧支循环代偿进程中可能起重要的调控作用4,从而推测靶向B I R C5基因治疗缺血性脑卒中可能具有巨大的潜能,但是其疗效及具体机制尚未清楚。b E n d.3细胞是脑微V E C s系,来源于B A L B/c小鼠大脑内皮细胞,细胞纯度高、性质稳定、传代快,是建立体外血管发生病理生理变化模型的理想细胞5。因此,本研究以小鼠脑微V E C sb E n d.3制作氧糖剥夺/复氧(o x y g e n-g l u c o s ed e p r i v a t i o n/r e o x y g e n a t i o n,OG D/R)模型模拟体外缺血/再灌注损伤模型,通过预先转染腺病毒-B I R C 5质粒诱导基因过表达,探讨其对OG D/R模型活性的影响及其可能机制,以期为缺血性脑卒中治疗的新靶点及机制提供实验基础和理论依据。1 材料与方法1.1 主要试剂与仪器 DMEM完全培养基(货号:22 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期X B 0 1)购自武汉普诺赛生命科技有限公司,P I染液(货号:G 1 0 2 1)购 自 北 京 博 沃 尔 斯 有 限 公 司,S D S-P AG E凝胶电泳试剂盒(货号:BM 0 6 8 7)购自上海圻明生 物 科 技 有 限 公 司,V E G F抗 体(货 号:1 0 5 4 2-R P 0 1)购自北京义翘神州科技股份有限公司,GA P DH抗体(货号:F N a b 0 3 3 4 3)购自武汉菲恩有限公司,E C L检测试剂盒(货号:C D L G-4 9 1 1)购自武汉纯度生物科技有限公司,二抗购自杭州弗德生物科技有限公司,c D NA第一链合成试剂盒(货号:X Y-T E-0 7 3 8)购自上海烜雅生物科技有限公司,L i p o f e c t a m i n e-2 0 0 0(货号:1 1 6 6 8-0 2 7)购自杭州昊鑫有限公司,MT T试剂(货号:MB S 8 4 3 0 9 0-C)购自武汉艾美捷科技有限公司,二甲基亚砜(货号:D 2 6 5 0)购自上海联硕宝为生物科技有限公司,A n n e x i nV-F I T C染液(货号:E-C K-A 1 1 1)购自武汉伊莱瑞特有限公司。激光共聚焦显微镜(O-l y m p u sF V 3 0 0 0),流式细胞仪(C y t o F L E X),超速离心机(WL S-4 5 0型)。小鼠脑微V E C sb E n d.3(货 号:HT X 1 9 2 6),深圳市华拓细胞库提供,腺病毒-B I R C 5质 粒(货 号:L 2 4 7 0 5)和 腺 病 毒 空 质 粒(货 号:F H 2 1 9 3),购自上海诺赛有限公司。1.2 细胞培养 将b E n d.3细胞复苏后,使用含有1 0%胎牛血清的DMEM完全培养基在3 7 含5%C O2的恒温培养箱内进行培养,细胞生长贴壁达到8 0%时进行传代培养,培养23代后,收集最佳状态细胞进行后续实验。1.3 OG R/R细胞模型的建立 取对数生长期的b E n d.3细胞以31 05个/毫升接种于6孔板中,待细胞贴壁后,用P B S冲洗2次,换成含有1 0%胎牛血清的DMEM完全培养基,在三气培养箱中(3 7,5%C O2,1%O2,9 4%N2)进行OG D/R培养。最佳时间点为OG R 3 h/R 3 h。正常对照组在3 7、5%C O2培养箱中培养相同的时间。1.4 实验分组 正常对照组:b E n d.3细胞在细胞培养基中正常培养;细胞损伤模型组:b E n d.3细胞在细胞培养基中正常培养,随后进行OG R 3 h/R 3 h;B I R C 5干预组:预先采用L i p o f e c t a m i n e-2 0 0 0转染试剂将腺病毒-B I R C 5质粒转染至b E n d.3细胞,在细胞培养基中正常培养,随后进行OG R 3 h/R 3 h;阴性对照组,预先使用L i p o f e c t a m i n e-2 0 0 0转染试剂将染腺病毒空质粒转染至b E n d.3细胞,在细胞培养基中正常培养,随后进行OG R 3 h/R 3 h。每组设5个平行孔。1.5 激光共聚焦显微镜观察细胞形态 将各组细胞制备成细胞悬液,同时把密度调整为11 06个/升,随后其接种于激光共聚焦培养皿中,P B S洗涤3次,用4%多聚甲醛固定1 0m i n,0.1%T r i t o nX-1 0 0的P B S洗涤3次,加入微丝绿色荧光探针,温室避光静置4 0m i n,0.1%T r i t o nX-1 0 0的P B S洗涤3次,激光共聚焦显微镜下观察细胞形态学变化。1.6 四甲基偶氮唑盐(MT T)法检测细胞存活率 各组细胞离心后弃掉上清液,将重悬细胞接种于9 6孔板中并调整到密度为11 04个/毫升,在3 7 下,应用5%C O2培养箱进行培养,待细胞贴壁后,每孔加入浓度为5g/L的MT T液2 0L,在3 7 下继续孵育4h,弃掉上清液,加入1 0 0L二甲基亚砜以终止反应,在摇床上振荡1 0m i n后,用酶标仪在5 7 0n m波长处检测吸光度(O D),重复3次。计算:细胞存活率(%)=实验组(O D)/对照组(O D)1 0 0%。1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组细胞离心后弃掉上清液,制成细胞悬液并接种于9 6孔板中,在3 7下,应用5%C O2培养箱进行培养2 4h,待细胞充分贴壁后,使用A n n e x i nV-F I T C凋亡试剂盒和流式细胞仪进行细胞凋亡测定,具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。1.8 R T-P C R法检测B I R C5及V E G FmR NA相对表达 使用t r i z o l试剂盒提取各组细胞总R NA,具体操作步骤按照说明书进行,用微量分光光度仪检测R NA纯度和浓度,要求O D 2 6 0/O D 2 8 0比值在1.82.0之间。使用c D NA第一链合成试剂盒逆转录合成c D NA,利用荧光实时定量P C R仪进行扩增,用P C R试剂盒检测B I R C5及V E G FmR NA的表达水平。P C R反应条件:9 3预变性1 0m i n,9 0 变性1 0s,5 7退火2 0s,6 5延伸3 0s,3 6个循环。以GA P-DH作为内参照,引物序列:GA P DH上游引物5 -T G-C A C C A C C AA C T G C T T AG C-3,GA P DH下游引物5 -G G C AT G GA C T G T G G T C AT GAG-3;B I R C5上游引物:5 -T AAG C C A C T T G T C C C AG C T T-3,B I R C5下 游 引 物:5 -C T C AT C C A C T C C C T T C C T C A-3;V E G F上游引物:5 -T G C C C C T AAT G C G G T G T-3,下游引物:5 -T G C T G G C T T T G G T GAG G T T-3;采用2-C t方法计算B I R C5及V E G F的相对表达量。1.9 免疫印迹法检测B I R C 5及V E G F蛋白表达 收集各 组 细 胞 于 离 心 管,加 入5 0L裂 解 混 合 液(R I P APM S F=1 0 01),静置1 0m i n,1 20 0 0r/m i n离心1 0m i n取上清,煮沸变性,冷却后加入等体积b u f f e r,用B C A法检测蛋白含量。行S D S-P AG E电泳,转至P V D F膜,5%脱脂奶粉封闭1h后加入B I R C 5及V E G F一抗,4 孵育过夜,羊抗兔二抗常温孵育2h,加入E C L显色液。采用增强化学发光法显色,用I m a g em a s t e rV D S成像系统摄影,图像分析软件(T o t a l l a bV 1 0 1)行灰度扫描分析。以目的蛋白与GA P DH蛋白产物条带灰度的比值表示。1.1 0 统计学方法 采用S P S S2 0.0软件进行统计分32 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期析,计量资料以(xs)表示,经检验符合正态分布后,多组间数据的比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用L S D-t检验,以P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 各组细胞的形态学 正常对照组细胞骨架微丝网状有序排列,分布规则,微丝之间彼此紧密连接(见图1 A)。细胞损伤组和阴性对照组的细胞形态基本相同,呈现细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙(见图1 B、图1 C)。B I R C 5干预组细胞微丝排列较细胞损伤组和阴性对照组更有规则,部分断裂,部分相连,细胞间隙有所缩小(见图1 D)。注:A.正常对照组;B.细胞损伤组;C.阴性对照组;D.B I R C 5干预组。每n=3(标尺=5 0m,4 0 0)。图1 4组细胞形态学的比较2.2 各组细胞存活率 4组细胞存活率差异有统计学意义(F=2 8.8 3 0,P0.0 1),细胞损伤组、B I R C 5干预 组 及 阴 性 对 照 组 的 细 胞 存 活 率 (7 3.6 73.5 1)%、(8 3.3 34.5 1)%、(7 2.0 06.0 0)%均低于正常对照组(1 0 0.0 00.0 0)%(P0.0 1),B I R C 5干预组的细胞存活率(8 3.3 34.5 1)%高于细胞损伤组 和 阴 性 对 照 组 (7 3.6 73.5 1)%、(7 2.0 06.0 0)%(P0.0 5),见图2。注:与正常对照组相比,a:P0.0 1;与B I R C 5干预组相比,b:P0.0 5。每组n=3。图2 4组细胞存活率的比较2.3 各组细胞凋亡率 应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,结果如图3所示:图中4个象限分别为D 1:死亡细胞;D 2:晚期凋亡细胞;D 3:活细胞;D 4:早期凋亡细胞。4组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=2 9.9 6 0,P0.0 1),细胞损伤组、B I R C 5干预组及阴性对照组的细胞凋亡率(5 0.3 32.0 8)%、(4 0.6 73.0 6)%、(4 9.0 03.6 1)%均 高 于 正 常 对 照 组(3 0.6 72.5 2)%(P0.0 1),B I R C 5干预组的细胞凋亡率(4 0.6 73.0 6)%低于细胞损伤组和阴性对照组(5 0.3 32.0 8)%、(4 9.0 03.6 1)%(P0.0 5),见图3。2.4 各组细胞B I R C5及V E G FmR NA相对表达量 4组细胞B I R C5及V E G FmR NA表达水平差异均有统计学意义(F=2 2.2 0 0,2 8.2 1 0,P0.0 0 1)。细胞损伤 组、B I R C 5干 预 组 及 阴 性 对 照 组B I R C5及V E G FmR NA表达水平均低于正常对照组(均P0.0 5),B I R C 5干预组B I R C5及V E G FmR NA表达水平均高于细胞损伤组和阴性对照组(P0.0 5),见表1。2.5 各组细胞B I R C 5及V E G F蛋白相对表达量 4组细胞B I R C 5及V E G F蛋白表达水平差异均有统计学意义(F=3 1.0 5 0,1 4.8 9 0,P0.0 0 1)。细胞损伤组、B I R C 5干预组及阴性对照组B I R C 5及V E G F蛋白表达水平均低于正常对照组(P0.0 1),B I R C 5干预组B I R C 5及V E G F蛋白表达水平均高于细胞损伤组和阴性对照组(P0.0 5),见表2,图4。42 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期注:A.正常对照组;B.细胞损伤组;C.B I R C 5干预组;D.阴性对照组;E.各组细胞凋亡率统计图;与正常对照组相比,a:P0.0 1;与B I R C 5干预组相比,b:P0.0 1;每组n=3。图3 4组细胞凋亡率的比较表1 各组细胞B I R C5及V E G FmR NA相对表达量组别B I R C5V E G F正常对照组0.9 90.0 40.8 20.0 4细胞损伤组0.6 40.0 8a b0.3 80.0 4a bB I R C 5干预组0.8 30.0 6a0.6 50.0 5a阴性对照组0.6 30.0 8a b0.3 70.1 2a bF2 2.2 0 02 8.2 1 0P0.0 0 10.0 0 1 注:表内计量资料数据以(xs)表示。与正常对照组相比,a:P0.0 5;与B I R C 5干预组相比,b:P0.0 1。表2 各组细胞B I R C 5及V E G F蛋白相对表达量组别B I R C 5V E G F正常对照组1.8 50.0 50.9 10.0 5细胞损伤组1.4 90.0 5a b0.6 00.0 2a bB I R C 5干预组1.6 70.4 2a0.7 50.0 3a阴性对照组1.5 20.0 6a b0.5 80.1 2a bF3 1.0 5 01 4.8 9 0P0.0 0 10.0 0 1 注:表内计量资料数据以(xs)表示。与正常对照组相比,a:P0.0 1;与B I R C 5干预组,b:P0.0 1。3 讨论脑缺血再灌注损伤是缺血性脑卒中最常见病理性损伤之一,而通过氧糖剥夺/复氧损伤可以模拟缺血再灌注导致的细胞凋亡、氧化应激、炎性反应、线粒体功能障碍等多种病理损伤,因此,氧糖剥夺/复氧模型已注:A.各组细胞B I R C 5蛋白表达条带图;B.各组细胞V E G F蛋白表达条带图。每组n=3。图4 4组细胞B I R C 5及V E G F蛋白表达量的比较成为体外研究缺血再灌注损伤的理想模型6。研究显示,软脑膜侧支循环对于脑组织抵抗缺血缺氧、避免脑梗死具有非常重要储备能力,参与缺血性脑卒中的治疗显示巨大潜能7。由此可见,深入探讨软脑膜侧支循环的发生发展对缺血性卒中患者治疗新靶点的研究将具有重大现实意义。V E C s是在胚胎时期由中胚层细胞分化而来,随后经过血管生成形成原始的毛细血管丛,在一系列遗传因素和环境因素调控下对该血管丛进行重塑修剪逐步成熟,这一生理过程一直持续到出生后3周,最后形成具有各自特征的曲折度、密度和管腔直径的软脑膜52 0 2 4年 右江民族医学院学报 第1期侧支循环8。研究发现,V E C s增殖力及迁移力降低以及新生血管发生减少与脑梗塞后软脑膜侧支循环建立不良和微循环功能障碍存在密切相关,导致脑梗塞后神经功能缺损 严重、致残 率和 死 亡 率 升 高,提 示V E C s在侧支循环建立及其良好状态的维持中起重要的调控作用9-1 0。然而,成熟V E C s存在活性低、生长及更新速度慢、降解细胞外基质的能力弱、分裂增殖慢和细胞容易调亡等自身缺陷,极大程度限制其临床应用。因此,如何赋予抗调亡、促增殖、易迁移等克服V E C s自身缺陷,以促进血管新生及良好侧支循环建立和形成成为临床科技工作者急需解决的一大难题。B I R C5基因位于人染色体1 7 q 2 5,由4个外显子和3个内含子构成。该基因编码生存素(s u r v i v i n,S VV),由1 4 2个氨基酸组成,相对分子质量1 6.51 03,是目前调亡抑制蛋白(i n h i b i t o ro f a p o p t o s i sp r o-t e i n,I A P)家族中抗调亡作用最强、分子量最小成员。多年来研究结果已经表明,B I R C5基因并非肿瘤的特异性基因,其编码的S VV也并非只表达于肿瘤细胞,多项实验已经发现并证实S VV在V E C s中存在显著表达,同时发现B