牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制.pdf

第45卷第12 期2023年12 月doi:10.3969/j.issn.1008-0589.202212010牛病毒性腹泻病毒抗原胶体金快速检测试纸条的研制中国预防兽医学报Chinese Journal of Preventive Veterinary MedicineVol.45,No.12Dec.2023卜庆龙12，左之才，才冬杰，叶刚，田斌，李伟强，苟丽萍，王娅，邓俊良!（1.四川农业大学动物医学院/动物疫病与人类健康四川省重点实验室，四川成都6 11130；2.山东畜牧兽医职业学院宠物科技学院，山东潍坊2 6 10 6 1)摘要：为建立一种快速准确且便携的检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法，本研究将制备的BVDV单克隆抗体(MAb)作为检测线(T线，以纯化的免源多克隆抗体作为金标蛋白，以羊抗兔IgG-HRP作为质控线(C线)，组装成双抗体夹心胶体金层析试纸条，并优化各反应条件。结果显示，最适金标蛋白标记量为30 g/mL，BVD VMAb和羊抗兔IgG-HRP最佳浓度均为0.5mg/mL。利用猪瘟病毒(CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛丘疹性口炎病毒(BPSV)及BVDV临床分离株评估该试纸条的特异性，结果显示，除阳性对照和BVDV临床分离株检测为阳性外，其余病毒均为阴性，表明该试纸条的特异性较强，无交叉反应。将BVDV-NADL株(10 6 6 ELDs/mL)10倍倍比稀释后，利用该试纸条检测，结果显示其最低检出量为10 46 ELDso/mL。利用同一批次和不同批次制备的试纸条对CSFV、IBRV、BPSV、BVD V临床分离株检测，结果显示检测结果均一致，表明该试纸条的重复性良好。将制备的试纸条应用于检测临床采集的6 8 份牛血清样品，并以RT-PCR方法同时检测，结果显示胶体金试纸条对BVDV的阳性检出率为17.5%(12/6 8)，RT-PCR对BVDV的阳性检出率为2 6.5%(18/6 8)，两者之间的总符合率为88.24%。本研究于国内首次采用双抗体夹心方式制备了检测BVDV的胶体金免疫层析试纸条，该方法方便快捷，特异性及敏感性均较好，适宜于牛场BVDV的快速筛选，为进一步研制BVDV胶体金检测试剂盒提供了实验依据。关键词：牛病毒性腹泻病毒；双抗体夹心；胶体金层析技术；检测；试纸条中图分类号：S852.65文献标识码：A文章编号：10 0 8-0 58 9(2 0 2 3)12-12 53-0 5Development of colloidal gold test strip for rapid detectionof BVDV antigenBU Qing-long2,ZUO Zhi-cai,CAI Dong-jiet,YE Gang,TIAN Bin,LI Wei-qiang,GOU Li-ping,WANG Ya,DENG Jun-liang(1,School of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University/Sichuan Key Laboratory of Animal Disease and Human Health,Chengdu 611130,China;2.Shandong Animal Husbandry and Veterinary Vocational College,Weifang 261061,China)Abstract:In order to establish a clinical rapid and portable method for the detection of bovine viral diarrhea virus(BVDV),amonoclonal antibody(MAb)against BVDV prepared in our laboratory was used as the T line,the gold-labeled polyclonalantibodies obtained from white rabbit immunized with purified BVDV was used as the standard,and the sheep anti-rabbitHRP-IgG was used as the C line to assemble into a double antibody sandwich colloidal gold chromatography reagent strip and*Corresponding author收稿日期：2 0 2 2-12-11基金项目：国家重点研发计划资助(2 0 2 1YFD1600200)；国家现代农业产业技术体系资助(肉牛耗牛，CARS-37)；四川省自然科学基金(2 0 2 2 NSFSC1620)作者简介：卜庆龙(1994-)，山东济南人，硕士，助教，主要从事中兽医与中兽药研究.*通信作者：E-mail:；d o n g j i e _ c a i s i c a u.e d u.c n；947 112 3 q q.c o m1254中国预防兽医学报2023年optimized the reaction conditions.The results showed that the optimal protein labeling amount was 30g/mL,and the optimalconcentration of the C and T lines was 0.5mg/mL.Serum against swine fever virus(CSFV),bovine infectious rhinotracheitis virus(IBRV)serum,bovine papular stomatitis virus(BPSV)isolate,or BVDV clinical isolate was used to evaluate the specificity of thetest strip.The results showed positive results for the positive control and BVDV clinical isolate,and the rest were negative,indicating that the specificity of the test strip was strong and there was no cross-reaction.The minimum detection amount of thisstrip is 1046ELDso/mL.The prepared test strips were applied to 34 bovine serum samples collected in clinical practice,and theRT-PCR method was used as the control for comparison.The results showed that the positive detection rate of colloidal gold teststrips was 17.5%(12/68),and the positive detection rate of RT-PCR was 26.5%(18/68).Thus,the consistency rate between thetwo methods was 88.24%.In this study,the double antibody-based sandwich method was used to prepare BVDV colloidal goldimmunochromatography test strips for the first time in China,which was convenient and fast,with good specificity and sensitivity,which was suitable for the rapid screening of BVDV in cattle farms.It provided specific techniques for the further development ofBVDV detection kits.Key words:bovine viral diarrhea virus;double antibody sandwich;colloidal gold chromatography;detection;test strip牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BV D)是由BVD病毒(BVDV)引起牛的急性接触性传染病。患BVD的牛表现为精神沉郁、采食下降、急性出血综合征、泌乳量急剧下降、黏膜病、肠胃炎、腹泻、大量流涎、流产甚至死亡等临床症状2 3。根据BVDV 5非编码区(5 UTR)或者Npro蛋白基因型的不同，该病毒分为BVDV-1型和BVDV-2型，以及新发现的BVDV-3型。BVDV持续性感染(Persistent in-fection，PI)牛长期携带病毒并排毒是造成该疫病难以控制的主要因素，给全球养殖业造成了重大经济损失。BVDV具有很高的突变率，尤其是其结构蛋白E2极易发生变异，造成疫苗免疫效果不佳。注射疫苗、合理检测、及时淘汰阳性牛是现今防控BVD的主要手段5-。目前检测BVDV的主要方法有病毒的分离与鉴定、电镜观察、免疫荧光和免疫组化、PCR、琼脂扩散试验、ELISA等7-8 。但这些检测方法对人员要求较高，或者操作繁，受限于场地等因素。因此呕需研发一种简单便携、快捷且特异性强的检测方法。利用免疫胶体金层析技术(Colloidal gold im-munochromatographic assay，G I CA)制备的检测试纸条具有操作方法简便、安全环保、便携等优点，已广泛应用到多种病原检测中9。但目前为止，我国尚无BVDV抗原胶体金检测试纸条的研究报道。因此，本研究采用双抗体夹心的方式组装检测BVDV抗原的胶体金试纸条，为BVD诊断、BVDV筛查提供简便快速的检测方法。1材料与方法1.1主要实验材料BVDV-1型单克隆抗体(MAb)、多克隆抗体(PAb)均由本研究室制备并保存。BVDV-NADL(BVDV-1)株、BVDV-1b型临床分离株10)、牛丘疹性口炎病毒(Bovine papular stomatitis virus，BPSV)、胎牛血清为实验室保存；猪瘟病毒(Classi-cal swine fever virus，CSFV)、牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV)，购自中国兽医药品监察所。胶体金、吸水纸、NC膜、PVC板、金标垫均购自北京吉森生物科技有限公司；pH试纸等均购自成都浩博优科技有限公司。6 8 份牛血清样品采自四川省广安市和邛崃市。1.2PAb最适标记浓度的优化分别于96 孔板中，每孔加入2 0 0 L的pH9.0的胶体金溶液，将PAb溶液用PBS稀释至1mg/mL，然后2 倍倍比稀释至12 8 倍，从第一个孔开始以2 2 L/孔，分别加入8 个孔中，震荡10 min，第9个孔只加2 0 0 L胶体金溶液作为阴性对照，第10 孔加入2 0 0 L胶体金溶液和2 0 L10%NaCl作为阳性对照，除阳性对照外，每孔均加入10%NaCl20L，震荡10 min后静置2 hll。观察颜色变化，第一个保持红色不变时加入PAb的量即为金标记浓度，一般在此基础上增加2 0%用量作为最佳标记浓度。按照最佳标记浓度的PAb，参照文献12制备金标抗体，将处理过的金标垫(金标垫浸入金标垫处理液浸泡30 min，37 烘干)放入重悬液中浸泡30 min，37 烘干，4避光保存。第12 期卜庆龙，等.BVDV抗原胶体金快速检测试纸条的研制12551.3胶体金试纸条各反应条件的优化13，采用方阵法对质控线(C)处羊抗兔IgG-HRP浓度(1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.2 5 mg/mL、0.12 5 mg/mL、0.0625 mg/mL)，检测线(T)处BVDV-1 MAb浓度(2 mg/mL、1 m g/m L、0.5 m g/m L、0.2 5 m g/m L、0.125mg/mL、0.0 6 2 5m g/m L)进行优化，分别观察C线和T线显色情况，取能够发生显著颜色反应的浓度为最佳浓度。1.4特异性试验买采用上述优化后的最佳浓度的PAb、I g G-H RP、M A b，按照常规操作组装胶体金试纸条后，检测CSFV、IBRV、BPSV、BVD V-1b 型临床分离株，试验以BVDV-NADL株血清作为阳性对照，胎牛血清为阴性对照，分别以8 0 L/孔加样，10min后观察显色情况，评估制备的胶体金试纸条参照文献时T线仍清晰可见，为得到良好的临床检测效果，确定MAb最适浓度为0.5mg/mL(图3)。2318：PA b 的2 倍倍比稀释(2 2)；9：阴性对照；10：阳性对照1-8:2-fold dilution of PAb(2-2);9:Negative control;图1PAb最适标记浓度的优化Fig.1Screening for the optimal amount of PAb1mg0.5mgC410:Positive control0.25mg5670.125mgC890.0625mgCT10的特异性。1.5敏感度试验将BVDV-NADL株(10 6 ELDs/mL)用PBS缓冲液分别10 倍倍比稀释后，以8 0 L/孔加样，10 min后观察显色情况，评估制备的胶体金试纸条的敏感性。图2 胶体金试纸条最适IgG-HRP浓度的优化1.6重复性试验采用同一批次的试纸条检测CS-Fig.2 Screening of IgG-HRP concentration for C-line ofFV、I BRV、BPSV、BV D V 临床分离株，以BVDV-NADL株作为阳性对照，胎牛血清为阴性对照进行批内重复性检测，每个样品重复3次；采用3个不同批次的试纸条对上述6 株样品进行批间重复性检测。对上述检测结果进行分析，评估该试纸条的重复性。1.7?试纸条的临床应用取四川省广安市和邛崃市采集的临床牛血清样品6 8 份，利用制备的胶体金试纸条检测，并与RT-PCR检测结果进行对比4，计算二者之间的总符合率，符合率=(A+D)/(A+B+C+D)x100%（A：真阳性；B：假阳性；C：假阴性；D:真阴性)。2结果2.1胶体金试纸条优化结果各反应条件经优化离株及阳性对照均为阳性，CSFV、I BRV及胎牛血后，结果显示，PAb浓度为2 5g/mL时胶体金保持清均为阴性(图4)，表明本研究所制备的胶体金试纸红色不变，在此基础上适当将其增加2 0%浓度，即条特异性较强。最适PAb标记浓度为30 g/mL（图1)；羊抗兔2.3胶体金的敏感度性试验结果将BVDV-NADLIgG-HRP浓度为0.2 5mg/mL时仍可看到C线，但在临株10 倍倍比稀释后，利用本研究制备的胶体金试纸床检测中可能会出现胶体金滞留现象导致显色较浅条检测，结果显示，10 0 倍稀释后仍能够清晰观察到或者不显色，因此选择0.5mg/mL为最适羊抗免检测线，即该胶体金试纸条检出限为10 4.6 ELDs/mLIgG-HRP浓度(图2)；BVDV MAb在0.2 5 mg/mL浓度(图5)，表明该胶体金试纸条的敏感性较高。colloidal gold strips2mg1mg图3胶体金试纸条最适MAb的优化Fig.3 Screening of MAb concentration for T-lines ofcolloidal gold strips2.2特异性试验结果利用制备的胶体金试纸条分别检测临床常见病原，结果显示，BVDV-1b临床分0.5mgC0.25mgC0.125mgCT0.0625mgC1256中国预防兽医学报2023年3 讨 论12356BVDV是牛场的常发病，我国将其定为二类传染病。可根据BVDV是否致细胞发生病变将其分为细胞病变型和非细胞病变型，本实验选用了BVDV-SNADL株和BVDV临床分离株，其中BVDV-NADL株为致细胞病变型，感染细胞后会致细胞发生空泡，1:CSFV；2：I BRV；3：BV D V-1b 型临床分离株；4：BPSV;5：阳性对照；6：阴性对照1:CSFV;2:IBRV;3:BVDV clinical isolate;4:BPSV;5:Positivecontrol;6:Negative control图4胶体金试纸条的特异性试验结果Fig.4Specificity of colloidal gold strips1:11:10图5胶体金试纸条的敏感性试验结果Fig.5 Sensitivity results for colloidal gold strips2.4重复性试验结果利用同一批次和不同批次制备的胶体金试纸条对6 份病毒样品检测，每个样品做3次重复检测，结果显示对6 份病毒样品的批内批间重复性检测结果均一致。表明该胶体金试纸条的重复性良好。2.5临床应用结果对临床采集的6 8 份牛血清样品采用本实验制备的胶体金试纸条检测，结果显示，共检测出12 份阳性血清样品，56 份阴性血清样品；同时采用RT-PCR检测，结果为阳性血清样品18 份，阴性血清样品50 份，对两者检测结果比较并计算，二者总符合率为8 8.2 4%（表1)。表明本研究制备的该胶体金试纸条可以用于临床样品检测。表1临床样品的检测结果Table 1Detection results of clinical samplesRT-PCR临床样品阳性样品数阴性样品数Clinical samplesPositivesample No.阳性样品数11GICAPositive sample No.阴性样品数Negative sampleNo.总数Total溶解和死亡15。BVDV分离株经鉴定为BVDV-1b基因型，为非致细胞病变型BVDV，该基因型BVDV是导致牛场PI牛的主要原因U。PI 牛持续性的带毒排毒，是导致BVDV难以净化的主要原因，且PI牛体内一般不产生抗体，如梅力等研发了BVDV抗体胶体金检测试纸条，敏感性较高，但是抗体检测试剂1:1001:1000Negativesample No.174918501:1000符合率总数CoincidenceTotalrate1261.11%5698%6888.24%盒针对PI牛的检测效果不佳17 ，所以采用抗原检测试剂盒对于牛场的净化更具有实际意义18 。目前国内售的BVDV抗原检测试剂盒大多是基于ELISA检测方法，如胡俊英等制备了BVDVE2蛋白的MAb和PAb，并分别利用这两种抗体建立了双抗体夹心ELISA19；蒋颖等利用纯化的BVDV获得的MAb并由此建立了双抗体夹心ELISA20。但当前尚无关于BVDV胶体金抗原检测试纸条的报道，因此本实验采用抗原检测试纸条来进行BVDV的检测与净化。本研究采用双抗体夹心的方式，研制了针对BVDV抗原的检测试纸条并优化了各反应条件。该试纸条在其临床应用中也发现了一些问题，如其阳性检出率不高，有一些弱阳性未检出，推测可能是胶体金加入的抗原与抗体在短时间内结合，无法充分反应，导致胶体金试纸条灵敏性较ELISA、RT-PCR低的原因2 1；也可能是由于该MAb是通过纯化的BVDV-NADL株免疫小鼠，经过筛选获得的杂交瘤细胞，其稳定性可能较差，不过其优势是增加了获取优质阳性杂交瘤细胞的可能性2 2 。胶体金免疫层析试纸条被广泛应用于疾病监测，妊娠检测，农药、兽药残留，环境指标检测等方面2 。该试纸条作为一种常见的检测方法，其最大的优点就是快速，一般可以在5min10 m in 即可以得出结果，而且无需借助仪器，仅凭肉眼便可得出结论，且携带方便，对人员要求不高。而且胶体金检测试纸条成本低，可以大批量生产，既可以针对单个牛进行检测，也可以对养殖场进行规模化的检测；既可以检测全血，也可以检测唾液、尿液、乳液等分泌物，而且金标试剂一般较为稳定，可以第12 期卜庆龙，等.BVDV抗原胶体金快速检测试纸条的研制1257在低温条件下长时间保存。但由于加入样品中的抗原与抗体在短时间内无法充分反应并结合，常造成灵敏性比ELISA、RT-PC R较低。本实验样品检测时虽然胶体金试纸条的检出率没有RT-PCR高，但该试纸条敏感性和重复性良好。在特异性方面，本实验制备的胶体金试纸条不与CSFV、I BRV、BPSV 发生反应，仅与BVDV-NADL株和BVDV分离株发生反应，既可以与致细胞病变型BVDV发生反应，又可以与非致细胞病变型阳性血清反应，具有良好的特异性，且由于其成本低廉、方便、不需要昂贵仪器以及耗时短的特点，所以该胶体金试纸条仍具有重要的使用价值。本实验首次采用双抗体夹心法制备了检测BVDV抗原的胶体金试纸条，对于BVDV的快速检测、筛查，以及后续的BVDV试剂盒的研制具有一定的指导意义。参考文献：1 SMITH D B,NEYERS G,BUKH J,et al.Proposed revision tothe taxonomy of the genus Pestivirus,family Flaviviridae J.JGen Virol,2017,98(Pt8):2106-2112.2 王以欣，姜晓霞，孙晓波，等。牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体的制备及其在该病毒检测中的应用J.中国预防兽医学报，2 0 2 2，44(6)：6 2 4-6 2 9.3陈姗，马浩原，付藐锋，等.延边地区牛病毒性腹泻病毒YBHC株的分离鉴定与遗传进化分析J.中国预防兽医学报，2 0 2 2，44(3)：32 5-32 8.4 BAUERMANU F V,FALKENBERG S M,VANDER LEY B,et al.Generation of calves persistently infected with HoBi-likepestivirus and comparison of methods for detection of these per-sistent infections J.J Clin Microbiol,2014,52(11):3845-3852.5 SCHARNBCK B,ROCH F F,RICHTER V,et al.A meta-anal-ysis of bovine viral diarrhoea virus(BVDV)prevalences in theglobal cattle population JJ.Sci Rep,2018,8:14420.6FULTON,ROBERT W.Impact of species and subgenotypes ofbovine viral diarrhea virus on control by 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