广东海风藤提取物HS2对阿尔茨海默病模型的药效学研究.pdf

目录中文摘要.1英文摘要.2英文缩略词.3前言.4AD的概况.4AD的病因学研究.5AD的发病机制.5AD的治疗现状.9AD动物模型的研究现状.16本研究的目的及思路.16第一部分HSz对体外培养海马神经元的影响材料与方法.19实验结果.23第二部分HS2对AD模型小鼠的治疗作用及其作用机理材料与方法.25实验结果.31讨论.38HSz对体外培养海马神经元的影响.38。-半乳糖和A1C13合并制备AD模型的探讨.38HSz对AD模型小鼠的治疗作用.42结论.43参考文献.44病理照片.52附录本文所用的基因序列.61在学期间发表的论文.63致谢.64暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究摘要目的研究广东海风藤提取物hs2对体外培养海马神经元的影响及对阿尔茨海默 病(Alzh e ime r sd ise ase,AD)模型小鼠的作用。方法(1)体外培养大鼠海马神经元，在培养液中加入低、高剂量HS2,通过细 胞形态学观察，突起和胞体生长状况的定量比较，不同培养期细胞存活数和乳酸 脱氢酶(LDH)渗漏量的测定，研究HS2对海马神经元生长发育的影响；(2)HSz最大耐受量的测定；(3)选用昆明小鼠，腹腔注射6半乳糖和灌胃三氯化铝,每天一次，连续90天，制备AD动物模型，第51天开始，治疗组分别灌胃低、中、高剂量HSz，连续40天。给药结束后，通过Mo r r is水迷宫、生化指标测定、逆转录聚合酶链反应及常规HE染色和ABio免疫组化染色，来观察HSz对AD 模型小鼠学习记忆、乙酰胆碱系统、脑内B淀粉样前体蛋白(APP)、早老素1(PS1)、B位点APP内切酶(BACE)基因表达和海马、皮层中老年斑的影响。结果(1)高剂量HSz可促进海马神经元生长发育；(2)小鼠口服HSz的最大耐 受量为126g kg“；(3)低、中、高剂量的HSz均能改善AD小鼠学习记忆，可 恢复脑内Ach、Ach E水平，下调APP、PS1和BACE基因的表达，减少老年斑 的生成。结论高剂量的HS2能促进海马神经元的生长；不同剂量的HS2能改善AD小鼠的 学习记忆能力和恢复脑内Ach、Ach E水平，降低APP、PS1和BACE mRNA的 含量，减少脑内AB沉积所形成的老年斑。关键词广东海风藤提取物；阿尔茨海默病；老年性痴呆；学习记忆；铝；B淀粉样 蛋白；老年斑；-1-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究AbstractObjectiveTh e ph ar maco d ynamics o f Kadsura heteroclita o n h ippo campal ne ur o ns and th e Alzh e ime r s d ise ase(AD)mo d e l mice we r e stud ie d.Methods(l)Th e r at h ippo campal ne ur o ns we r e cultur e d with 0.2、l.Omg,mL-1 HSz.Th e co nve r t ph ase micr o sco pe was use d to analyse th e numb e r and th e le ngth o f ne ur itis,as we ll as th e maximum d iame te r o f h ippo campal ne ur o ns so ma.Th e sur vival ne ur o ns co unt and lactate d e h yd r o ge nase(LDH)assay we r e car r ie d o ut in d iffe r e nt cultur e time.(2)Th e e xpe r ime nt o f HS2 maximum to le r ance d o se is mad e fo r mo use(po).(3)Th e Kung Ming mice we r e tr e ate d with P-galacto se and AICI3(90d)to make th e AD animal mo d e l.Th e th e r apy gr o ups we r e tr e ate d with HS2(po,40d)r e spe ctive ly since d 51.Th e Mo r r is wate r-maze te st,analysis o f Ach and Ach E activitie s,th e e xpr e ssio n o f APP,PSI,BACE,as we ll as th e path o lo gical o b se r vatio n o f th e h ippo campus and ce r e b r al co r te x we r e car r ie d o ut to e valuate th e e ffe ct o f HS2 o n th e AD mo d e l mice.Results(l)l.Omg,mL_1HS2 co uld pr o mo te th e gr o wth o f ne ur o ns.(2)Th e MTD o f HS2 is 126 g,kg.(3)By o r al ad ministr atio n with HS2,th e capacity o f le ar ning and me mo r y o f th e AD mo d e l mice was impr o ve d;th e co nte nt o f Ach and th e activitie s o f Ach E r e ach e d th e no r mal le ve ls.HS2 can d o wnr e gulate th e e xpr e ssio n o f APP,PSI,and BACE and d e cr e ase th e amo unt o f se nile plaque in th e ir b r ains.ConclusionsHS2,l.Omg mL-1,can pr o mo te th e gr o wth o f h ippo campal ne ur o ns.HS2 can me lio r ate AD mo d e l mice,le ar ning and me mo r y d e ficie ncy and sustain th e no r mal le ve ls o f Ach,Ach E,as we ll as d e cr e ase th e mRNA co nte nt o f APP,PSI,BACE and se nile plaque in th e ir b r ains.Key wordsKadsura heteroclita；Alzh e ime r s d ise ase；se nile d e me ntia；le ar ning and me mo r y；aluminium：a mylo id b e ta-pr o te in；se nile plaque；-2-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究主要英文缩略词英文缩略语英文全称中文全称ADAlzh e ime r s d ise ase阿尔茨海默病FADfamilial Alzh e ime r s d ise ase家族性阿尔茨海默病APPamylo id b e ta-pr o te in pr e cur so rB淀粉样前体蛋白ABamylo id B-pr o te inB淀粉样蛋白SPse nile plaque老年斑NFTne ur o fib r illar y tangle神经原纤维缠结BACEB-site APP-cle aving e nzymeB位点APP内切酶PSIpr e se nilin-1早老素1PS2pr se nilin-2早老素2Achace tylch o line乙酰胆碱Ch ATch o line ace tyltr ansfe r ase胆碱乙酰转移酶Ach Eace tylch o line ste r ase乙酰胆碱酯酶Ach EIace tylch o line ste r ase inh ib ito r乙酰胆碱酯酶抑制剂NGFne r ve gr o wth facto r神经生长因子LDHlactate d e h yd r o ge nase乳酸脱氢酶NSCne r ur al ste m ce ll神经干细胞DEPCd ie th yl pyr o car b o nate焦炭酸二乙酯EBe h th id ium b r o mid e溟化乙锭RT-PCRr e ve r se tr anscr iptio n po lyme r ase ch ain r e actio n逆转录聚合酶链反应-3-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究刖百一、AD的概况阿尔茨海默病(Alzh e ime r、d ise ase,AD)即老年性痴呆，是一种以进行性 认知功能障碍和记忆损害为特征的神经退行性疾病。表现为全面持久的智能减 退，包括记忆力、计算力、抽象思维能力和语言功能的减退，出现情感和行为异 常,丧失工作能力和独立生活能力。老年斑(se nile pl叫ue,SP)、神经原纤维缠 结(ne ur o fib r iHar y tangle,NFT)和基底前脑胆碱能神经元丢失为AD的主要病 理改变。随着世界人口的老龄化,阿尔茨海默病成为老年人中常见的一种痴呆症,已成为仅次于心脑血管，肿瘤之后又一严重威胁老年人生命健康的疾病。据国外 资料，AD患病率占老年人群4-5%,其中半数以上为老年性痴呆。国内报道，我国老年性痴呆患病率为4.36%,其中AD患者占2.8%口。研究AD的发病机理，开发治疗AD的药物，提高老年人生命质量成为当今生物医学研究领域的重大课 题。二、AD的病因学研究由于AD的病因和发病机制仍不是很清楚，治疗AD缺乏有效的药物。总的 来说，其病因包括内在遗传因素与外界环境因素两大方面。1.遗传因素AD病的遗传学研究表明，AD双亲及兄弟娣妹患AD的危险率比一般人群 高，单卵双生患者发病率比双卵双生发病率高数倍，其遗传方式可能为不全外显 性染色体显性遗传。目前已发现AD发病有关的四个基因，其基因突变或多态型 会使AD发病的危险性增加，分别是21、14、1、19号染色体上的8淀粉样前体 蛋白基因(Amylo id b e ta-pr o te in pr e cur so r,APP)、早老素 1 基因(pr se nilin-1,PS1)、早老素 2 基因(pr se nilin-2,PS2)、载脂蛋白 E4基因(apo lipo pr o te in E4 apo E4)R341APP、PSl、PS2基因主要与家族性阿尔茨海默病(familial Alzh e ime r s d ise ase,FAD)有关，FAD病人至少有其中之一的异常，大约10%的家族性AD 和2%散发性AD存在APP基因突变，而PS基因突变的患者则高达40%50%。Apo E与家族性AD和散发性AD都有关。由于老年斑的核心成分B淀粉样蛋白(amylo id B-pr o te in,AB)来源于APP基因编码的APP蛋白，因此有关这些基因-4-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究表达的调控及相互作用，特别是PSI、APP基因成为研究的热点。许多研究证实,AD患者中的这些基因即使没有发生突变，其表达量也是异常增高。2.环境因素并不是所有的AD患者都具有阳性家族史，真正发生以上基因改变的患者所 占的比例并不高，相当一部分患者从遗传学上是找不到任何线索，因此外界环境 危险因素在AD发病中也占有重要的地位。目前人们已发现一些环境因素能引起 AD患者发病率升高。大体上包括生物因素(如年龄的增长、病毒感染、高血压、糖尿病等)、物理因素(如脑外伤等)和化学因素(铝元素含量过高)。其中铝元 素的神经毒性与AD关系密切，在AD发病中的地位得到许多学者的肯定，已被 公认为AD的发病的重要环境危险因素。总之，AD病因很复杂，环境和遗传因素以哪一个为主？有人认为各占50%o Walle y认为：AD受常染色体的遗传和环境因素共同影响，导致发病的机理至少 有两种：每个人都可能带有AD的遗传基因，在某种特殊危险因素影响下，一 部分人会发生痴呆；环境危险因素是普遍存在的，部分人因为带有AD的遗传 基因，所以在这种环境中会发生早期痴呆网。目前，人们总结AD发病的危险因 素有三：1,老年；2,阳性家族遗传史；3,Do wn综合征晚期。年龄大于40岁 者，随着年龄的不断增长，体内有毒物质的蓄积，正常神经元功能逐渐老化，加 之遗传环境因素的相互作用和影响，最后可能导致AD。三、AD的发病机制由于AD病因的确很复杂，环境和遗传因素相互作用，最终导致AD,其具 体发病机制还不是很清楚，许多学者从不同的角度提出了多种发病假说，主要有 以下几种：1.胆碱能神经损伤假说研究表明，AD发病与多种中枢神经递质如乙酰胆碱(ace tylch o line,Ach)、5-羟色胺(5-h yd r o xytr yptamine,5-HT)、多巴胺(d o pamine,DA)兴奋性氨基 酸(EAAs)等的异常有关，其中胆碱能神经系统功能缺陷尤为突出，因为基底前 脑胆碱能神经元、海马、皮层和它们之间的通路，是学习记忆功能的重要结构基 础。AD患者基底前脑胆碱能神经元大量受损或死亡，突触前Ach的合成、胆碱 乙酰转移幅(ch o line ace tyltr ansfe r ase,Ch AT)的活性以及对胆碱的摄取能力都-5-暨大硕上毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究明显下降，这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关。因此认为脑 内胆碱能神经系统的退化是AD学习记忆功能减退的主要原因之一。2.铝元素中毒学说研究发现AD患者脑组织中铝含量增高，用原子吸收光谱仪测得铝在健康人 脑中是1.80.8mgg”(脑组织干重)，AD患者脑内铝的含量是3.62.9mg-gL 而一般大于4mg-g1即可引起神经细胞变性网。游离铝可以自由通过嗅神经和血 脑屏障进入脑组织的，在嗅球中含量最高，铝还可以损害血管内皮细胞而破坏血 脑屏障的完整性。铝进入脑内取代Ca?和Mg2+,同氨基酸链上的谷氨酸和精氨 酸结合形成谷氨酸铝盐或精氨酸铝盐的稳定复合物，在大脑皮质、海马、杏仁核 内富有谷氨酸神经元，铝多沉积于这些部位。铝在血液中可与转铁蛋白结合，在 大脑皮质、海马、室中隔和融叶杏仁处存在着许多转铁蛋白受体，故铝易沉积于 这些部位19网。动物实验结果表明，无论是家兔或大鼠经静脉、腹腔、皮下注射 或是经胃肠道等途径给予铝化合物，均可见动物脑铝含量明显增加，引起一系列 行为异常，动物出现认知和记忆障碍的时间也早于其它指标。与幼年动物相比，铝的行为毒性多见于成年和老年动物，年龄越大，对铝的行为毒性越敏感W】。铝 的毒性引起脑内神经原纤维变性形成缠结已有许多报道。De b o ni等给家兔皮下 注射乳酸铝或酒石酸铝30天以上，可见脑干、大脑皮层及海马锥体神经元中有 NFT形成【皿。铝中毒可影响脑内的神经递质的代谢，主要引起胆碱能神经元损 伤，导致胆碱神经功能减退，引起学习记忆功能减退，对NE、5-HT.氨基酸及 肽类等神经递质系统也有影响。铝通过改变神经细胞的钙稳态，提高脂质过氧化 损害细胞的作用，造成细胞结构和功能障碍，引起细胞的损伤和凋亡。铝引起脑 内B淀粉样蛋白基因表达的增多也有报道网。钱亦华网等用A1C13灌胃大鼠3个 月建立老年性痴呆鼠模型，通过免疫组化的方法，发现其背海马结构内各部分均 可见较多AB样免疫反应阳性神经元(B-amylo id pr o te in-like immuno r e activity,APLI),虽未有老年斑的形成，已说明铝引起AB在神经元内产生增多。铝引起 AB在神经元内的沉积的机制可能与铝元素引起APP过度表达，AB过多的产生 及铝元素促进糖基与AB的定位连接有关。鉴于此，大多数学者认为铝在AD发 病中起主要的作用，能够产生与AD相似的病理改变，形成铝元素中毒学说。Mclach an等还观察到三价金属螯合剂能减缓AD的病程【。但也有不少意见不-6-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究同的报道，认为铝元素在AD发病中的并不是一个主要因素。3.B淀粉样蛋白假说自从Alzh e ime r于1906年首次报道进行性记忆和认知功能减退的Ad患者以 来，以发现者名字命名的这种疾病一直困扰着人们。Alzh e ime r注意到病人的大 脑有神经原纤维缠结和血管外的老年斑病理改变，但不能区别这是其致病因子或 仅仅是疾病的标志物。直到20世纪末，随着分子生物学方法及相关科学的进步,才使人们能对AD有了一个更深的认识。1991年在基因相关分析研究中发现了 重要的线索:APP基因的错义突变导致了常染色体显性遗传的家族性阿尔茨海默 病,并且这些突变发生在APP的B淀粉样蛋白(AB)编码区网。近年来的研究 也多集中在形成老年斑的主要成分AB上，在其代谢的关键酶a、B、丫分泌酶(se cr e tase)的确立及其代谢的分子机制方面取得了一些进展。这些新发现加上 AB易于形成神经毒性的蛋白，支持AB的聚集导致大脑神经元功能障碍，出现 AD相应临床表现的B淀粉样蛋白假说0刀，目前AB及其代谢以及如何形成老年 斑成为AD研究的热点，大多数学者认为各种病因最终作用的结果是引起B淀粉 样蛋白代谢异常，表现为产生增加，去路减少，引起AB的沉积，引发一系列的 病理生理变化，最终导致AD的发生。因此B淀粉样蛋白的沉积是AD发病机制 的始发因素和中心环节，自然成为AD研究的主要方向和热点，同时也为冶疗 AD带来了新的药物作用靶点。3.1 AB的代谢AB来自一个大的前体蛋白APP,该蛋白是由21号染色体上的APP基因编 码，为一种含有多个功能区，以跨膜形式存在的I型糖蛋白。跨膜形式的APP 有2/3位于细胞外，其余1/3在膜内胞浆中网。可分为三个区：膜外区、跨膜区 和胞浆区。膜外区包括有肝素结合域-1、铜结合域-1、锌结合域-1、胶原蛋白结 合域、Kunitz蛋白抑制同源区以及a,B分泌酶的酶切位点等；跨膜区含有丫分 泌酶的酶切位点；胞浆区包括Go蛋白、笼形蛋白结合区和磷酸根、多种氨基酸 结合位点。APP在生物体内扮演多种角色，参与多种生理代谢活动，不仅参与凝 血过程，突触可塑性的调节和提高神经生长因子促生长作用，还有结合重金属和 肝素的特性。APP产生后在分泌前的作用下,生成一些新的蛋白质，包括a-APPs、B-APPs、-7-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HSz对AD模型的药效学研究C83、C99、P3、AB、P6等。这些蛋白质的功能目前还不是很清楚,其中AB为 老年斑的主要成分。APP第一步是被0或B分泌酶进行酶切，据此分为a分泌酶 途经和B分泌酶途径，可以决定是否产生AB。在a分泌酶途径中，a分泌酶从 APP的AB区中间切开，产生一个大的可溶性APP片段a-APPs和竣基端的C83 蛋白。由于酶切时已破坏形成完整AB的区域，所以不可能产生B淀粉样蛋白；第二步在Y分泌酶的作用下，酶切发生于两个酶切位点中任一个，C83被水解成 P340或P342及剩下的P6o在另一代谢途径B分泌酶途径即淀粉样蛋白形成途径 中,APP首先被B分泌酶裂解，产生一个大的可溶性片段B-APPs和竣基端的C99 蛋白；第二步和a分泌酶途经一样，也是在丫分泌酶的作用下，酶切丙氨酸713-苏氨酸714之间位点产生AB42,酶切缀氨酸711-异亮氨酸712之间位点产生的 将是AB40以及剩下的P6(2l。3.2 fi淀粉样蛋白假说的主要内容A%o和AB42为AB两种主要成分，两者只相差两个氨基酸残基，细胞产生的 AB40远多于AB42,两者均为老年斑主要成分。较长的AB42更具有疏水性，更易 于聚集形成淀粉样蛋白，在形成老年斑中占有更重要的地位】。经B分泌酶途 径产生可溶性的AB本身可能具有某种生理功能，如它能促进神经元轴突分枝和 营养作用122】。但是各种原因引起APP过度表达，APP产生过多，a分泌酶含量 或活性过低，8、Y分泌酶含量或活性过高，导致过多AB的产生。产生的AB清 除太慢，或与聚集因子相互作用，会促使可溶性AB的聚集成不可溶性蛋白。一 旦AB变为不可溶性，沉积在脑组织里即形成老年斑，此时AB便具有神经毒性，从而引发各种免疫炎症反应和神经毒性级联反应，引起广泛的神经元变性，甚至 死亡，主要在海马和大脑皮层，出现渐进性的神经递质减少，主要是胆碱能和多 巴胺能递质，最终导致记忆和认知功能障碍，产生AD症状1232支AB引起细胞 损伤、凋亡和死亡的具体机理主要为三方面：(1)引起细胞内钙超载，导致细胞 内环境失衡；(2)促进活性氧簇(r e active o xyge n spe cie s,ROS)的产生，启动 脂质过氧化，破坏离子稳态，导致线粒体功能障碍，ATP能量耗竭，产生“氧化 应激”；(3)继发的免疫反应，主要是小胶质及星形胶质细胞的激活，细胞因子 的释放，如IL-1,IL-6和肿瘤坏死因子a(TNF-a),产生细胞毒作用磔)。4.基因调控异常学说-8-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HSz对AD模型的药效学研究近年来大量研究表明，AD的发生与脑内多种调控基因的失调密切相关。AB 是AD病人脑内老年斑的主要成分，也参与神经元纤维缠结的形成。在AB沉积 发生过程中至少要经历以下几个关键性环节:APP基因f APPmRNAf APP-AB f AG沉积。任何一个环节的异常都可能导致APP的形成和AB的沉积。目前关 于AB沉积发生的机制尚不清楚，基因缺陷学说认为，APP基因发生突变，导致 APP代谢异常和AB在脑内的沉积。如上所述，在约1/4的家族性AD患者中发 现APP基因突变。在APP基因5端序列附近已发现数个调控因子，如热休克 蛋白(Hsp)、ILJ、NGF等，它们在AD患者脑内的合成均发现有不同程度的增 强。体外实验证实，这些调控因子具有刺激神经细胞生长和促进APP基因表达 的作用。因此基因调控异常学说认为，AB的沉积可能是由于上述调控因子的刺 激作用导致APP基因过度表达引起的，并推测这一过程可能出自于机体对某种 损伤的错误反应2句。除了 APP基因外，参与AB代谢关键酶的PS1和BACE基 因异常表达也与AB沉积关系密切。此外脑内其他基因如fo s和jun也与AD发 病有关。因此必需深入探明影响AD发生发展的基因种类、结构、功能及调控机 制，对从基因水平揭示AD的发病机制具有重要意义。5.其他学说还有自由基损伤，免疫功能异常，脑代谢障碍等学说。综上所述，尽管AD病因的研究取得了许多进展，特别是近些年在AB代谢 的关键酶a、B、Y分泌酶所取得的进展，使得人们更进一步深入了解AD发病 机制，也为药物治疗AD带来了希望。目前多数学者倾向于，B淀粉样蛋白的沉 积是AD发病机制的始发因素和中心环节，并以此为中心做了大量的研究。但由 于神经元退行性变、凋亡最终死亡是一个相当复杂的过程，受多种因素影响，难 以区分哪些变化是原发性的，哪些变化是继发性的，往往是多种因素相互交织作 用的结果，因此必须更深入研究AD病理生理及发病机制。四、AD的治疗现状关于AD的治疗，Wh ite h o use提出3个方面的设想【2刀：短期的治疗设想：是指代替或促进现有神经元的功能，主要指神经递质系统；中期的治疗设想：是防止神经元死亡以延缓疾病的进展；远期的治疗设想：进一步阐明AD的病 因，控制AD的发病过程，从而预防、改善或阻止该病的进展。由于AD的发病-9-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究机制仍不十分清楚，因此还缺乏明确有效的根治手段，尤其是对中、晚期痴呆患 者，疗效更不理想。现有的治疗手段仍以对症药物治疗为主，只能达到短期改善 症状的目的。另外也出现了一些新的作用于AB靶点的药物，比较有希望达到远 期治疗的设想。但目前这些药物主要在实验室阶段，离临床还有一定的距离。根 据药物其作用机理的不同分为以下几类：1.脑内胆碱酯酶抑制剂胆碱能神经系统受损是AD三大病理改变之一，是公认的发病原因。因此基 于该发病机制的胆碱能替代疗法主要是为了提高脑中Ach的水平，恢复胆碱能 神经传导，从而改善患者的记忆、认知和行为能力。目前临床上使用较多的是作 用于突触间隙的乙酰胆碱酯酶抑制剂(ace tylch o line ste r ase inh ib ito r,Ach EI),通 过抑制Ach E的活性来间接延长Ach的作用时间。他克林(tacr ine)同是美国FDA 于1993年批准用于治疗AD的第一个药物，能改善轻、中度AD患者的语言、认知、理解能力，但是该药的肝毒性比较明显，限制了其应用。随后各国开发了 许多中枢选择性更高、副作用更小的Ach EI,如盐酸多奈哌齐(Do ne pe zil Hyd r o ch lo r id e)、利伐司明(r ivastigmine)阴、石杉碱甲州(h upe r zine A)等。由于胆碱能替代疗法只是对症治疗，短期的治疗。促进和增强剩余没有受损的或 者受损不太严重的的神经元的功能，不能使患者完全恢复。发挥作用时患者已发 生严重病理改变，不能从根本上阻止该病的形成。2.神经营养因子神经营养因子如神经生长因子(ne r ve gr o wth facto r,NGF)和脑源性神经营 养因子对神经细胞有保护作用，是促进神经系统发育和维持神经系统功能的重要 蛋白质，能降低胆碱能神经元变性的比率，改善存活脑细胞的功能状态。许多试 验表明，NGF对中枢胆碱能神经元有营养作用，可阻止基底前脑损伤所致的胆 碱能神经元变性和死亡，改善老年动物识别功能障碍，逆转认知功能下降卬】，但NGF分子量大，不易透过血脑屏障，造成治疗上的困难。Backman等将转铁 蛋白受体抗体(tr ansfe r r in r e ce pto r antib o d y)OX-26作为载体与NGF共价结合形 成复合物，借转铁蛋白的跨膜转运使NGF穿过血脑屏障。试验表明老龄大鼠静 脉注射OX-26-NGF复合物后可抑制胆碱能神经元萎缩，改善大鼠空间学习能力 33,o NGF的作用还受其它激素、因子的调节，如白介素-1、糖皮质激素、甲状-10-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HSz对AD模型的药效学研究腺素、神经节昔脂GM1等，因此较好的途径是使用能促进脑内NGF生物合成的 药物来治疗ADo3.以AB为靶点的药物B淀粉样蛋白假说已越来越为大多数学者所认可,B淀粉样蛋白的沉积是AD 病理的始发因素和中心环节。因此纠正B淀粉样蛋白的反常代谢，减少AB的产 生，包括从APP基因转录开始，抑制其转录可以基因水来减少APP蛋白的生成,产生的AB,加快其消除，阻止AB聚集和形成有毒性的淀粉纤维，对抗AB的毒 性和抑制它所引起的免疫炎症反应都可以成为治疗的策略。无论是直接或间接的 治疗方法，都离不开AB的参与。以AB为靶点的药物，是作用于AB代谢的各 个环节以达到减少其生成，加快其清除，已产生的AB要对抗聚集、毒性作用以 及抑制后续免疫反应。由于以AB为靶点的药物是治疗AD的根本出路，近年来 发展极快，成为人们开发新药的热点。而作用于B淀粉样蛋白代谢的分泌酶则是 重中之重，已有许多的报道。目前这些药物处在实验研究阶段，离真正进入临床 还有一定的距离。3.1 阻遏相关基因的表达针对基因调控异常学说，阻遏相关基因的异常表达。老年斑的核心成分B 淀粉样蛋白来源于APP基因编码的APP,因此如果能够抑制基因的转录及翻译，就能相应的减少其产生，使AB的来路减少。APP基因水平上的调节，目前还不 清楚，至少在FAD中，AB产生增多是由于其基因突变所引起的。虽然BACE 和PS1基因不影响APP的基因表达，但其转录产物参与了 AB的代谢，因此抑 制BACE和PS1基因的表达同样可以达到减少AB生成的目的。3.2 分泌酶与AD的治疗B淀粉样蛋白在AD的发病中起着至关重要的作用，如何才能更加有效的减 少AB的产生。许多学者都看好作用于AB代谢的关键酶一分泌酶，以分泌酶为 靶的AD治疗药物，能从源头上减少AB的产生，从根本上阻止AD的发展。为 了减少Afi的产量，理论上有三个途径：1.a分泌酶的激动剂，可以使APP避免 经过B分泌酶途径，减少AB的产生；2.B分泌酶抑制剂；3.Y分泌酶抑制剂。第一个途径是需激动分泌酶，而不是抑制分泌酶。现在已找到两个候选的a 分泌酶，即来自解整联蛋白-金属蛋白酶（a d isinte gr in and me tallo pr o te ase,-11-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HSz对AD模型的药效学研究ADAM)家族的肿瘤坏死因子 a 转化酶(tumo r ne cr o sis facto r-a co nve r ting e nzyme TACE o r ADAM-17)和 ADAM-10。TACE 作用于 TNFa 前体蛋白,释放其胞外区域，生成TNF-a(tumo r ne cr o sis facto r-a),和a分泌酶作用APP 的过程相似。抑制TACE的活性或是敲除TACE基因都会减少a-APPs的产量。蛋白激酶C(pr o te in kinase C PKC)激动剂，如佛波脂(ph o r b o l e ste r s)可以提 高细胞a-APPs的产量，提示PKC在a分泌酶途径中起调节作用网。进一步研 究表明PKC信号级联反应激动a分泌酶途经与神经递质受体的激动相耦联，同 时也会激活B分泌酶途径13叫a分泌酶激动剂是一个减少AB间接途径，没有研 究表明a、B分泌酶的酶切是互相排斥的，它引起神经递质受体激动所带来的对 机体的影响远远大于APP的代谢的影响。因此主要的抗B淀粉样蛋白沉积途径 是以2、3途径为基础的的。B、Y分泌酶抑制剂的应用也会带来一些问题，由于B、Y分泌酶存在于机 体许多不同的组织细胞中，它们除了 APP底物外可能还有其他底物，参与其他 物质的代谢。因此，需要长期治疗的AD病人，完全的抑制可能会导致毒性反应。由于B、Y分泌酶是AB产生的关键酶，部份的抑制仍然是有效的治疗。阻断AB 的来路也就打断了 AB沉积的恶性循环，可以启动自身的清除机制去清除已存在 的老年斑，而达到提高疗效的目的卬还有一个问题是大脑结构的特殊性，B、Y分泌酶抑制剂必须通过血脑屏障，进入脑内才能发挥作用。3.2.1 B分泌酶及其抑制剂B分泌酶是产生AB的第一个关键酶，直到最近才确立其身份。1999年，四 个不同的制药公司和一个学院实验室各自独立报道了 B分泌酶的确立，在这些报 道里，B分泌酶被分别被称8位点 APP内切随(B-site APP-cle aving e nzyme,BACE),BACE1天冬氨酰蛋白水解酶2(Aspar tyl pr o te ase 2,asp2),膜系冬氨 酸蛋白酶 2(Me mb r ane-asso ciate d aspar tic pr o te ase 2,me mapsin 2)0 确认 B 分泌 酶为一个共501个氨基酸的跨膜天冬氨酸蛋白酶，包括一个接近竣基端的跨膜 区，信号序列以及氨基端的前体蛋白区域。两个天冬氨酸，D93和D289,是保 持活性所必须的因4叫BACE的基因位于11号染色体，但家族性AD导致的基 因突变并没有发生在此基因上。BACE的mRNA在人类各种组织中均能表达，在胰腺和大脑表达最高，神经元BACE mRNA的水平较神经胶质细胞的高四团-12-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HS2对AD模型的药效学研究42)。BACE蛋白N-糖基化的，胞膜可以检测到，但主要存在于内质网和高尔基 体中，不具有自我激活的能力【4六第一个化合物StatV,对B分泌酶的抑制能力(IC50约为30nM)mi。利用瑞 典双突变型APP的基本序列ValAsnLe u.AlaAlaGluPh e,切去亮氨酸-丙氨酸之 间的肽链，代之以羟基过渡态类似物，成为抑制B分泌酶经典的策略【4 3这样 合成的OM99-1和OM992抑制重组人B分泌酶的K,分别68nM和lOnMo对组 织蛋白酶D(cath e psins D),胃亚蛋白酶(gastr icsin)等其他天冬氨酸蛋白酶的抑 制能力较差H习。B分泌的与抑制剂OM99-2结合的X射线晶体衍射结构已确立，这个抑制剂定位于酶分子结构骨架的裂口中，更深入的研究则显示抑制剂的羟基 基团与两个具有催化活性的天冬氨酸(Asp)32、Asp228相互作用附乙肽醛 S1B-1281选择性抑制B分泌酶的IC50为0.8 u M1471o 3.2.2 Y分泌酶及其抑制剂Y分泌酶的酶切是产生AB的的最后一步，对产生AB40和AB42的比例起着 关键作用。Y分泌酶到现在还没确立，主要是它有一些不同寻常的特性。它的酶 切位点在底物的跨膜区，与底物怎样接触发生催化反应仍不清楚。而且它似乎是 一个多蛋白构成的混合物，使得想通过基因克隆的方法纯化难以成功。Y分泌酶 表现出天冬氨酸蛋白酶的特性：在培养的细胞中，模仿天冬氨酸蛋白酶催化过渡 态的底物复合物能够阻断Y分泌酶的活性I4%进一步的了解来自于基因敲除动 物，在早老素1(pr e se nilin 1,PSD基因敲除的小鼠中Y分泌酶的活性降低80%,证明早老素1参与了 Y分泌酶的酶切过程伸力。位于早老素1跨膜区六、七的两 个天冬氨酸残基为AB产生所必须。因此，推测早老素1本身就是丫分泌酶，一 个新的跨膜天冬氨酸蛋白酶【5支但有一个空间上的矛盾，在亚细胞水平早老素 似乎被限制在早期转运室(e ar ly-tr anspo r t co mpar tme nts),而Y分泌酣主要是在后 期转运室(late-tr anspo r t co mpar tme nts)和内质网中。而且早老素似乎没有与己知的 天冬氨酸蛋白酶具有相似性，两个关键的天冬氨酸残基并不具有Y分泌酶的活性 l5，,o早老素可能是作为Y分泌酶的催化成分参与其水解过程，它的酶切位点位 于丫分泌酶前体蛋白，能水解阻碍Y分泌酶产生活性的前体蛋白区域，从而激活 Y分泌酶。这个前体蛋白区域的剪切、丢失或突变都会导致有活性的Y分泌酶的 产生叫-13-暨大硕士毕业论文广东海风藤提取物HSz对AD模型的药效学研究早老素不仅参与APP的水解过程，而且是No tch代谢过程中的关键因素。No tch与APP代谢非常相似：它们都能被肿瘤坏死因子a转化酶酶切，而且在早 老素蛋白参与的情况下，能被Y分泌酶样的蛋白酶所作用。给予Y分泌酶抑制剂 或是PS1上起催化作用的冬氨酸基团的突变，也减少了 No tch信号及No tch跨膜 区域的蛋白(No tch intr ace llar d o main,NICD)的产量倒。由于APP与No tch之 间的相似，使用丫分泌酶抑制剂治疗AD会干扰No tch信号系统。因此Y分泌酶 抑制剂应有很好选择性，才能避免这样的问题。目前，Y分泌酶抑制剂已有许多报道，按其核心结构可分为为五类，分别为 肽醛(pe ptid e ald e h yd e s)类、双氟酮(d ifluo r o ke to ne s)类、甲基丙烯酸类似物(h yd r o xye th yl analo gue s)氨磺酰封胺(fe nch y lamine sulfb namid e)类、其他类 等图】，它们采用的大都是体外培养的转APP基因细胞分析系统，来检测抑制剂 对APP的代谢的影响。