分子标记在番茄抗性育种研究应用进展.doc

分子标记在番茄抗性育种中研究进展

摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上应用，分析了当前研究进展，对此后研究重点进行了讨论。
核心词：分子标记；番茄；抗性；进展。
Molecular marker in tomato resistance breeding research progress in
Abstract：This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breeding，analysis of the current research progress，the focus of the future research are discussed.
Key words：Molecular markers；tomato；resistance；progress.
番茄既是蔬菜也是水果，其中具有丰富维生素C对心血管有良好保护作用；番茄红素具备良好抗氧化作用,能清除体内废物,增长免疫力。它也是营养师大力倡导减肥食品。它早已成为人们寻常生活中不可缺少食物。
随着遗传学发展,遗传标记种类和数量也在不断增长。形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达到果(体现型)为基本,是对基因间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具备能对各发育时期个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境影响,也不受基因表达与否限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体影响体现“中性”以及操作简便等特点。分子标记所有这些特性,奠定了它具备广泛应用性基本。本文在简介某些惯用DNA分子标记技术基本上,综述分子标记应用于番茄遗传育种研究新进展,并就国内此后番茄分子育种重要研究方向进行讨论。
1． 分子标记简介
分子标记概念:广义分子标记是指可遗传并可检测DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差别特异性DNA片段。
在番茄遗传育种研究工作中使用DNA分子标记重要涉及基于Southern杂交限制性片段长度多态性标记( RFLP)、基于PCR技术DNA扩增办法随机扩增多态性DNA标记( RAPD),简朴重复序列标记(SSR)、以及基于PCR与酶切相结合扩增片段长度多态性标记(AFLP)、切割扩增多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性(SNP) 等。
2.分子标记基本原理
RFLP(限制性片段长度多态性，restriction fragment length polymorphism,简称RFLP)基本原理是:植物基因组DNA经限制性内切酶酶切后,通过电泳将大小不同酶切片段按照各自长度分离,通过Southern吸印与标记探针杂交,放射自显影检测酶切片段多态性,此办法稳定可靠。
RAPD(随机扩增DNA多态性，random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)是以基因组总DNA为模板,运用随机引物对模板进行PCR扩增得到多态性DNA片段,然后通过电泳检测片段多态性,以此来诊断生物体内在基因排布与外在性状体现规律技术。它基于PCR,无需预先懂得DNA序列信息。
简朴重复序列(simple sequence repeats,简称SSR)又叫微卫DNA( microsatellite DNA)。所谓微卫星是由2~ 6bp重复单位串联而成,一种微卫星长度普通不大于100bp,不同品种或个体核心序列重复次数不同,但重复序列两端序列多是保守单拷贝序列,通过PCR扩增其间核心微卫星DNA序列,运用电泳分析不同基因型个体在每个SSR位点上多态性。
AFLP (扩增片段长度多态性，amplified fragments length polymorphism,简称AFLP)原理是把限制性酶切片段通过PCR反映进行扩增,再把扩增好酶切片段通过聚丙烯酰胺凝胶等高辨别率分析胶电泳,最后检出片段多态性。
切割扩增多态性序列标记(cleaved amplified polymorphic sequence,简称CAPS)技术运用PCR对RFLP标记进行了转化，CAPS技术与AFLP技术相反,它是在先获得某个位点特异扩增产物基本上,再将该扩增产物进行酶切,电泳检测酶切片段多态性。
单核苷酸多态性(SNP)技术检测是单核苷酸差别。重要是指由基因组核苷酸水平上变异引起DNA序列多态性,涉及单碱基转换、颠倒、插入和缺失等。SNP在基因组内可以人为地划分为2种形式:基因编码区功能性突变,重要分布于基因编码区(coding region) ,故又称为CSNP；遍及于基因组大量单碱基变异。与此前某些遗传学标记相比较,SNP具备位点丰富、检查成本低、检出率高等长处。同一位点不同等位基因之间经常只有一种或几种核苷酸差别，因而在分子水平上对单个核苷酸差别进行检测是很故意义。
3.番茄分子标记在抗性育种中研究进展
番茄分子标记在番茄抗性育种，耐冷性育种，耐盐性育种，抗病虫害育种，抗病性育种(重要涉及晚疫病，烟草花叶病毒，青枯病，斑萎病)等方面应用十分广泛，研究也日趋进一步。
3.1在番茄耐冷性育种中研究
番茄是喜温植物，温度低于10℃时生长发育就受到阻碍，8℃时生长量增长迟缓，5℃时生长完全停止，有些品种还会体现出明显冷害症状。
黄锡志等人运用RFLP分子标记构建了番茄基因连锁图，把2个抗冷性基因和3个番茄种子发芽期抗冷性有关基因在基因连锁图上进行了明拟定位[1]。
赵福宽等人以番茄耐冷性基因系为试材，从耐冷及冷敏感植株中提取DNA构建耐冷DNA池及冷敏感DNA池，采用RAPD分子标记技术，从280 个随机引物中筛选出一种在两池间具备多态性引物OPF14，用轮回亲本及回交后裔单株DNA进行验证，证明了该引物扩增出特异性片段是一种与番茄耐冷性相连锁RAPD标记。从琼脂糖凝胶回收OPF14扩增出多态性条带与载体pGEMR_T_Eas 连接，并转入大肠杆菌DH5_α，对克隆片段测序表白实际大小为792bp，这为转化成稳定SCAR标记奠定了基本。研究从DNA分子水平上理解耐冷性状差别，筛选与番茄耐冷性有关RAPD分子标记，为番茄耐冷育种提高选取效率奠定基本[2]。
3.2在番茄耐盐性育种中研究
中华人民共和国北方地区土壤都是盐碱地，对番茄生长和产量有着很大限度影响，研究人员对番茄进行耐盐性实验，以期加速作物耐盐育种进程，提高番茄产量。
Saranga等人通过度子标记办法得出来自耐盐L.pennellii LA716 F2群体总产量和总干物质含量在盐胁迫下遗传力为0.3~0.4，实验成果表白可以通过后裔选取获得耐盐新材料。大大提高了选出耐盐品种育种速度[3]。
Monforte等人通过度子标记技术在L.esculentum E9和L.cheesmanii L2F2群体中鉴定出了一种数量性状位点，这个数量性状位点在盐胁迫下可以对番茄早熟性起重要影响作用，解释表型变异35.6%，这个数量性状位点在非胁迫下效应明显减小，阐明该数量性状位点在盐胁迫下控制早熟性，也发现其他微效数量性状位点和上位互作效应存在[4]。
3．3在番茄抗病性育种中研究
3.3.1. 抗白粉病育种中研究
Huang等人将易感品种Mongker 和抗病品种L.hirsutum G1.1560 杂交后得到F代、F3代材料进行PAPD分析，把Ol-1基因定位在RFLP标记TG153和TG164之间。实验还找到了与抗番茄白粉病基因紧密连锁5个均为共显性RAPD标记，并转化为SCAR01、SCAR10、SCAE16、SCAR11和SCAR16SCAR标记，这有助于该基因克隆以及番茄抗白粉病分子标记辅助选取系统建立，这个成果使得需要5至9次回交老式育种方式完毕工作，只需2~3次即可完毕，大大缩短了育种时间[5]。
卫丽等人对由显性核基因(RL-4)控制番茄野生种L.peruvianum 抗白粉病抗性进行了分子标记研究。通过采用F2代群分法，在F2代抗、感池间随机筛选了256对引物，找到了与番茄抗白粉病基因RL-4连锁6个AFLP标记，遗传距离分别为4.3，5.5，5.5，5.6，6.6 和11.9cM[6]。
3.3.2.抗叶霉病育种中研究
Thomas等运用AFLP技术在L.esculentum(Cf-9)和L.pennellii F2世代中筛选出了近42 000个AFLP座位，实验获得了3个与Cf-9共分离AFLP标记(M1、M2、M3)，集中于Cf-9 基因两侧。对具有Cf-9基因克隆质粒再用AFLP标记进行分析，得知M1和M2分别位于Cf-9基因两侧，相距间隔为15.5cM。Jones等人通过这3个标记为起点，通过转座子示踪子技术将Cf-9基因克隆[7]。
于拴仓等人以9个含不同叶霉病抗病基因番茄品种为试材，通过接种鉴定表白，Cf-5、Cf-9、Cf-11和Cf-19基因对中华人民共和国当前2个叶霉菌优势生理小种均具备较强抗性。依照Cf-9基因设计引物，扩增Cf-9基因片段，含Cf-9、Cf-11和Cf-19基因3种番茄均获得了2.7kb扩增片段。但用限制性内切酶TaqⅠ对PCR产物酶切可以将3 种材料明显区别开来，Cf-9 2个差别酶切片段为1170和460bp；Cf-112个差别酶切片段为1100和410bp；Cf-192个差别酶切片段为1210和300bp，从而建立了3个基因分子标记。在F2分离群体中验证表白，3个基因分子标记鉴定成果与抗性接种鉴定成果是一致，用这些标记可以进行分子标记辅助选取[8]。
3.3.3.抗晚疫病育种中研究
番茄抗晚疫病是番茄生长过程中容易感染一种病，由两类不同基因控制：一种受单显性Ph因控制；另受多基因控制，与各种因素关于，属数量性状。已在野生番茄中发现2个Ph基因(Ph1和Ph2)。
Chunwongse等人运用感病品种CLN657(susceptible)和抗病品种L3708(resistant)杂交F2群体对基因Ph-3进行标记，找到1个RFLP标记TG591(LOD=18.41)和2个AFLP，该基因与Ph和Ph-2为非等位基因[9]。
Moreau等人运用Hawaii7996和WVa700杂交F2代群体，把基因定位在标记CP105和TG2338.4cM范畴内(第10条染色体长臂上)，并运用BSA群体找到了与Ph-2连锁AFLP标记。从而构建了Ph-2区域高密度图谱，为该基因图谱克隆奠定了基本[10]。
3.3.4.抗烟草花叶病毒病育种中研究
番茄烟草花叶病毒病是番茄发生普遍，危害严重病害，在番茄中当前已鉴定出了3个显性抗病基因Tm-1、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)。
Pillen等人运用2112个回交群体，对Tm-2a区域高辨别率遗传图谱进行了构建，在周边约4.3cM范畴内定位了13个RFLP标记和RAPD标记，其中10个标记集中在0.2cM窄小范畴内，而离Tm-2a近来两侧标记仅相距0.05cM。有一种RFLP标记(R12)与Tm-2a呈共分离现象。运用Tm-2两侧遗传距离为1cMRFLP标记，只用两代就可以获得导入片段仅为2cM含Tm-2基因植株，而用常规办法至少需要100代才干得到同样成果[11]。
Dax等人运用两个近等基因系Tom-1S和Tom-1R，找到了两个共显性RAPD标记，长度分别为450bp和500bp，并将其转化为稳定SCAR标记，来鉴定分离群体杂和性和纯和性，这为育种工作提供了一种以便、迅速办法。田苗英等人运用RAPD技术和BSA法，找到了一种与Tm-2基因连锁分子标记OPD00(7.067cM)[12]。
3.3.5.抗青枯病育种中研究
番茄青枯病(Ralstonia solnacearum) 是一种发生普遍、危害严重土传性病害,其病原细菌可在土壤中存活近年，是热带、亚热带地区番茄生产上重要病害。迄今为止尚未找到防止此病有效药物，因而进行抗病育种是防治该病最有效手段。
Thoquet等人运用Hawaii7996和WVa700杂交3500株F3群体和已有RFLP标记，运用不同数量性状位点模型，发现了2个QRL重要分布在第6条染色体上，为番茄抗青枯病育种提供了方向[13]。
寿森炎等人用番茄高抗青枯病品种“T51A”与高感青枯病品种“T9230”配制杂交组合，接种鉴定其正反交F1代及F2代分离群体青枯病发生状况。成果表白，T51A对青枯病抗性属于细胞质遗传，受1 对杂合基因加性控制。用64个EcoRⅠ/MseⅠ引物组合对“T51A”、“T9230”2个亲本及其F2代抗病和感病基因池进行AFLP分析，共扩增出约4 200条可辨别带，其中2条为稳定差别。用“T51A”和“T9230”杂交产生F2代分离群体对2个特异条带与目基因遗传连锁性进行分析，发现特异条带AAG/CAT与暂定名为RRS-342抗青枯病基因紧密连锁，两者之间遗传距离为6.7cM。将AAG/CAT片段回收、克隆和测序，成功地将其转化为SCAR标记，可以更加以便地用于对番茄青枯病基因标记辅助选取[14]。
3.6.抗斑萎病育种中研究
番茄斑萎病(Tomatospotted wilt virus)是一种严重番茄病害之一，普通引起番茄茎和叶片发育不良、坏死，导致植株死亡。而由野生番茄转移到栽培番茄中Sw-5基因对番茄斑萎病具备明显抗性。
Chague等人通过用BSA法和RAPD技术筛选与Sw-5连锁标记，找到了9 个与Sw-5连锁标记，其中标记R1和R2分别位与Sw-5两侧10.5cM范畴内，与Sw-5距离均为1.1cM，并以为这2个标记都是因种间杂交随同Sw-5进入L.esculentum。她们还把其中R2改导致稳定SCAR 标记[15]。
3.7.在番茄抗虫害育种中研究
根结线虫(Meloidogynespp.)是番茄重要病害之一，随着保护地蔬菜面积增长，特别是日光温室大面积推广，导致根结线虫危害日趋严重，当前生产上防治根结线虫办法虽然诸多，但防治效果不抱负，不能从主线上解决问题，而哺育抗病品种，是经济有效办法。
Klein-Lankhorst等人运用83M7133和83M7138近等基因系(只在Mi 和Asp-1位点有差别群体)，找到了2个RFLP标记(GP79和H6A202)和3个RAPD标记。均与番茄根结线虫基因紧密连锁，并且运用GP79标记能鉴定具备抗根结线虫性状番茄植株杂合性和纯合性，从而为育种工作提供了以便[16]。
王孝宣等人将Multiplex-PCR和CAPS长处结合起来建立了Multiplex-CAPS技术。这种技术能同步检测2个、3个或各种CAPS标记多态性，其效果等同于每个CAPS标记多态性叠加，重复性好，分析效率高，减少成本数倍[17]。
李红双等人研究应用RAPD技术，筛选到一种与番茄抗根结线虫病基因连锁RAPD标记，并将该标记成功地转化成了SCAR标记，为应用分子标记辅助育种及为进一步克隆该抗病基因打下基本[18]。
4.分子标记在番茄抗性育种中应用
分子标记是随着生物技术迅速发展日趋完善，建立在分子水平上，不受环境因素影响技术。分子标记技术现今已经广泛用于各种实验研究中。
分子标记辅助选取技术在番茄抗病虫育种中得到了越来越广泛作用。据记录,当前，已找到了与20余个抗病虫基因连锁分子标记。
分子标记技术还被用于番茄抗病基因分离。据记录，当前已分离番茄抗病基因已达9个，其中涉及抗细菌性斑点病Pto基因和Prf基因，抗枯萎病I22基因和I22C基因，抗叶霉病Cf22基因、Cf24基因、Cf24A基因、Cf25基因和Cf29基因，这些研究对于探讨抗病基因作用机理和提高番茄抗病性具备十分重要意义。
5. 存在问题与前景
以上是近年来人们在番茄分子方面研究，这些可以让研究人员对番茄分子标记方面进展有了一定限度上理解，研究人员对番茄抗虫性和抗病性方面研究比较多，成果也很普遍，但是在耐寒性，耐盐碱，耐热方面研究还是比较少，这就规定科研人员实验不但要把重点集中到抗病虫害方面，还要集中到耐寒抗耐盐碱方面。固然，分子标记技术必要依附于常规育种，因而，将分子标记选取应用于常规育种筹划，对番茄生产，具备长远意义。

参 考 文 献：

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分子标记在番茄抗性育种中研究进展

综述报告

院 系：园艺林学学院
姓 名：张 涛
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