qPCR实验操作作业流程.doc

Q-PCR试验步骤

一、 ①试验前准备，天天早上到试验室后，先把超净工作台紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做试验，需佩戴洁净橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不能够用使用过手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子立即封好。④橡胶手套须放入超净台照射紫外，试验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤试验进行过程中或观看试验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。
二、 总RNA抽提
1）细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸洁净，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充足裂解，室温静置5min；
组织样品用液氮充足研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混匀，室温放置5min使其充足裂解；（管盖和管壁全部需标识样品名称）
2） 加入200μl氯仿，猛烈振荡混匀30s，使水相和有机相充足接触，室温静置3-5min；（离心时离心管按次序排放，离心完成，离心管次序也按次序排好，和第一步次序一致）
3） 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新RNase free EP管；（用20-200ul枪吸收上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸收上清，枪头不可碰到、吸到中间层）
4） 沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充足混匀（颠倒6-8次）（不应用振荡器混匀），室温静置10min；
5） 4℃下，14,000g离心10min，搜集RNA沉淀（如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，搜集RNA沉淀），去上清；
6） 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min）（加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀），超净台风干；沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。
7） 视沉淀量加入适量DEPC水（最少15ul）溶解沉淀。
三、去基因组
使用RNase-freeDNase І（Promega），按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。
RNA
DNase І
10 x buffer
H2O(RNase free)
RNasin
30
20
10
39.5
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
100
µl
然后按以下步骤操作：
1) 加入等体积苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。
2) 加入等体积氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。
3） 加入等体积异丙醇，轻柔地充足混匀（颠倒6-8次），-20℃静置15min；
4） 4℃下，14,000g离心15min，搜集RNA沉淀，去上清；
5） 用75％乙醇洗涤两次（12,000g离心5min），超净台风干；
6） 加入适量DEPC水（最少15ul）溶解沉淀。
四、总RNA纯度和完整性检测
1） 纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280比值大于1.8，说明制备RNA较纯，无蛋白质污染。
2） 总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照，总RNA5s rRNA， 18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整话即可证实总RNA抽提比较完整。

五、逆转录
1. mRNA：
1) 在RNase freePCR管中配置下列溶液.
Total RNA
H2O
1.0
µg
µl
总体积
12
µl

2) 将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随即立即冰上致冷， 以预防RNA复性；
3) 在该PCR管中加入下列试剂（Promega）
oligo（dT）
Random primer
10mM dNTP
RNase inhibitor
5 x buffer
M-MLV
0.5
0.5
2.0
0.5
4.0
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
8.0
µl
4) 将上述20μl反应溶液30℃保温10min；
5) 42℃保温50min；
6) 85℃保温10min；
7) -20℃保留。

2. microRNA：
使用茎环逆转录法，原理以下图：

1） 在去RNasePCR管中配置以下溶液.
total RNA
X个miR逆转录引物
H2O
1.0
0.5*X

µg
µl
总体积
12.5
µl

2）将上述溶液混匀，85℃孵育5min，以打开RNA二级结构。随即立即置于冰上，以预防RNA复性再次恢复二级结构；
3） 在另一去RNasePCR管中配置以下溶液：
10mM dNTP (promega)
RNase inhibitor (promega)
U6逆转录引物
5x buffer
M-MLV (promega)
2.0
0.5
0.5
4.0
0.5
µl
µl
µl
µl
µl
总体积
7.5
µl
4） 将3）溶液加入到1）溶液中，混匀后30℃保温10min；
5） 42℃孵育50min；
6） 85℃孵育10min灭活逆转录酶。

四、定量PCR检测
1.引物测试：
依据mRNA设计引物正式试验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式试验，每对引物需做模板水对照。
得到结果后，首先依据熔解曲线判定引物特异性，选择标准为：单峰且峰形偏窄、水对照无显著引物二聚体熔解曲线峰。若设计多对引物熔解曲线均显示特异性良好，则应对比各引物扩增曲线，优先选择Ct值小、扩增效率高引物进行正式试验。
2．确定上机内容后，首先在统计本上编排好上机样品排放次序。（1）一个样品加样尽可能安排在同一行（2）如正式试验中三次反复不能安排在同一板上，则需把三次反复中试验分开，但同一次反复试验不能分开两板

3．正式试验：
体系配制：
H2O 4ul
SYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振荡均匀)
上游引物 0.5ul （10uM）
下游引物 0.5ul （10uM）
总体积 15ul
计算好试验中需用多少份体系，则按具体量配置。体系分装会有损失，通常多配0.5份--1份体系。
总体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。
3．cDNA用灭菌纯水稀释合适浓度，通常为1:20稀释，如碰到基因表示低样品，则合适降低稀释百分比至1:10或1:5。cDNA按一定次序排好后，即可加至刚配好反应体系中。加样完成，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿边上标识好1-12次序（不可将标识写在反应管盖子上，八连管盖避免裸手触摸中间透明荧光采集区域，且确保每孔均盖紧，不然影响反复性或可能出现熔解曲线峰漂移。）
4．把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

五．上机：
5.1 先开电脑，进入Windows 界面。接着打开PCR仪电源开关。
5.2 打开7500软件，选择“新建”，在“Template”下拉菜单中选择“60”或“65”（一般基因检测为“60”，MicroRNA检测为“65”）
5.3 打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管孔位，剔除无反应管孔位。
5.4 点击File菜单中Save，输入要保留结果文件名，命名为日期-上机时间-用户名字简写，如100830-1008-WL表示8月30日10点08分魏立试验。
5.5 点击Start键，开始运行程序。
5.6 程序运行完成后，取出样品架上八连管，按次序关闭ABI PRISM 7500 SDS 软件、PCR仪电源开关。
5.7 在7500软件上标识好每个反应孔样品名称及检测基因名称，分类保留好结果文件。

反应完成后，八连管应装到封口袋中，袋子上标识好文件名，用户名字。（同一个用户三次反复试验，则只需保留其中一次反复反应管即可，其它可丢弃）