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《血液学及检验》实验教学笔记
实验十三 自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coomb’s试验
实验一 自身溶血试验及其纠正试验
autohemolysis test and correcting test
【目的】 掌握自溶+纠正、高铁血红蛋白还原试验、Coomb’s试验的
方法及结果判断及临床应用。
1. 原理：

2. 器材和试剂：
（1）无菌0.556mol/L（100g/l）葡萄糖液
（2）无菌N.S
（3）1g/l肝素水溶液
（4）氰化高铁Hb转化液
（5）无菌小瓶（5ml），内加0.3ml肝素，50℃烘干灭菌
（6）无菌注射器和吸管
3. 步骤和方法
（1）试管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.8ml。
（2）125g离心5min，调血细胞∶血浆为1 ∶1。
（3）取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml，
混匀，37℃水浴3h。
（4）取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml，2min后，635nm比色得吸
光度为SA。
（5）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。

l 540nm比色，计算。
溶血率
（%）
=
1— RBC比容
未保温全血管读数×4
×测定管读数×100
注：未保温全血管稀释100倍，测定管稀释25倍，故乘以4。

4. 临床意义：
正常人：应＞75%；
杂合子：多在74～31%；
纯合子：多＜30%。
5. 注意事项：
l RBC比积＜30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。
l 以ACD作抗凝剂时，其与血液之比为1：9，过量则pH下降。
l 一般要求St比B大8倍以上。
l 不稳定Hb易被氧化造成假阳性。

实验二 高铁血红蛋白还原试验
methemogobin reduction test MHb-RT
1. 原理：
亚硝酸钠
当RBC内G6PD含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH可作为MHb的还原酶的辅酶，在美蓝的参与下，MHb被还原成Hb。如G6PD缺乏，还原速度减慢，或不能还原。通过测定还原速度间接反应G6PD的活性。
Hb（Fe2+）
Hb（Fe2+）
MHb（Fe3+）
美蓝
H+

2. 器材与试剂
（1）亚硝酸钠和葡萄糖混合液
（2）亚甲蓝
（3）磷酸盐缓冲液
3． 方法及计算：
（1）试管中加葡萄糖20mg，109mol/L枸橼酸钠液0.2ml，血1.8ml。
125g离心5min，调血细胞∶血浆为1 ∶1。
（2）取抗凝血1ml，加亚硝酸钠葡萄糖混合液和亚甲蓝各0.5ml，混匀，37℃水浴3h。
（3）取血0.1ml，加磷酸盐缓冲液10ml，2min后，635nm比色得吸光度为SA。
（4）用未加亚硝酸钠葡萄糖血，做上步试验，得吸光度为B。

4. 参考值： 正常人：应＞75%；
杂合子：多在74～31%
纯合子：多＜30%。
5.注意事项：
l RBC比积＜30%时，还原率显著下降，故需调整血细胞和血浆比。
l 以ACD作抗凝剂时，其与血液之比为1：9，过量则pH下降。
l 一般要求St比B大8倍以上。
l 不稳定Hb易被氧化造成假阳性。
3. 临床意义：设问
实验三 抗人球蛋白试验Coombs test
重点
1． 原理：不完全抗体（IgG）在盐水介质中不能使RBC凝集，只附着在RBC上（致敏RBC），此种抗体是人类球蛋白，如果用家兔抗人球蛋白加入，可使致敏RBC发生凝集。用于检测体内不完全抗体的试验。有间接和直接试验两种。
2． 方法与步骤
间接抗人球蛋白试验：检查血清中的不完全抗体
D-RBC
待检血清
致敏RBC
抗人球蛋白
RBC凝集

管号
P
D
d
待测患者血清
2滴

10%OD-RBC
1滴
1滴

抗D血清

1滴
1滴
10%Od-RBC

1滴
混匀，37℃水育1h，8～10倍生理盐水洗涤3次以上，留压积RBC，加抗人球蛋白血清1滴，转动试管混匀，观察结果。
P管凝集：血清中含有不完全抗体。如检查孕妇血清中有无不完全抗体。
直接抗人球蛋白试验：检查RBC上的不完全抗体

临床意义：C上含有不完全抗体。如检测新生儿脐血RBC上有无来自母体的抗体。
实验小结：

实验十四 血小板功能试验，PF3aT试验检测
一、血小板粘附试验（platelet adhension test，PAdT ）
常用方法：玻球法、玻璃滤器法、玻柱法
[原理] BPL可粘附于带负电荷的非生理性物质表面如金属、玻璃等→血液在特制的玻球内转动，BPL可粘附于玻璃球内表面→故血液在玻球内转动后BPL数↓→比较转动前后血液中BPL数可了解BPL粘附功能 。
[器材、试剂] 玻球、转动装置、显微镜、牛鲍计数板、枸橼酸盐抗凝剂、血小板稀释液等。
[操作]
1． 取血1.8ml＋0.2ml枸橼酸→加入玻球→旋转3rpm/min×15min
2． 计数粘附前后血小板数，算出粘附率。
[临床意义]
1、PAdT增高：见于血栓前状态和血栓性疾病。
2、PAdT减低：见于血管性血友病、巨大BPL综合征、BPL无力症、尿毒症、异常蛋白血症、 MDS、AL等。
[参考值] 45.34%～79.78%

二、血小板聚集试验（platelet aggregation test ,PAgT）
[原理]

[器材、试剂] 血液凝聚仪、血小板聚集诱导剂：3.0μmol/L腺苷二磷酸钠盐（ADP）、肾上腺素、胶原、瑞斯托霉素、花生四烯酸。
[临床意义]
1、增高：反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。
2、减低：反映血小板聚集功能减低。见于血小板无力症、贮存池病、尿毒症、肝硬化等。
BPL聚集分析参数：2’A、4’A、MA、TMA、T50%、Dt

三、血小板第3因子有效性检测（platelet factor 3 acailability test ，PF3aT）

[原理] PF3是凝血的重要成分；当PF3缺乏时复钙时间延长。本试验是利用正人和病人PRP血浆以及PPP血浆相互配合，以白陶土作为活化剂测定各组标本的RT比较各组差异而了解PF3有否缺陷。
组
别
病人血浆mL
正常人血浆mL
40%g/L白陶土悬液(mL)
PRP
PPP
PRP
PPP
1
0.1

0.1
0.2
2

0.1
0.1

0.2
3
0.1
0.1

0.2
4

0.1
0.1
0.2
[操作]

[临床意义]
超过5秒为PF3有效性减低见于：BPL第3因子缺陷症、BPL无力症、巨大BPL综合征等。
[参考值] 复钙时间1组较2组延长低于5秒
四、实验小结：

实验十五 PT、KPTT、SCT、ⅩⅢ因子筛选试验
【目的】 掌握PT、KPTT、SCT、ⅩⅢ因子筛选试验的原理、方法及结果判断。
一、硅化的凝血时间测定（SCT）
【原理】 由于本法采用硅化的用品，硅管内壁可以阻止接触活化过程，故硅管法的凝血时间较普通试管法为长。
【器材】 8mm直径玻璃试管（硅化管），灭菌注射器（硅化），水浴箱，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。
【操作】
1．准备试管 取8mm直径的硅化玻璃试管3支，编号为1、2、3，置于37℃水浴箱中预温3min。
2．采血并计时 常规静脉采血3ml（自血液流入针头，即开始计时），去掉针头后分别沿试管壁缓缓注入1ml血液于3支试管内，置于37℃水浴中。
3．间隔计时 3min后每间隔0.5min，将第1支试管倾斜1次（倾斜30度），直至血液凝固。再观察第2支试管，第2支试管血液凝固后再观察第3支试管。第3支试管血液凝固时，立即停止计时。
4．计算 计算从血液进入针头到第3支试管血液凝固所需要的时间，即凝血时间 。
【注意事项】 硅管法的注意事项与试管法相同。
【参考值】 15～32min。
二、血浆凝血酶原时间测定（PT）
【原理】 在受检血浆中加入足量的凝血活酶和钙离子，测定血浆凝固的时间，即为血浆凝血酶原时间（prothrombin time , PT）。本试验是外源性凝血系统常用的筛检试验。
【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。
【试剂】
1．25mmol/L氯化钙凝血活酶试剂。商品试剂，用前按要求用蒸馏水溶解混匀。
2．正常人冻干混合血浆。多为商品试剂，用25个以上正常人血液经109mmol/L枸橼酸钠抗凝（血液与抗凝剂之比为9∶1），3000r/min离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶1ml，冻干保存。
3．109mmol/L枸橼酸钠溶液。
【操作】
1．采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min，分离血浆。
2．平衡温度 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆置室温中15min。
3．预温 将氯化钙凝血活酶溶液和正常人混合冻干血浆、待测血浆，置37℃水浴中预温5min。
4．测定 取小试1支，加入正常人混合冻干血浆0.1ml， 37℃水浴预温30s，再加入预温的25mmol/L氯化钙凝血活酶溶液0.2ml，混匀，立即启动秒表计时。
5．计时 不断地轻轻倾斜试管，观察试管内液体的流动情况，当液体流动缓慢趋于停止时，终止计时，并记录所需时间。重复测定2～3次，取其平均值。
6．测定待测血浆 以同样方法测定待测血浆的凝血酶原时间（重复2～3次测定，取其平均值）。
7．结果报告 ①以直接测定的时间（PT）报告，同时，报告正常混合冻干血浆PT。②以PT比值（PTR）报告，PTR=待测血浆PT/正常人混合冻干血浆PT。③以国际标准化比值（INR）报告，INR=PTRISI（ISI为氯化钙凝血活酶试剂国际敏感指数）。
【注意事项】
1．所用试管必须洁净、干燥、无划痕。
2．采血要顺利，血液与抗凝剂比例（9∶1）要准确。抗凝要充分，充分混匀，决不能有血凝块。
3．采血后宜在1h内完成测定，4℃冰箱内保存不应超过4h，－20℃下可保存14d，－70℃下可保存6个月。
4．先测定正常人混合冻干血浆的凝血酶原时间，其结果在正常允许范围内后才能测定待测血浆。
5．水浴温度要控制在（37.0±0.5）℃，温度过高或过低都可影响测定结果。
6．血细胞比容（Hct）小于0.2或大于0.5时，抗凝剂的用量应做调整。抗凝剂（ml）=（100－Hct）×血液（ml）×0.00185。
7．由于每次使用的氯化钙凝血活酶活性不尽相同，测定的条件也略变动，故每次测定均需有正常对照。
8．氯化钙凝血活酶必须注明国际敏感指数（ISI）。
【参考值】 ①PT：11～13s（超过正常对照3s有意义）。②PTR：0.85～1.15。③INR：0.8～1.5。
三、活化部分凝血活酶时间测定
【原理】 在37℃条件下，以白陶土（激活剂）激活Ⅺ、Ⅻ因子，以脑磷脂（部分凝血活酶）代替血小板第3因子，在Ca2＋参与下，测定血浆凝固所需的时间。本试验是内源性凝血系统灵敏和常用的筛检试验。
【器材】 水浴箱，灭菌注射器，硅化玻璃试管或塑料管，离心机，秒表，碘酊棉球，乙醇棉球。
【试剂】
1．109mmol/L枸橼酸钠溶液。
2．APTT试剂（含白陶土或鞣酸及脑磷脂） 液体试剂混匀后可直接使用，冻干试剂需用蒸馏水溶解再使用。
3．25mmol/L氯化钙溶液。
4．正常人混合冻干血浆 多为商品试剂，用25个以上正常人血浆经109mmol/L枸橼酸钠溶液抗凝（血液与抗凝剂之比为9∶1），3000r/min离心10min，分离血浆后，混合分装为每瓶1ml，冻干保存。
【操作】
1．采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3000r/min离心10min，分离血浆。
2．平衡温度 用蒸馏水溶解正常人混合冻干血浆，于室温下静置15 min以上，充分混匀。
3．预温活化 于试管中加入正常人冻干血浆和APTT试剂各0.1ml，混匀，37℃水浴中预温3 min，预温过程中，轻轻振摇数次。
4．加钙计时 于试管中加入预温至37℃的25mmol/L 氯化钙溶液0.1ml，混匀，并立即计时，置水浴中不断振摇。20s后，不时地缓慢倾斜试管，观察试管内液体的流动状态，当液体停止流动时停止计时，记录时间，重复检测2～3次，取平均值。
5．测定待测血浆 以同样方法测定待检血浆的APTT（重复测定2～3次，取平均值）。
【注意事项】
1．采血要顺利，血液与抗凝剂要充分混匀。
2．采血后应尽快检测，最迟不应超过2h。被检血浆放置过久，凝固时间有缩短的倾向。
3．血浆加APTT试剂后预温时间不得少于3min。
4．血液离心速度要达到3 000r/min，时间为10min，以便尽可能除去血小板。
5．活化剂因规格不一，其致活能力不同，因此参考值有差异。如果正常人混合冻干血浆APTT明显延长，则提示APTT试剂质量不佳。
6．检测前应先测定正常人混合血浆，如果其APTT在允许范围内方能测定待检标本。否则，应重新配制APTT试剂。
【参考值】 25.07～35.00s，超过正常对照10s以上有意义。
四、ⅩⅢ因子筛选试验
【原理】 受检血浆＋Ca2+溶液→使Fg转变成Fb凝块→凝块置入5mol/L尿素液中。→如果受检血浆缺乏因子XIII，则形成的可溶性Fb凝块易溶于尿素溶液中。
【器材、试剂】109mmol/L枸橼酸钠溶液、25mmol/L氯化钙溶液。
【操作】
1．采血并分离血浆 常规静脉采血1.8ml，加入含有109mmol/L枸橼酸钠溶液0.2ml的硅化试管或塑料管中，充分混匀，3 000r/min离心10min，分离血浆。
2．加钙，凝固。
3．凝块置尿素溶液，观察溶解情况。
【参考值】24小时不溶解
五、实验小结：

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