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血液学及检验实验教学笔记实验十三 自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coombs试验实验一 自身溶血试验及其纠正试验 autohemolysis test and correcting test【目的】 掌握自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coombs试验的方法及结果判断及临床应用。1. 原理：2. 器材和试剂：（1）无菌0.556mol/L（100g/l）葡萄糖液（2）无菌N.S（3）1g/l肝素水溶液（4）氰化高铁Hb转化液（5）无菌小瓶（5ml），内加0.3ml肝素，50烘干灭菌（6）无菌注射器和吸管3. 步骤和方法（1）试管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.8ml。（2）125g离心5min，调血细胞血浆为1 1。（3）取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml，混匀，37水浴3h。（4）取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml，2min后，635nm比色得吸光度为SA。（5）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。l 540nm比色，计算。溶血率（%）=1 RBC比容未保温全血管读数4测定管读数100注：未保温全血管稀释100倍，测定管稀释25倍，故乘以4。4. 临床意义： 正常人：应75%； 杂合子：多在7431%； 纯合子：多30%。5. 注意事项：l RBC比积30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。l 以ACD作抗凝剂时，其与血液之比为1：9，过量则pH下降。l 一般要求St比B大8倍以上。l 不稳定Hb易被氧化造成假阳性。实验二 高铁血红蛋白还原试验methemogobin reduction test MHb-RT1. 原理：亚硝酸钠当RBC内G6PD含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH可作为MHb的还原酶的辅酶，在美蓝的参与下，MHb被还原成Hb。如G6PD缺乏，还原速度减慢，或不能还原。通过测定还原速度间接反应G6PD的活性。Hb（Fe2+）Hb（Fe2+）MHb（Fe3+）美蓝H+2. 器材与试剂（1）亚硝酸钠和葡萄糖混合液（2）亚甲蓝（3）磷酸盐缓冲液3 方法及计算：（1）试管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.8ml。125g离心5min，调血细胞血浆为1 1。（2）取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml，混匀，37水浴3h。（3）取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml，2min后，635nm比色得吸光度为SA。（4）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。4. 参考值： 正常人：应75%；杂合子：多在7431%纯合子：多30%。5.注意事项：l RBC比积30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。l 以ACD作抗凝剂时，其与血液之比为1：9，过量则pH下降。l 一般要求St比B大8倍以上。l 不稳定Hb易被氧化造成假阳性。3. 临床意义：设问实验三 抗人球蛋白试验Coombs test重点1 原理：不完全抗体（IgG）在盐水介质中不能使RBC凝集，只附着在RBC上（致敏RBC），此种抗体是人类球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可使致敏RBC发生凝集。用于检测体内不完全抗体的试验。有间接和直接试验两种。2 方法与步骤间接抗人球蛋白试验：检查血清中的不完全抗体D-RBC待检血清致敏RBC抗人球蛋白RBC凝集管号PDd待测患者血清2滴10%OD-RBC1滴1滴抗D血清1滴1滴10%Od-RBC1滴混匀，37水育1h，810倍生理盐水洗涤3次以上，留压积RBC，加抗人球蛋白血清1滴，转动试管混匀，观察结果。P管凝集：血清中含有不完全抗体。如检查孕妇血清中有无不完全抗体。直接抗人球蛋白试验：检查RBC上的不完全抗体临床意义：C上含有不完全抗体。如检测新生儿脐血RBC上有无来自母体的抗体。实验小结：实验十四 血小板功能试验，PF3aT试验检测一、血小板粘附试验（platelet adhension test，PAdT ）常用方法：玻球法、玻璃滤器法、玻柱法原理 BPL可粘附于带负电荷的非生理性物质表面如金属、玻璃等血液在特制的玻球内转动，BPL可粘附于玻璃球内表面故血液在玻球内转动后BPL数比较转动前后血液中BPL数可了解BPL粘附功能 。器材、试剂 玻球、转动装置、显微镜、牛鲍计数板、枸橼酸盐抗凝剂、血小板稀释液等。操作1 取血1.8ml0.2ml枸橼酸加入玻球旋转3rpm/min15min2 计数粘附前后血小板数，算出粘附率。临床意义1、PAdT增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。2、PAdT减低：见于血管性血友病、巨大BPL综合征、BPL无力症、尿毒症、异常蛋白血症、 MDS、AL等。参考值 45.34%79.78%二、血小板聚集试验（platelet aggregation test ,PAgT）原理 器材、试剂 血液凝聚仪、血小板聚集诱导剂：3.0mol/L腺苷二磷酸钠盐（ADP）、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。临床意义1、增高：反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。2、减低：反映血小板聚集功能减低。见于血小板无力症、贮存池病、尿毒症、肝硬化等。BPL聚集分析参数：2A、4A、MA、TMA、T50%、Dt三、血小板第3因子有效性检测（platelet factor 3 acailability test ，PF3aT）原理 PF3是凝血的重要成分；当PF3缺乏时复钙时间延长。本试验是利用正人和病人PRP血浆以及PPP血浆相互配合，以白陶土作为活化剂测定各组标本的RT比较各组差异而了解PF3有否缺陷。组别 病人血浆mL 正常人血浆mL 40%g/L白陶土悬液(mL) PRPPPPPRPPPP10.10.10.220.10.10.230.10.10.240.10.10.2操作 临床意义超过5秒为PF3有效性减低见于：BPL第3因子缺陷症、BPL无力症、巨大BPL综合征等。参考值 复钙时间1组较2组延长低于5秒四、实验小结：实验十五 PT、KPTT、SCT、因子筛选试验【目的】 掌握PT、KPTT、SCT、因子筛选试验的原理、方法及结果判断。一、硅化的凝血时间测定（SCT）【原理】 由于本法采用硅化的用品，硅管内壁可以阻止接触活化过程，故硅管法的凝血时间较普通试管法为长。【器材】 8mm直径玻璃试管（硅化管），灭菌注射器（硅化），水浴箱，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【操作】1准备试管 取8mm直径的硅化玻璃试管3支，编号为1、2、3，置于37水浴箱中预温3min。2采血并计时 常规静脉采血3ml（自血液流入针头，即开始计时），去掉针头后分别沿试管壁缓缓注入1ml血液于3支试管内，置于37水浴中。3间隔计时 3min后每间隔0.5min，将第1支试管倾斜1次（倾斜30度），直至血液凝固。再观察第2支试管，第2支试管血液凝固后再观察第3支试管。第3支试管血液凝固时，立即停止计时。4计算 计算从血液进入针头到第3支试管血液凝固所需要的时间，即凝血时间 。【注意事项】 硅管法的注意事项与试管法相同。【参考值】 1532min。二、血浆凝血酶原时间测定（PT）【原理】 在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固的时间，即为血浆凝血酶原时间（prothrombin time , PT）。本试验是外源性凝血系统常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【试剂】125mmol/L氯化钙凝血活酶试剂。商品试剂，用前按要求用蒸馏水溶解混匀。2正常人冻干混合血浆。多为商品试剂，用25个以上正常人血液经109mmol/L枸橼酸钠抗凝（血液与抗凝剂之比为91），3000r/min离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶1ml，冻干保存。3109mmol/L枸橼酸钠溶液。【操作】1采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min，分离血浆。2平衡温度 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆置室温中15min。3预温 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆、待测血浆，置37水浴中预温5min。4测定 取小试1支，加入正常人混合冻干血浆0.1ml， 37水浴预温30s，再加入预温的25mmol/L氯化钙凝血活酶溶液0.2ml，混匀，立即启动秒表计时。5计时 不断地轻轻倾斜试管，观察试管内液体的流动情况，当液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，并记录所需时间。重复测定23次，取其平均值。6测定待测血浆 以同样方法测定待测血浆的凝血酶原时间（重复23次测定，取其平均值）。7结果报告 以直接测定的时间（PT）报告，同时，报告正常混合冻干血浆PT。以PT比值（PTR）报告，PTR=待测血浆PT/正常人混合冻干血浆PT。以国际标准化比值（INR）报告，INR=PTRISI（ISI为氯化钙凝血活酶试剂国际敏感指数）。【注意事项】1所用试管必须洁净、干燥、无划痕。2采血要顺利，血液与抗凝剂比例（91）要准确。抗凝要充分，充分混匀，决不能有血凝块。3采血后宜在1h内完成测定，4冰箱内保存不应超过4h，20下可保存14d，70下可保存6个月。4先测定正常人混合冻干血浆的凝血酶原时间，其结果在正常允许范围内后才能测定待测血浆。5水浴温度要控制在（37.00.5），温度过高或过低都可影响测定结果。6血细胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5时，抗凝剂的用量应做调整。抗凝剂（ml）=（100Hct）血液（ml）0.00185。7由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，测定的条件也略变动，故每次测定均需有正常对照。8氯化钙凝血活酶必须注明国际敏感指数（ISI）。【参考值】 PT：1113s（超过正常对照3s有意义）。PTR：0.851.15。INR：0.81.5。三、活化部分凝血活酶时间测定【原理】 在37条件下，以白陶土（激活剂）激活、因子，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第3因子，在Ca2参与下，测定血浆凝固所需的时间。本试验是内源性凝血系统灵敏和常用的筛检试验。【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化玻璃试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。【试剂】1109mmol/L枸橼酸钠溶液。2APTT试剂（含白陶土或鞣酸及脑磷脂） 液体试剂混匀后可直接使用，冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。325mmol/L氯化钙溶液。4正常人混合冻干血浆 多为商品试剂，用25个以上正常人血浆经109mmol/L枸橼酸钠溶液抗凝（血液与抗凝剂之比为91），3000r/min离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶1ml，冻干保存。【操作】1采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min，分离血浆。2平衡温度 用蒸馏水溶解正常人混合冻干血浆，于室温下静置15 min以上，充分混匀。3预温活化 于试管中加入正常人冻干血浆和APTT试剂各0.1ml，混匀，37水浴中预温3 min，预温过程中，轻轻振摇数次。4加钙计时 于试管中加入预温至37的25mmol/L 氯化钙溶液0.1ml，混匀，并立即计时，置水浴中不断振摇。20s后，不时地缓慢倾斜试管，观察试管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间，重复检测23次，取平均值。5测定待测血浆 以同样方法测定待检血浆的APTT（重复测定23次，取平均值）。【注意事项】1采血要顺利，血液与抗凝剂要充分混匀。2采血后应尽快检测，最迟不应超过2h。被检血浆放置过久，凝固时间有缩短的倾向。3血浆加APTT试剂后预温时间不得少于3min。4血液离心速度要达到3 000r/min，时间为10min，以便尽可能除去血小板。5活化剂因规格不一，其致活能力不同，因此参考值有差异。如果正常人混合冻干血浆APTT明显延长，则提示APTT试剂质量不佳。6检测前应先测定正常人混合血浆，如果其APTT在允许范围内方能测定待检标本。否则，应重新配制APTT试剂。【参考值】 25.0735.00s，超过正常对照10s以上有意义。四、因子筛选试验【原理】 受检血浆Ca2+溶液使Fg转变成Fb凝块凝块置入5mol/L尿素液中。如果受检血浆缺乏因子XIII，则形成的可溶性Fb凝块易溶于尿素溶液中。【器材、试剂】109mmol/L枸橼酸钠溶液、25mmol/L氯化钙溶液。【操作】1采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3 000r/min离心10min，分离血浆。2加钙，凝固。3凝块置尿素溶液，观察溶解情况。【参考值】24小时不溶解五、实验小结：第 12 页 共 12 页