NRG-1通过SIRT1-NOX2通路减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大.pdf

基 金 项 目:河 南 省 医 学 科 技 攻 关 计 划 省 部 共 建 项 目(SB201901060)作者单位:453100新乡医学院第一附属医院心血管内科、心脏病诊疗中心(王有恒、王学惠);453000新乡医学院(王有恒、王学惠)通信作者:王学惠,电子信箱:wangxuehui000 NRG-1 通过 SIRT1-NOX2 通路减轻血管紧张素诱导的心肌肥大王有恒王学惠摘要目的探究神经调节蛋白 1(neuregulin-1,NRG-1)对血管紧张素(angiotensin-,Ang-)诱导的心肌肥大的保护作用及其潜在机制。方法体外培养大鼠心肌细胞系(H9C2),使用 Ang-处理 H9C2 细胞,构建 Ang-诱导的心肌肥大细胞模型。给予 NRG-1 干预 H9C2 细胞,通过测量心肌细胞表面积和活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量,检测线粒体膜电位,通过 Western blot 法检测心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)、沉默信息调节因子 1(silent information regulator 1,SIRT1)、超氧化物歧化酶 1(superoxide dismutase 1,SOD1)及 NADPH 氧化酶 2(NADPHoxidase isoform 2,NOX2)蛋白表达,观察 NRG-1 的保护作用。结果与模型组比较,NRG-1 能够明显降低心肌细胞表面积(P 0.05),减少肥大标志物 ANP、BNP 表达(P 0.05),降低 ROS 水平(P 0.05),升高线粒体膜电位(P 0.05),增加 SOD1、SIRT1 表达(P 0.05),降低 NOX2 蛋白水平(P 0.05)。SIRT1 抑制剂 EX527 可以阻断 NRG-1 的保护作用。结论NRG-1可改善 Ang-诱导的心肌细胞肥大,其潜在机制可能与 SIRT1-NOX2 氧化应激通路有关。关键词神经调节蛋白 1血管紧张素心肌肥大沉默信息调节因子 1氧化应激中图分类号R54文献标识码ADOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2024.03.024NRG-1 Attenuates Angiotensin-induced Myocardial Hypertrophy Via the SIRT1-NOX2 Pathway.WANG Youheng,WANG Xue-hui.Department of Cardiology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Heart Center of Xinxiang Medical University,Henan 453100,ChinaAbstractObjectiveTo investigate the protective effect of neuregulin-1(NRG-1)on myocardiac hypertrophy induced by angio-tensin-(Ang-)and its potential mechanism.MethodsThe rat cardiomyocyte cell line(H9C2)was cultured in vitro,andH9C2 cells were treated with Ang-to construct the myocardiac hypertrophy cell model induced by Ang-.H9C2 cells were treatedwith NRG-1,and mitochondrial membrane potential was detected by measuring myocardial cell surface area and reactive oxygen species(ROS)content.The protein expression of atrial natriuretic peptide(ANP),brain natriuretic peptide(BNP),brain natriuretic peptide(BNP),silent information regulator 1(SIRT1),superoxide dismutase 1(SOD1)and NADPH oxidase isoform 2(NOX2)were detectedby Western blot,and to observe the protective effect of NRG-1.ResultsCompared with the model group,NRG-1 was able to signifi-cantly decreased the cardiomyocytes surface area(P 0.05),decreased the expression of hypertrophy markers ANP and BNP(P 0.05)and the level of ROS(P 0.05),increase the mitochondrial membrane potential(P 0.05)and the expression of SOD1 and SIRT1(P 0.05),and decreased the NOX2 protein levels(P 0.05).The SIRT1 inhibitor EX527 blocked the protective effect of NRG-1.ConclusionNRG-1 ameliorates Ang-induced cardiomyocyte hypertrophy,and the underlying mechanism may be related to theSIRT1-NOX2 oxidative stress pathway.Key wordsNRG-1;Ang-;Myocardial hypertrophy;Silent information regulator 1;Oxidative stress高血压是心血管疾病的诱因之一,且高血压发生率逐年升高1。多项研究表明,长期高血压可通过心肌细胞氧化应激、心肌纤维化引起心肌肥大,最终导致心力衰竭2。血管紧张素(angiotensin-,Ang-)是哺乳动物体内重要的血压及体液调节激素,是肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angio-tensin-aldosterone,RAAS)的关键效应分子3。长期的 Ang-水平升高导致心肌肥大、氧化应激、纤维化等,促进心力衰竭发生,并激活多种参与心肌肥大的信号分子,包括沉默信息调节因子(silent information reg-ulator,SIRT1)通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen acti-021论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3vated protein kinase,MAPK)信号通路等2,4,5。过量的Ang-可导致心肌细胞中活性氧(reactive oxygen spe-cies,ROS)的产生同时增加心肌细胞氧化应激水平,抑制 SIRT1 通路6。神经调节蛋白 1(neuregulin 1,NRG-1)是一种从内皮细胞释放的心脏活性因子,对心脏发育、结构和心脏功能完整性是不可或缺的7。研究表明,NRG-1 通过促进扩张型心肌病心肌血管生成来缓解糖尿病或冠状动脉疾病血管生成反应受损8。但是,目前 NRG-1 对 Ang-所诱导的心肌肥大研究较少,且具体机制尚未完全阐明。基于以上背景,本研究通过Ang-诱导 H9C2 细胞肥大模型,观察 NRG-1 处理后对心肌肥大的影响,并探索其作用机制,为 NRG-1的临床应用提供实验依据。材料与方法1.药 物、试 剂 与 仪 器:NRG-1 购 自 以 色 列ProSpec-Tany TechnoGene 公司(货号:CYT-407),用高压灭菌后的纯水稀释成浓度为 10mol/L 的母液,分装至 EP 管中,-80 冰箱冻存备用。Ang-购自郑州远东生物科技有限公司,使用纯水稀释成10mmol/L 母液,分装至 EP 管中,-80 冰箱冻存备用。GAPDH 蛋白抗体购自美国 Proteintech 公司;心房钠 尿 肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑 钠 肽(brain natriuretic peptide,BNP)、超氧化物歧化酶 1(superoxide dismutase 1,SOD1)、SIRT1、NADPH 氧化酶 2(NADPH oxidase isoform,NOX2)蛋白抗体购自万类生物公司;线粒体膜电位试剂盒、鬼笔环肽染色试剂盒、活性氧检测试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒均购自上海碧云天生物有限公司;1%青霉素/链霉素、10%胎牛血清、DMEM 培养基购自美国 Science Cell公司。CO2培养箱购自美国 Thermo 公司;低速离心机购自美国 Thermo 公司;酶标仪购自美谷分子仪器有限公司;光学相差显微镜购自日本 Nikon 公司;恒温孵育箱购自中国常州国华有限公司、电子天平、-80 冰箱购自美国 Thermo Forma 公司;电泳系统(BIO-RAD)、摇床购自中国其林贝尔仪器制造公司;超净工作台购自中国苏州净化公司;化学发光荧光 成 像 系 统 Amersham Imager 600 购 自 美 国 GE公司。2.细胞系和细胞培养:大鼠心肌细胞系 H9C2 购自中国科学院细胞库(上海)(ATCC 编号:CRL-1446)。细胞用 10%胎牛血清及 1%青霉素/链霉素的 DMEM 培养基培养。培养条件,37、5%的 CO2。使用胰蛋白酶进行消化传代,细胞传代 3 次后进行实验,接种于细胞培养板中,当细胞密度长至 70%左右加入 1mol/L Ang-继续培养 24h 来诱导细胞肥大。3.CCK-8 试 剂 盒 检 测 H9C2 细 胞 活 力:将H9C2 细胞接种于 96 孔板中,每孔接种 7000 个细胞,孵育 24h,加入不同浓度的 Ang-(0、0.25、0.5、0.75、1、1.25mol/L)及 NRG-1(0、5、10、15、20、25nmol/L)进行处理,每个浓度设置 6 个复孔,继续培养 24h,随后加入 100l 培养基洗涤 2 3 遍,加入 10l的 CCK-8 试剂,继续孵育 4h,用酶标仪检测 450nm 处的吸光度并进行统计学分析,实验重复3 次。4.H9C2 细胞骨架染色:将细胞接种于 6 孔板中,待使用不用药物处理后,使用 PBS 配制 3.7%甲醛(避免使用含有甲醇的甲醛)溶液室温固定细胞约10 20min。使用 1%Triton X-100 的 PBS 洗涤 2 4 次,每次 5min。然后使用含有 5%BSA 和 0.1%Triton X-100 的 PBS 按照 1 100 的比例稀释鬼笔环肽母液即为工作液,每孔中加入 1ml 工作液,室温避光孵育 30 60min,使用 0.1%Triton X-100 的 PBS洗涤 2 4 次,每次 5min,随后荧光显微镜进行观察并拍照。使用 Image-J 软件进行分析并计算细胞表面积。每组测量 30 个细胞进行测量取平均值。5.检 测 ROS 含 量:使 用 无 血 清 培 养 基 稀 释DCFH-DA 母液(10mmol/L)至终浓度(10mol/L)作为工作液。PBS 洗涤分别使用不同药物处理过的细胞,加入 DCFH-DA 工作液 1ml,放入培养箱中继续孵育 20min,然后使用无血清养基洗涤细胞 3 遍,使用荧光显微镜观察并拍照,使用 Image-J 软件进行荧光强度测定。6.JC-1 检测细胞线粒体膜电位:将细胞接种于6 孔板中,配置 JC-1 工作液:将母液(200)加入JC-1 缓冲液中稀释 200 倍配置成为工作液待用。PBS 洗涤分别使用不同药物处理过的细胞,加入JC-1 工作液 1ml,放入培养箱中继续孵育 20min,然后使用无血清养基进行洗涤,用荧光显微镜观察并拍照,使用 Image-J 软件进行荧光强度测定。7.Western blot 法检测细胞中 ANP、BNP、SOD1、SIRT1、NOX2 蛋白表达:将接种于 6 孔板中给予相应处理后的细胞,使用 PBS 冲洗 2 遍,加入裂解液,使用超声裂解仪裂解 4 次,100 煮蛋白 10min 使蛋白变性后,冷却至室温,离心 2min,置于-80 冰箱中备用。BCA 法测定蛋白浓度。根据蛋白浓度调整上121医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著样量后进行电泳。电泳结束后行湿法转膜,按照 11000 比例配置相应抗体后,一抗孵育过夜后,使用TBST 洗膜 3 遍,孵育二抗 1.0 1.5h,再次用 TBST洗涤 3 次,配置显色液曝光。Image-J 软件分析其灰度值,以目标蛋白条带灰度值/内参(GAPDH)灰度值表示相应目的蛋白。8.统计学方法:应用 GraphPad Prism 8.0 统计学软件进行统计分析并绘制统计图。符合正态分布的计量资料以均数 标准差(x s)表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析,以 P 0.05 为差异有统计学意义。结果1.Ang-及 NRG-1 对 H9C2 细胞活力的影响:将 H9C2 细胞接种于 96 孔板中,加入不同浓度的Ang-进行处理 24h,检测 H9C2 细胞活性。结果显示,与空白组比较,随着 Ang-浓度升高,细胞活力先升高后降低。在 1mol/L Ang-处理细胞时活力接近正常水平,选取 1mol/L 为实验浓度,并验证其 对 细 胞 表 面 积 的 影 响。同 时 测 定 不 同 浓 度NRG-1 对细胞活力的影响,发现 25nmol/L NRG-1对细胞具有损伤作用,选取 20nmol/L 为实验浓度进行后续实验(图 1)。图 1Ang-与 NRG-1 处理 H9C2 细胞后检测其细胞活力A.随着 Ang-浓度升高,H9C2 细胞活力先升高后降低。B.随着 NRG-1 浓度升高,H9C2 细胞活力下降。与浓度 0 比较,P 0.05,n=62.NRG-1 对 H9C2 细 胞 表 面 积 的 影 响:经Ang-(1mol/L)处理 24h 后,检测 H9C2 细胞面积。与空 白 组 比 较,模 型 组 细 胞 表 面 积 明 显 增 加(P 0.05),使用浓度为 20nmol/L 的 NRG-1 预处理后,可改善 Ang-引起的心肌细胞表面积增加,经过 NRG-1 处理的 Ang-+NRG-1 组 vs 模型组 细 胞 面 积 为(860.0 101.4m2vs 1335.6 165.5m2,图 2)。图 2NRG-1 对 Ang-处理后的 H9C2 细胞表面积的影响(400)A.空白组;B.模型组;C.Ang-+NRG-1 组;D.柱状图。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05 3.NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞肥大标志物的影响:经 Ang-(1mol/L)处理 24h 后,检测 ANP、BNP 肥大相关蛋白表达。与空白组比较,模型组 ANP、BNP 表 达 增 加(P 0.05)。NRG-1(20nmol/L)可以抑制 Ang-诱导的 ANP、BNP 蛋白表达(P 0.05),NRG-1 能够有效地抑制 Ang-诱发的心肌肥大(图 3)。4.NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞线粒体膜电位的影响:经 Ang-(1mol/L)处理 24h 后,检测 H9C2 细胞线粒体膜电位水平。与空白组比较,221论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3图 3NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞肥大标志物表达的影响A.NRG-1 改善 Ang-诱导的 H9C2 细胞 BNP 表 达 上 调;B.NRG-1 改善 Ang-诱导的 H9C2 细胞 ANP 表达上调。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05,n=3模型组可检测到线粒体膜电位的下降(P 0.05),而使用 NRG-1(20nmol/L)处理后,Ang-所诱导的线粒体膜电位下降明显逆转(P 0.05,图 4)。5.NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞 ROS的影响:经 Ang-(1mol/L)处 理 24h 后,检 测H9C2 细胞内 ROS 水平。模型组较空白组 ROS 含量增加(P 0.05),与模型组比较,NRG-1(20nmol/L)组 ROS 含量较 Ang-组明显下降(P 0.05,图 5)。6.NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞氧化应激的影响:经 Ang-(1mol/L)处理 24h 后,检测NOX2 和 SOD1 氧 化 应 激 相 关 蛋 白 的 表 达 水 平。NOX2 是常见的产生 ROS 的蛋白,而 SOD1 是常见的抗氧化蛋白。与对照组比较,模型组 NOX2 明显增加,SOD1 显著降低,而使用 NRG-1 预处理后可显著 抑 制 NOX2 的 表 达,同 时 促 进 抗 氧 化 蛋 白SOD1 的表达(图 6)。7.NRG-1 对 H9C2 细胞 SIRT1 蛋白表达的影响:经 Ang-不同浓度(1mol/L 和 2mol/L)处理后,SIRT1 表达 显 著 下 降(P 0.05)。同 时 经 Ang-(1mol/L)处 理图 4NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞线粒体膜电位的影响(40)A.空白组;B.模型组;C.Ang-+NRG-1 组;D.柱状图。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05,n=3图 5NRG-1 对 Ang-诱导的心肌细胞内 ROS 表达的影响(10)A.空白组;B.模型组;C.Ang-+NRG-1 组;D.柱状图。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05,n=6321医学研究杂志 2024 年 3 月第 53 卷第 3 期论著图 6NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞氧化应激水平的影响A.NRG-1 改善 Ang-诱导的 H9C2 细胞 SOD1 表达下降;B.NRG-1改善 Ang-诱导的 H9C2 细胞 NOX2 表达下降。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05,n=324h 后,检测 SIRT1 蛋白表达水平,显示在 Ang-处理后,SIRT1 蛋白表达下降(P 0.05),然而 NRG-1(20nmol/L)预处理后,SIRT1 蛋白表达较模型组增加(P 0.05,图 7)。图 7NRG-1 对 Ang-诱导的 H9C2 细胞 SIRT1 蛋白水平的影响A.Ang-降低 H9C2 细胞 SIRT1 表达;B.NRG-1 改善 Ang-诱导的 H9C2 细胞 SIRT1 表达下降。与空白组比较,P 0.05;与模型组比较,#P 0.05,n=3 8.SIRT1 抑制剂对 H9C2 细胞 NOX2 蛋白表达的影响:为 进 一 步 验 证 NRG-1 的 保 护 机 制,使 用SIRT1 抑 制 剂(EX527)处 理 H9C2 细 胞 24h,监 测H9C2 细胞中 SIRT1 表达显著下调(P 0.05)。同时验证了通路相关蛋白 NOX2 表达,在 EX527 存在的情况下,NOX2 蛋白表达显著增加(P 0.05,图 8)。讨论多种心脏疾病如高血压、冠心病、心脏瓣膜病等都可引起心肌肥大,最终导致心力衰竭。病理性心肌肥大是心力衰竭的机制之一2。因此,研究心肌肥大的 潜 在 机 制 对 预 防 心 力 衰 竭 具 有 重 要 意 义。Ang-属于 RAAS 系统,是心脏重塑和心血管疾病的关键介质。生理浓度的 Ang-对心血管系统是有益的,但是 Ang-过度分泌引起的心肌纤维化和肥大是导致心脏重构的主要因素9。Ang-可以作用于心肌细胞,导致 ANP、BNP 水平增加。该指标已被认为可以反映心肌肥大程度及心室收缩和舒张功能情况。本研究使用 Ang-处理 H9C2 细胞,构建心肌细胞肥大模型,探究 NRG-1 是否改善心肌肥大并探讨其潜在机制。研究表明,氧化应激是心肌肥大病理过程中的关键环节10。氧化应激是氧化与抗氧化系统之间失衡的结果11。心血管系统中,ROS 主要来源于线粒体,线粒体功能下降会导致 ROS 产生过多,增加氧化应激水 平12。NADPH 氧 化 酶 与 ROS 生 成 密 切 相关13。NOX2 在 ROS 的生成中起到电子供体的作用14。Ang-可以增加 NOX2 表达,损伤线粒体功能15。研究表明,NOX2 可加重高脂饮食诱导的小鼠心肌肥厚,其机制是通过增加 ROS 的产生,降低氧化应激水平,然而在 NOX2 基因敲除小鼠中,高脂饮食诱导的小鼠心肌肥厚显著减轻16。SOD1 可以与锌和铜离子结合,是体内负责破坏421论著J Med Res,March 2024,Vol.53 No.3图 8SIRT1 抑制剂 EX527 对 SIRT1及 NOX2 蛋白表达的影响A.EX527 降低了 H9C2 细胞 SIRT1 蛋白表达;B.EX527 增加了 H9C2 细胞 NOX2 蛋白表达自由基的三种超氧化物歧化酶之一。作为体内一种重要的抗氧化物质,其可以清除体内的 ROS17。研究表明,在 Ang-所诱导的心肌肥大过程中,SOD1被逐渐消耗,导致 ROS 水平增加,引起心肌细胞损伤18。炎症在心肌肥大中同样起着至关重要的作用。NLRP3 是炎症通路中的关键介质之一。ROS 在整个 NLRP3 炎性小体激活过程 中是不可或 缺的。ROS 可以调节 NLRP3 的启动环节,进而减少白细胞介素(interleukin,IL)-1 和 IL-18 的产生,减少炎性反应4。因此,抑制 ROS 水平,可以从多方面抑制心肌肥大。sirtuins 是类组蛋白去乙酰基酶,已在人类中发现了 7 种 Sirtuins 亚型,即 SIRT1、SIRT2、SIRT3、SIRT4、SIRT5、SIRT6 和 SIRT7。其中 SIRT1 研究得最多,它也被称为核蛋白19。SIRT1 参与 ROS 的产生与消耗,其机制是通过调节 NOX2、SOD1 在内产生和消耗 ROS 有关的酶20,21。因此,调节 SIRT1 的水平可能成为治疗心肌肥大的新靶点22。NRG-1 是一种内皮细胞释放的心脏活性因子,对心脏发育、结构和功能是不可或缺的23,但其改善心肌重构的具体分子机制尚未完全阐明。本实验中应用 Ang-诱导心肌细胞肥大,设置空白组、模型组、治疗组测定心肌细胞表面积、线粒体膜电位水平、ROS 水平及 ANP、BNP、SIRT1、SOD1、NOX2 蛋白表达,进而探讨 NRG-1 抑制心肌肥大的作用机制。Ang-诱导的心肌肥大模型中,可以观察到细胞表面积增加,线粒体膜电位下降,ANP、BNP、NOX2 表达增加,SIRT1、SOD1 表达下降,而 NRG-1 能够有效缓解 Ang-引起的变化,表明 NRG-1 对 Ang-诱导的心肌肥大具有明显的保护作用。而使用 EX527处理后,NRG-1 改善氧化应激的能力下降,因此,NRG-1 抑制 Ang-所致的心肌肥大可能部分是通过 SIRT1-NOX2 通路所实现的。综上所述,本实验验证了 NRG-1 抗心肌细胞肥大的作用,同时了发现了 SIRT1-NOX2 通路可能是NRG-1 抗心肌肥大潜在机制之一,但是不能排除NRG-1 通过其他非特异性机制改善心肌重构,需要开展进一步研究。利益冲突声明:所有作者均声明不存在利益冲突。参考文献1 Ott C,Schmieder RE.Diagnosis and treatment of arterial hypertension2021J.Kidney Int,2022,101(1):36-462 Slivnick J,Lampert BC.Hypertension and heart failure J.HeartFail Clin,2019,15(4):531-5413 滕欣越,王灵冰,孙硕,等.血管紧张素引起高血压的分子机制研究进展J.医学研究杂志,2019,48(1):14-174 Ren B,Feng J,Yang N,et al.Ginsenoside Rg3 attenuates angioten-sin II-induced myocardial hypertrophy through repressing NLRP3 in-flammasome and oxidative stress via modulating SIRT1/NF-B path-wayJ.Int Immunopharmacol,2021,98:1078415 Gong Y,Li G,Tao J,et al.Double knockout of Akt2 and AMPK ac-centuates high fat diet-induced cardiac anomalies through a cGAS-STING-mediated mechanismJ.Biochim Biophys Acta Mol BasisDis,2020,1866(10):1658556 Zhou L,Zhang S,Bolor-Erdene E,et al.NAMPT/SIRT1 attenuateang ii-induced vascular remodeling and vulnerability to hypertensionby inhibiting the ROS/MAPK pathway J.Oxid Med Cell Longev,2020,2020:19742657 De Keulenaer GW,Feyen E,Dugaucquier L,et 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