大米多肽在抗皱_修护护肤品中的应用及功效.pdf

www.ffc-原料与配方2024年4月第2期Apr.2024,No.2香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS112www.ffc-作 者四川爱莎健康管理有限公司，四川成都 610000 王 玲 王 刚#廖知恒 张家威 赵晨媚大米多肽在抗皱/修护护肤品中的应用及功效摘 要采用弹性蛋白酶及活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）抑制率试验分别评估大米多肽护肤品对弹性蛋白酶及 ROS 的抑制率。通过仪器测试以及受试者自评问卷（N=30）来评估大米多肽护肤品对人体皮肤抗皱及屏障功能修护效果。结果表明：大米多肽护肤品对弹性蛋白酶以及对 ROS 的抑制率均显著高于空白对照组。与未使用产品相比，30 名受试者使用大米多肽护肤品 28 天后，皮肤弹性、眶下皱纹（包括总体尺寸、宽度和深度）、皮肤粗糙度Ra值、血红素超高浓度、泛红评分、经皮水分流失值均显著改善；受试者自评结果显示皮肤皱纹淡化、屏障得到修护、皮肤弹性更强等。所有测试结果均具有显著的统计学差异（P0.05）。大米多肽护肤品具有显著的改善皱纹及修护肌肤屏障的效果。关键词大米多肽 改善皱纹 修护屏障 弹性 活性氧自由基 功效评价Application and Efficacy of Rice Polypeptides in Anti Wrinkle/Repair Skincare ProductsWANG Ling WANG Gang#LIAO Zhiheng ZHANG Jiawei ZHAO Chenmei(Sichuan ASYA Wellness Management Co.,Ltd.,Chengdu 610000,Sichuan,China)Abstract:The inhibition rate of rice polypeptides skincare products on elastase and reactive oxygen species(ROS)were evaluated by experiments on the inhibition rate of elastase and ROS.The anti-wrinkle and barrier function repair effect of rice polypeptides skincare products on human skin were studied,through objective evaluation of instrument testing and subject self-assessment questionnaire(N=30).The results indicated that the inhibitory rates of rice polypeptides skincare products on elastase and ROS were significantly higher than those of the blank control group.After the rice polypeptides skincare products were applied on the face for 28 days,30 subjects showed significant improvements in skin elasticity,orbital wrinkles(including overall size,width,and depth),skin roughness(Ra value),ultra-high concentration of heme,redness score and trans epidermal water loss(TEWL)value compared to the unused product.The self-assessment results of the subjects indicated that skin wrinkles were reduced,barriers were repaired,and skin elasticity was stronger.All test results indicated significant statistical differences(P0.05).Rice polypeptides skincare products have significant effects on improving wrinkles and repairing skin barriers.Keywords:rice polypeptides improve wrinkle repair barrier elasticity reactive oxygen species(ROS)efficacy evaluation作 者 简 介王玲（1990），女，硕士，工程师，主要从事化妆品功效评价的研究。#通信作者：王刚（1978），男，本科学历，工程师，主要从事化妆品开发与应用的研究。联系电话：[phone]E-mail: DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2023.0243收稿日期：2023-09-14；修回日期：2023-10-23 随着人们生活水平的提高，延长寿命和保持年轻外表的渴望刺激了对产品的需求，这些产品第 2 期原料与配方王 玲，等：大米多肽在抗皱/修护护肤品中的应用及功效113www.ffc-www.ffc-有助于减少皮肤老化，特别是皱纹、松弛、色素沉着导致的肤色不均等1。由于皮肤直接与外部环境接触，如太阳辐射和空气污染等，因此皮肤是第一个可见老化迹象发生的地方，氧化应激对暴露皮肤的衰老起主要作用2。内在（时间）和外在（光）老化的机制包括分别通过氧化代谢产生活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和暴露在太阳紫外线（ultraviolet，UV）光下刺激 ROS 的产生，过量的 ROS 会导致 DNA 损伤，增 加 肿 瘤 坏 死 因 子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素 1（interleukin-1，IL-1）、白细 胞 介 素 6（interleukin-6，IL-6）、白 细 胞 介 素8（interleukin-8，IL-8）等多种促炎因子的表达量，皮肤自身抗氧化剂减少以及基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的 产 生3-4，MMPs 可降解真皮层中的胶原蛋白和弹性蛋白5；炎症反应介导皮肤损伤，导致屏障功能受损6-7，屏障受损使 ROS 更易攻击皮肤，进一步加剧皮肤老化和屏障损伤。胶原蛋白弹性蛋白等大分子蛋白作为抗皱、紧致的原料被广泛应用于抗衰老化妆中但这些大分子蛋白透皮吸收较差，难以穿透皮肤角质层被吸收8。蓝铜胜肽、乙酰基肽、棕榈酰肽等作为蛋白片段的小分子肽。小分子肽（主要是二肽和三肽）很容易透皮吸收9。肽在皮肤中调节细胞增殖和迁移、炎症、血管生成和调节蛋白质合成10。因此，肽不仅能促进细胞外基质成分的合成、减少皱纹，还能增强皮肤屏障功能11，起到延缓ROS 导致肌肤老化和修复受损屏障的作用。大米多肽（二肽和三肽）属于小分子肽，能刺激成纤维细胞的增殖，并刺激原胶原、胶原VII 和原纤维蛋白-1 的信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）表达12。大米多肽具有较强的清除羟基自由基、超氧阴离子自由基等的作用，单独或与其它抗氧化成分搭配用于化妆品中对皮肤起到抗衰作用13-14。大米多肽通过激活核因子 E2相关因子 2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）信号通路对细胞起到保护作用，防止细胞的氧化损伤15。目前，针对大米多肽的研究主要集中在抗氧化以及抗衰功效研究上，功效评价方式多集中于生物化学以及细胞生物学试验等，鲜有大米多肽修护肌肤屏障功效相关的报导。因此，系统地对添加大米多肽（二肽和三肽）的护肤品（以大米多肽面霜为研究对象）进行体外以及在体功效研究。体外研究通过弹性蛋白酶及 ROS 抑制率试验评估其功效；在体研究通过仪器检测结合受试者主观评估评价添加大米多肽护肤品的抗皱、修护功效。1 试验部分1.1 主要试剂与仪器大米多肽 Nutripeptides GR（成分：水、1,2-戊二醇、水解大米蛋白，主要活性成分为大米二肽和三肽），法国 Silab 公司；大米多肽面霜（包含质量分数 2%的 Nutripeptides GR 且不添加其他活性成分）及不含 Nutripeptides GR 的空白面霜，实验室自制；猪胰腺弹性蛋白酶，Sigma 公司；人类永生化表皮细胞（HaCat），武汉尚恩生物技术有限公司；DMEM 培养基，赛默飞世尔科技公司；CCK-8 试剂盒、活性氧检测试剂盒，Solarbio 公司。Antera3D CS 型多功能 3D 皮肤成像分析仪，爱尔兰 Miravex 公司；Cutometer dual MPA580 型皮肤弹性测试仪，德国 CK 公司；VapoMeter 型经皮水分流失测量仪，芬兰 Delfin 公司；Visia 7 型 面 部 图 像 分 析 系 统，美 国 Canfield 公 司；MultiSkan FC 型酶标仪、二氧化碳培养箱，美国Thermo Fisher 公司。1.2 试验方法1.2.1 弹性蛋白酶抑制率试验将 200 L 0.12 mol/L Tris-Cl 缓冲液（pH 8.0）与 N-琥珀酰-三-L-丙氨酸 4-硝基苯胺（美国Sigma 公司）混合，使后者达到 1.0 mmol/L。分别将 30 L 测试样品（100 mg/mL 大米多肽面霜）及空白对照样品（100 mg/mL 空白面霜）和 20 L 2.5 U/mL 猪胰腺弹性蛋白酶与溶液混合16。在 25 培养箱中孵育 20 min 后，用酶标仪测定 410 nm 处吸光度，得出样品对弹性蛋白酶的活性影响并计算统计学差异 P 值。1.2.2 ROS 抑制率试验171.2.2.1 细胞活性检测按 8103个/孔的接种密度接种细胞至 96 孔板，培养箱（37、体积分数 5%CO2）中孵育过夜；配制不同体积分数（0、5.00%、2.00%、1.00%、0.50%、0.10%）的样品工作液；待 96 孔板中细胞铺板率达到 40%60%时进行给药。空白对照组每孔加入 200 L 含质量分数 10%PBS 的培养液；原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品114www.ffc-www.ffc-样品组每孔加入 200 L 含有相应含量样品的培养液；空白组无细胞接种，仅加入 200 L 细胞培养液；每个含量梯度下设置 3 个重复孔；给药完成后将96 孔板放置在培养箱（37、体积分数 5%CO2，下同）中培养；细胞孵育培养 24 h 后，弃掉上清，加入含 0.5 mg/mL 的 CCK-8 的培养基，37 避光育 4 h 孵育结束后，弃掉上清，每孔加 100 L 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度值。根据式（1）计算相对细胞活性。相对细胞活性=A样品A空白A空白对照A空白100%（1）1.2.2.2 ROS 抑制率测试 按 1105个/孔的接种密度接种细胞至 24 孔板，培养箱中培养 18 24 h；受试物孔中根据细胞活性结果加入一定含量受试物的培养基、空白对照和裸细胞孔中加入正常培养基，每组设置 3个重复孔。给药后在培养箱中继续培养 24 h；弃去原培养基，PBS 清洗 1 次，孵育结束后，不弃液，除空白对照和裸细胞孔外，测试样品孔进行 H2O2诱导，H2O2的诱导时间为 1.5 h，诱导剂量为 250 mol/L；诱导结束后，根据试剂盒说明书检测活性氧抑制率，并根据式（2）计算抑制率。抑制率=（1T样品T裸细胞T空白对照T裸细胞）100%（2）1.2.3 人体试用功效测试试验1.2.3.1 志愿者筛选纳入标准：年龄 35 60 岁（试验开始时刻）；眼角有明显皱纹且同时满足法令纹明显、眼角处有皱纹、下眼有细纹、面部易敏感 4 个条件之一。符合Skin Aging Atlas亚洲人分级 1 6；受试者近 3 个月来没有参加别的临床研究；能理解测试过程，自愿参加试验并签署书面知情同意书者。排除标准：近一周使用抗组胺药或近一个月使用过免疫抑制剂；近两个月受试部位使用任何抗炎药物；胰岛素依赖糖尿病患者；哺乳期或妊娠妇女；过敏体质、过敏性皮肤炎等人群，有皮肤病或疾病史；正在接受皮肤科治疗的人群，或一个月内服用羟基酸类以及抗衰老类药物的受试者；试验负责人判断为不适合作为本次试验对象的人群。1.2.3.2 试验步骤采用自身前后对照试验，受试者每天早晚洁面后取适量大米多肽面霜涂抹于面部，轻柔至充分吸收，每日 2 次，持续 28 天。分别于第 0（D0）、14（D14）、28 天（D28）对受试者进行人体功效测试。筛选合格的受试者 30 人，于正式测试前用温水清洁面部并用无屑面巾纸擦干，在温度为(212)、相对湿度为（50%10%）的环境下静坐至少 30 min 后，由专业人员进行初始值测试并记录，并分别于使用产品第 14、28 天后再次进行相同的测试并记录。（1）皮肤弹性测试在各个访视时点，用皮肤弹性测试仪测量测试区域的 R2 值，R2 值越大，皮肤弹性越好18。（2）皮肤皱纹及粗糙度测试利用多功能 3D 皮肤成像分析仪测定局部皱纹深度、宽度、总体尺寸平均值以及粗糙度 Ra值19，观察局部皱纹及粗糙度值使用产品前后的变化；各测量值越小，则皱纹改善效果越明显。（3）血红素超高浓度及泛红评分测试利用多功能 3D 皮肤成像分析仪测定局部血红素浓度及泛红程度具体数值20，观察局部血红素浓度及泛红程度使用产品前后的变化，测量值越低，则皮肤屏障功能越好21。（4）经皮水分流失（trans epidermal water loss，TEWL）值测试在各个访视时点，用 VapoMeter 型经皮水分流失测量仪测量测试区域的 TEWL 值，对比产品使用前后 TEWL 值变化情况。（5）面部成像通过面部图像分析系统拍摄受试者使用产品前后的照片，对比产品使用前后的效果。1.2.4 受试者自我评估符合要求的 30 名志愿者在第 28 天回访测试时填写问卷，问卷采用李克特 5 分制评分法。调查受试者对使用效果的满意度，5 分为非常满意、4 分为满意、3 分为一般、2 分为不满意，1 分为非常不满意。根据式（3）计算满意率。满意率=（非常满意+满意）的例数/总例数100%（3）1.2.5 统计学方法1.2.5.1 弹性蛋白抑制率、ROS 抑制率和人体功效测试统计学方法利用 SPSS 26 统计软件进行数据分析。统计第 2 期原料与配方王 玲，等：大米多肽在抗皱/修护护肤品中的应用及功效115www.ffc-分析前对各参数进行正态分布检验。符合正态分布则采用独立 T 检验，否则采用秩和检验，统计分析为双尾检验，显著性水平为=0.05。1.2.5.2 满意度问卷统计学方法利用 SPSS 26 统计软件进行数据分析。产品使用后满意度结果统计方法：统计 N 4 的满意度人数占比以及二项式分布显著性分析结果，显著性水平为=0.05。2 结果与讨论2.1 弹性蛋白酶抑制率测试结果图 1 为弹性蛋白酶抑制率试验结果，试验样品质量浓度为 100 mg/mL 时，其弹性蛋白酶抑制率为 31.56%，试验样品的抑制率高于空白对照组的抑制率，0.01 P0.05，具有统计学差异。说明试验样品能够有效抑制弹性蛋白酶活性，减慢弹性蛋白的降解速度，起到减少皱纹产生、延缓衰老的作用22。ROS 抑制率测试结果见表 2，试验样品体积分数为 2.00%时，试验样品的荧光强度显著低于空白对照样品，0.01 P0.05，差异具有统计学意义。试验样品的 ROS 抑制率显著高于空白对照样品，说明试验样品能够抑制 ROS 的产生，避免ROS 诱发的胶原蛋白及弹性蛋白的降解、炎症反应的发生等3，起到抗衰以及修护屏障功能的作用。表 2 受试物对 ROS 的抑制率组别与裸细胞荧光强度差（RFU）抑制率/%空白对照组6496.08/试验样品组4225.57*34.980.70注：*表示 0.01 P0.05。2.3 人体功效评价实验结果2.3.1 皮肤弹性 R2值测试结果图 2 为皮肤面颊处弹性测试结果，30 名受试者试用测试产品 14 天与试用测试产品前相比，皮肤弹性 R2 平均值改善率为 5.69%，0.001 P0.01；试用测试产品 28 天与试用测试产品前相比，皮肤弹性 R2 平均值改善率为 9.09%，P0.001，有显著的统计学差异。R2 值越接近 100%，皮肤弹性越好18。图 1 弹性蛋白抑制率测试结果（*表示 0.01 P0.05）2.2 ROS 抑制率测试结果细胞活性测试结果见表 1，试验样品在体积分数 2.00%以内未出现 HaCat 细胞毒性，选择样品体积分数为 2.00%作为后续的功效试验浓度。表 1 各组细胞相对活性（MeanSD）样品体积分数/%细胞相对活性/%0 100.001.685.00 33.492.372.00 93.020.761.00 109.921.160.50 115.502.530.10 113.491.52图 2 志愿者皮肤弹性变化注：*表示 0.001 P0.01，*表示 P0.001。4035302520151050弹性蛋白酶抑制率/%空白对照组试验样品组测试项目0.53%31.56%*100806040200皮肤弹性 R2 平均值/%D0D14D28测试时间点(+5.69%)*(+9.09%)*2.3.2 皮肤皱纹测试结果图 3 为眶下纹测试结果，30 名受试者试用测试产品 14 天与试用测试产品前相比，眶下皱纹总体尺寸、皱纹宽度和皱纹深度分别下降了 26.49%、9.78%和 15.20%（均为 P0.001，有显著的统计学差异）；试用测试产品28天与试用测试产品前相比，原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品116www.ffc-www.ffc-眶下皱纹总体尺寸、皱纹宽度和皱纹深度分别下降了 32.77%、10.29%和 17.84%（均为 P0.001，有显著的统计学差异）。由此说明，测试产品具有改善眼部皱纹、减少皱纹产生的效果（见图 4）。图 3 志愿者眶下皱纹变化注：*表示 P 0.001。图 4 志愿者眶下皱纹变化典型案例（a）D0 （b）D14 （c）D282.3.3 皮肤粗糙度测试结果眶下皮肤粗糙度（Ra值）测试结果见图 5，30名受试者试用测试产品 14 天与试用测试产品前相比，Ra值下降 7.84%，0.001 P0.01，有显著的统计学差异；试用测试产品 28 天与试用测试产品前相比，Ra值下降 11.82%，P0.001，有显著的统计学差异；由此说明测试产品具有改善皮肤粗糙度的作用，Ra值越小，说明皱纹改善越明显23。2.3.4 皮肤血红素超高浓度测试结果面颊皮肤血红素超高浓度测试结果见图 6，30名受试者试用测试产品 14 天及 28 天与试用测试产品前相比，血红素超高浓度分别下降 45.40%、71.90%，均为 0.001 P0.01，有显著的统计学差异，且随着试用测试产品时间的延长，血红素超高浓度呈逐渐降低的趋势（见图 7）。由此说明测试产品具有降低血红素超高浓度的作用，血红素超高浓度越低，皮肤屏障功能越好21。2.3.5 皮肤泛红评分测试结果面颊皮肤泛红评分值测试结果见图 8，30 名受试者试用测试产品 14、28 天与试用测试产品前相图 5 志愿者眶下皮肤 Ra值变化注：*表示 0.001 P0.01，*表示 P0.001。1.61.41.21.00.80.60.40.20.0皱纹宽度/nmD0D14D28测试时间点(-9.78%)*14121086420皱纹总体尺寸D0D14D28测试时间点(-26.49%)*(-32.77%)*(-10.29%)*0.050.040.030.020.010.00皱纹深度/mmD0D14D28测试时间点(-15.20%)*(-17.84%)*（a）皱纹总体尺寸（b）皱纹宽度（c）皱纹深度1086420Ra/mD0D14D28测试时间点(-7.84%)*(-11.82%)*第 2 期原料与配方王 玲，等：大米多肽在抗皱/修护护肤品中的应用及功效117www.ffc-（a）D0 （b）D14 （c）D28比，泛红评分值分别下降 13.13%、16.03%，均为0.001 P0.01，有显著的统计学差异，且随着试用测试产品时间的延长，泛红评分值呈逐渐降低的趋势（见图 9）。由此说明测试产品具有降低皮肤泛红的作用，皮肤泛红是皮肤屏障功能受损的表现之一，减少面部泛红，可促进皮肤屏障的修复24。2.3.6 TEWL 值测试结果面颊 TEWL 测试结果见图 10，30 名受试者试用测试产品 14 天与试用测试产品前相比，TEWL值下降 9.34%，无统计学差异；试用测试产品 28天与试用测试产品前相比，TEWL 值下降 11.96%，0.01 P0.05，有显著的统计学差异；由此说明使用测试产品 28 天具有降低 TEWL 值的作用，TEWL 值越小，说明皮肤屏障功能修护越明显25。图 6 志愿者面颊血红素超高浓度变化注：*表示 0.001 P0.01。图 7 志愿者面颊血红素超高浓度变化典型案例图像图 8 志愿者面颊泛红评分变化注：*表示 0.001 P0.01。面部泛红变化情况。使用测试产品 28 天后，受试者眼周皱纹明显减少、淡化，面部泛红程度明显减轻，进一步说明测试产品具有抗皱及修复皮肤屏障的作用。2.4 受试者主观评价结果在完成自我评估问卷的 30 名受试者中，使用测试产品 28 天后，认为皮肤皱纹淡化、纹理改善、屏障功能得到修护的志愿者比例分别为 78%、75%、78%，均为 0.001 P0.01，有显著的统计学差异；认为皮肤弹性更强、更细腻、水润度提高的志愿者比例分别为 88%、100%、97%，均为P0.001，有显著的统计学差异（见图 13）。由此说明测试产品具有改善皱纹、紧致肌肤、修护皮肤屏障的功效。3 结论大米多肽能够展现出有效的抗皱和皮肤屏障修护效果，含有大米多肽的护肤品能有效抑制弹性蛋白酶以及细胞内 ROS 的产生、提高人体皮肤2.3.7 面部成像典型案例通过采集受试者使用测试产品前后图片（图11 与图 12 为典型案例图片），对比眼部皱纹以及76543210706050403020100血红素高浓度泛红评分D0D0D14D14D28D28测试时间点测试时间点(-45.40%)*(-13.13%)*(-71.90%)*(-16.03%)*原料与配方2024 年 4 月香料香精化妆品118www.ffc-www.ffc-图 9 志愿者面颊泛红程度变化典型案例图像注：n.s 表示 P 0.05，*表示 0.01 P0.05。图 10 志愿者面颊皮肤 TEWL 值变化 （a）D0 （b）D28图 12 产品使用前后皮肤泛红变化典型案例图 （a）D0 （b）D28图 11 产品使用前后眼周皱纹变化典型案例图图 13 30 名受试者使用测试产品 28 天后对各项指标的满意率注：*表示 0.001 P0.01，*表示 P0.001。（a）D0 （b）D14 （c）D28302520151050TEWL/g （h m2）-1D0D14D28测试时间点(-9.34%)ns(-11.96%)*评价指标100%80%60%40%20%0满意率淡化皱纹皮肤弹性更强改善纹理皮肤更细腻提高皮肤水润度皮肤得到修护78%*88%*75%*100%*97%*78%*第 2 期原料与配方王 玲，等：大米多肽在抗皱/修护护肤品中的应用及功效119www.ffc-弹性、改善皱纹、降低血红素超高浓度及减轻皮肤泛红。体外研究结果显示，大米多肽护肤品对弹性蛋白酶的抑制率为 31.56%，显著高于空白对照组；与空白对照组相比，大米多肽护肤品对 ROS 的抑制率为 34.98%。人体功效研究结果显示，30 名受试者使用大米多肽护肤品 14 天后，与未使用产品相比，皮肤弹性改善率为 5.69%，眶下皱纹总体尺寸、宽度和深度分别下降了 26.49%、9.78%和 15.20%，皮肤粗糙度 Ra值下降 7.84%，血红素超高浓度与泛红评分分别下降 45.40%、13.13%，TEWL 值下降9.34%；28 天后，与未使用产品相比，皮肤弹性改善率为 9.09%，眶下皱纹总体尺寸、宽度和深度分别下降了 32.77%、10.29%和 17.84%，皮肤粗糙度下降 11.82%，血红素超高浓度与泛红评分分别下降 71.90%、16.03%，TEWL 值下降 11.96%。受试者主观评估结果显示，30 名受试者使用大米多肽护肤品 28 天后，认为皮肤皱纹淡化、纹理改善、屏障功能得到修护的志愿者比例分别为78%、75%、78%；认为皮肤弹性更强、更细腻、水润度提高的志愿者比例分别为 88%、100%、97%。体外功效、人体功效、主观评估结果结合面部成像表明含大米多肽的护肤品具有抗皱及修护肌肤屏障的效果。参考文献1 FLAMENT F,BAZIN R,LAQUIEZE S,et al.Effect of the sun on visible clinical signs of aging in Caucasian skin J.Clinical,Cosmetic and Investigational Dermatology,2013,6:221-232.2 KRUTMANN J,BOULOC 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