丙型肝炎检测医学PPT课件.ppt

丙型肝炎检测丙型肝炎检测目前丙型肝炎检测;一、HCV抗体检测二、HCV抗原检测三、HCV核酸检测 四、HCV基因型检测五、HCV细胞培养丙型肝炎病毒抗体检测一、抗-HCV检测的目的意义 1、抗-HCV检测可用于诊断、血液筛查、流行病监测等。2、以诊断为目的的检测是为了确定个体HCV感染状况。3、以血液筛查为目的的检测是为了防止输血传播HCV，包括献血员筛查和原料血浆筛查。4、以流行病监测为目的的检测是为了解不同人群HCV感染率及其变化趋势，包括各类高危人群、重点人群和一般人群。二、抗-HCV检测的方法 抗-HCV检测分为筛查试验（酶联免疫吸附试验、胶体金法快速试验、化学发光试验、免疫荧光试验）和补充试验（免疫印迹试验）。（一）筛查试验1、抗-HCV酶联免疫吸附试验 间接法酶联免疫吸附试验是抗-HCV检测常用的筛查方法。其基本原理 是以HCV抗原包被固相载体，用辣根过氧化物酶标记的抗人IgG与被检样品中的抗-HCV反应，以邻苯二胺（OPD）或3，3，5，5四甲基联苯胺（TMB）等底物显色后，利用酶标仪等仪器进行阴阳性结果判断。其主要 反应过程如下：加入经样本稀释液稀释的被检样品，样品中的抗-HCV与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物；固相载体上只留下抗-HCV，其他免疫球蛋白及样品中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；加酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶；洗涤后，固相载体上的酶量就显示特异性抗体的量；加底物显色及终止液，利用酶标仪等仪器分析结果。2、化学发光试验 化学发光免疫分析（CLIA）是将具有高度敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种：（1）化学发光标记免疫分析法：化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析（CLIA)，是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物，是有效的发光标记物，通过起动发光试剂作用而发光，强烈的直接发光在一秒钟内完成，为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，其化学反应简单、快速、无须催化剂；检测小分子抗原采用竞争法，大分子抗原则采用夹心法，非特异性结合少，本底低；与大分子的结合不会减少所产生的光量，从而增加灵敏度。（2）化学发光酶免疫分析法：从标记免疫分析角度，化学发光酶免疫分析（CLEIA)应属酶免疫分析，只是反应的底物是发光剂，操作步骤与ELISA分析完全相同。以酶标记生物活性物质（如酶标记的抗原或抗体）进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。该方法又分为如下几类：HRP （辣根过氧化物酶）标记的CLEIA：常用的底物为鲁米诺或其衍生物如异鲁米诺。是一类重要的发光试剂。鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行，在过氧化物酶及活性氧（过氧化阴离子O2-，单线态氧O2，羟自由基OH-，过氧化氢H2O2)存在下生成激发态中间体，当其回到基态时发光，其波长为425nm。早期用鲁米诺直接标记抗原或抗体，但标记后发光强度降低而使灵敏度收到影响。近来用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH2H2O2）作用下，鲁米诺发光，发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。增强发光酶免疫分析（enhanced luminescence enzyme immunoassayELEIA）在发光系统中加入增强发光剂以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。ALP（辣根过氧化物酶）标记的CLEIA 所用底物为环1，22二氧乙烷衍生物，用于化学发光酶免分析底物而 设计的分子结构中包含起稳定作用的基团金刚烷基，其分子中发光基团 为芳香基团和酶作用的基团，在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。3 胶体金法快速试验（1）免疫渗滤试验：斑点免疫胶体金快速试验以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原点状固定在膜上，加待检样品。阳性结果在膜上抗原部位显示出有色斑点。反应时间在10分钟以内。有效试验的质控点必须显色。（2）免疫层析试验：以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原线状固定在膜 上，待检样品沿着固相载体迁移，阳性结果在膜上抗原部位显示出有色条带。有效试验的质控线必须显色。（二）抗体补充试验 抗体补充试验目前常用的为免疫印迹试验。免疫印迹法试剂一般将 HCV不同编码区抗原多种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的人IgG对照带和一条hSOD对照带，用于内部对照和结果判断。其 诊断HCV感染的敏感性高、特异性强，可检测针对HCV不同编码区抗原的抗体，且不需要特殊的仪器设备。（三）抗-HCV检测策略及结果报告 1、疫情监测相关的检测策略及结果报告 先用筛查试剂-1进行初筛试验，结果呈阴性反应，报告“抗-HCV阴性”，不再进行复检试验；结果呈阳性反应，进入复检试验。所有初筛阳性反应的样品使用筛查试剂-2进行复检，结果呈阴性反应，报告“抗-HCV阴性”；结果呈阳性反应，报告“抗-HCV阳性”。2、临床诊断相关的检测策略及结果报告 筛查试验 用筛查试剂进行初筛，结果成阴性反应，报告“抗-HCV阴性”；结果成阳性反应，不能出具阳性报告，必须进入复检试验。对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂双孔或原有试剂加另一种不同原理（或厂家）试剂进行复检试验，如均呈阴性反应，报告“抗-HCV阴性”；如均呈阳性反应或一阴一阳反应，进行补充试验。临床诊断筛查检测流程见图4(2)补充试验 临床诊断补充试验方法-1 复检试验阳性反应样品，进行免疫印迹试验。结果阴性者，报告 “抗-HCV阴性”；结果阳性者，报告“抗-HCV阳性”；结果不确定者，报告“抗-HCV不确定”，并进行随访。临床诊断补充试验检测方法一流程见图5。临床诊断补充试验方法-2 此方法仅限于检测方法/试剂给出了特定阈值（与抗体补充试验比较，其阳性的预测值95%）时使用。高S/CO比值：当S/CO比值特定的阈值时；低S/CO比值：其S/CO比值特定的阈值。初筛和复检 初筛和复检均为阳性，且有样品OD值与临界值（Cutoff）的比值（S/CO）试剂说明书中给出的特定阈值，可报告“抗-HCV阳性”，无需再做免疫印迹试验；否则，还应进一步作免疫印迹试验。免疫印迹试验结果阳性者，报告“抗-HCV阳性”；结果不确定者，报告“抗-HCV不确定”并进行随访。3、血液筛查相关的检测策略及结果报告 献血/浆员体检合格后抽血检验。用抗体筛查试剂进行初筛，结果呈阳性反应，报告“抗-HCV阳性待查”，献血/浆员暂停献血，如果需要进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；结果呈阴性反应，报告“抗-HCV初筛阴性”，献血/浆员献血，进入复检试验。对初筛呈阴性反应的样品用另一种抗体筛查试剂进行复检试验。如呈阴性反应，报告“抗-HCV阴性”，血液供应临床；如呈阳性反应，则报告“抗-HCV阳性待查”，血液报废，如果需要进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略。4.检测结果的解释 丙型肝炎病毒抗原检测 HCV抗原检测的目的意义1、HCV血清阳转前的早期急性丙型肝炎辅助诊断，尤其有助于HCV感染窗口期患者、抗-HCV检测结果不确定患者或HCV阳性母亲所生婴儿是否罹患丙型肝炎的辅助诊断。2、免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HIV感染者、长期透析的肾病患者、器官移植患者或先天性免疫功能缺陷患者等HCV感染的筛查。3、抗-HCV阳性感染者的病毒血症分析。4、HCV感染者治疗前后病毒血症追踪分析。（二）HCV抗原检测的方法 目前抗原检测ELISA试剂采用双抗体夹心法定性或定量检测样品中游离的HCV核心抗原（包括抗原抗体复合物和游离核心抗原）。基本原理：以基因工程核心抗原免疫小鼠后所获得的纯化抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为固相包被物，用与固相包被物有不同抗原决定簇的抗-HCV核心抗原单克隆抗体作为辣根过氧化物酶标记物，与样品中总的或游离的HCV核心抗原反应，OPD显色后进行定性或定量测定。大部分HCV抗原检测试剂检测的是样品中游离核心抗原以及和抗-HCV结合的核心抗原，因此在进行检测之前需要加入尿素、盐酸及去垢剂等，以解离样品中的核心抗原-核心抗体免疫复合物。其它操作程序与一般的ELISA或发光技术操作基本相同，即：第一步加入待测样品，孵育后，洗 去未结合的成分，加入酶标记或发光物质的抗核心抗原的二抗，孵育后显 色，再加入终止液终止显色，用酶标仪比色计算s/co值，来进行阴性和阳性 反应的判断。将HCV抗原的标准物质稀释成不同浓度的系列标准，还可进行HCV抗原的定量检测。以横坐标为HCV抗原的浓度（pg/ml），纵坐标为OD值，绘制出标准曲线。测出待测样品的OD值以后，在标准曲线上查出抗原的浓度。如果待测样品的OD值超出标准曲线上最高抗原浓度的OD值，则需用阴性血清将样品稀释以后再行检测。（三)检测策略及结果报告 初次检测抗原阴性样品，报告为“HCV抗原阴性”；初次检测抗原阳 性反应样品，需要双孔复检。如果双孔复检结果均为阴性，报告为“HCV 抗原阴性”；如果双孔检测结果至少有一孔结果为阳性反应，则报告为“HCV抗原阳性”。丙型肝炎病毒核酸检测（一）HCV核酸检测的目的意义1、HCV RNA定性检测可用于血液筛查领域，可使用单份样品或多样品集合的方法，对献血员血液及单采血浆站的原料血浆进行核酸检测，降低输血残余险度。2、HCV RNA定性检测可用于对HCV抗体阴性的高危人群样品进行集合核酸检测，及时发现窗口期感染。3、HCV RNA定量检测的意义主要体现在作为抗病毒治疗疗效的判断指标，指导抗病毒治疗及疗效判定。（四）检测结果的解释 1、阴性结果的解释 由于目前抗原检测试剂的灵敏度较低，最灵敏的检测试剂只能达到相当于500 IU/ml水平的HCV RNA，因此阴性的结果并不能排除HCV现症感染的可能。2、阳性结果的解释 现阶段，HCV抗原阳性仅作为HCV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。特别是对处于“灰区”的阳性结果，需要结合临床表现及HCV RNA、抗-HCV等检测结果来解释。监测病程进展或抗病毒治疗效果应进行HCV抗原的定量检测。（二）HCV核酸检测的方法1、RT-PCR检测技术 传统PCR定性检测HCV RNA需要三个步骤：对待测样品进行处理：通过裂解、纯化，提取样品中的HCV RNA作为PCR扩增的模板；采用逆 转录PCR（RT-PCR）技术对提取到的HCV RNA进行扩增；检测PCR扩增产物，检测方法包括凝胶电泳和PCR-酶联免反应（PCR-ELISA）等。2、TMA检测技术 TMA是一种利用MMLV逆转录酶和T7 RNA聚合酶2种酶的共同作用，在等温条件下来扩增RNA的反应系统。TMA使用的引物含有T7 RNA聚合酶 结合位点，使得反转录合成的cDNA可以作为T7 RNA聚合酶的模板，在T7 RNA聚合酶的作用下合成大量的RNA拷贝。扩增出来的RNA重新进入TMA 循环，成为下一轮复制的模板。TMA优点在于特异性强、灵敏度高，反应条件简单、扩增只需一个温度，无需专门的热循环仪器，且因整个反应在一个试管中进行，扩增产物RNA易于降解，从而大大减少了污染的可能。基于TMA技术的VERSANT HCV RNA定性检测可检测到极低水平的HCV RNA，甚至可低至5IU/ml。3、实时荧光定量PCR技术 荧光定量PCR基于荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）的原理，当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为FRET。基于FRET原理，出现了不同种类的荧光PCR，主要体现在探针设计的不同，如TaqMan探针、分子信标和荧光杂交探针。以目前我国应用最广泛的TaqMan荧光标记探针的定量PCR为例，是在探针（probe）的两端偶联一个短波长的荧光基团（报告基团）和一个长波长的荧光淬灭基团，这两个基团位置靠近，荧光基团不发荧光；Taq酶在发挥53方向聚合酶活性的同时，还具有53方向的外切酶活性，可使探针降解，荧光淬灭基团从而解离、远离荧光基团，荧光基团发出荧光，荧光的强度与PCR产物的量相关，通过计算可得出具体的量值。荧光定量PCR检测HCV RNA的操作程序包括：RNA提取、PCR扩增、荧光检测及结果分析。目前一般的荧光定量PCR仪都带有相应的分析软件，辅助设定阈值及Ct值，也允许操作者在合理的范围内自行调整。一个 良好的PCR反应反映到标准曲线上，就是标准曲线的相关性良好，（r2通常0.99），斜率（反映扩增的效率）在指定的范围内。但采用外标法定量的试剂盒标准品扩增良好也不一定意味着样品一定扩增良好，因为还涉及RNA提取质量的问题，因此特别要注意考察阳性质控和阴性质控的结果，阴性结果必须没有扩增曲线，而阳性质控必须扩增曲线良好，结果落入指定的区间 内。4、b-DNA技术 分支DNA（bDNA）技术基于其独特的信号放大系统，即bDNA信号放大系统，这是一个人工合成的bDNA，bDNA的分枝可结合多个酶标记物，从而将病毒的信号放大，以便进行检测。利用序列特异的寡聚核苷酸探针杂交捕捉HCV RNA，HCV RNA随后与支链DNA(bDNA）二级探针杂交，bDNA再与酶联三级探针结合，随后加入酶底物，产生的化学发光信号强度与靶DNA的量成正比。操作程序包括：首先激昂血浆样品离心，浓缩其中的病毒颗粒，HCV RNA释放后加入微孔板中，板孔中包被有可与病毒载体特异结合的一系列靶探针，另一系列靶探针的一端可标记在游离的病毒核酸链上，另一端可与bDNA结合，加入酶标记物对结合的bDNA进行标记，经过清洗后加入底物进行反应，测定反应强度。本方法定量系统中没有内标记物，每次实验设定实验样品的病毒拷贝数。（三）检测策略及结果报告 1、HCV核酸定性检测用于血液筛查策略及结果报告 对血液抗-HCV初筛呈阴性反应的样品可用集合NAT（Pooling NAT）进行复检试验。如呈阳性反应，做单人份NAT检测，阳性结果报告“阳性待查”，血液报废，如果需要进一步诊断献血/浆员感染状况，执行临床诊断策略；如呈阴性反应，报告“HCV复检阴性”，血液供应临床。2 HCV核酸定性检测用于临床诊断策略及结果报告 抗-HCV复检试验阳性反应样品，进行定性NAT试验。结果阳性者，报告“HCV阳性”；定性NAT结果阴性的样品，须做免疫印迹试验确证。检测流程见图8。3 HCV核酸定量检测用于临床治疗策略及结果报告 现阶段对HCV RNA定量检测的单位尚未完全统一，有的报告拷贝/ml，有的报告国际单位IU/ml，不同的试剂所用的标准不一样，造成IU和拷贝之间的转换系数不同。国产HCV RNA定量检测试剂盒的检测范围一般在103108拷贝/ml。HCV RNA定量检测报告单应该具备如下内容：检测方法（如荧光定量PCR）、检测试剂名称、单位及检测范围。临床样品的结果报告可能有几种情况：结果在检测范围内，则按检测的结果直接发报告，如每毫升3.2105拷贝/ml（有的临床实验室表示为3.20E+05拷贝/ml）；结果高于检测上限，则应用HCV阴性的混合血浆（清）将样本进行101000稀释后再重新检测，直到结果落入检测范围内；样本未出现扩增曲线，则应重新进行检测，若在检测限内，按照实际数发报告，若仍低于检测下限，则报告为“低于检测下限”。目前很多实验室对这部分样品不进行复检就直接发出报告，会造成相当部分阳性样品的漏检。丙型肝炎病毒基因型检测 一、HCV基因型 1993年Simmonds等提出的分型方法得到了大多数学者的认同。Simmonds等分析不同毒株编码非结构蛋白5（NS5）区域核苷酸序列的同源性，按照发现的先后将HCV主要分为16个型，每个型有若干亚型，以a，b，c等表示。这样，HCV被分为6个型和70多个亚型。Simmonds分型方法对临床慢性丙型肝炎的抗病毒治疗具有重要指导意义，美国肝病学会、欧洲肝病学会、亚太肝病学会和中国制定的系列丙型肝炎防治指南都采用了该法进行分型。在我国，最主要的基因型为1b（66%），其次为2a（14%），还有 其他较少见的型别，如西南地区的3型和广东等地区的6型等。二、HCV基因型检测方法与试剂 传统的HCV血清学分型与分子生物学分型相比，只有62.1%的符合率。现阶段检测HCV基因型的分子生物学方法有限制性片段长度多态性（RFLP）、测序法及反向线性探针杂交法（reverse hybridization line probe assay，LiPA）等，目前商品化试剂盒所用的方法主要是后两种。如Bayer的Trugene HCV分型试剂盒和Inno-LiPA HCV基因分型2.0试剂盒。分型试剂的检测靶位点主要集中于保守的5端非编码区，Trugene HCV分型试剂直接对HCV RNA序列测定来分型，LiPA则是基于反向杂交原理PCR扩增目的基因（扩增的DNA被生物素标记），与硝酸纤维膜上线形区带上的寡核苷酸探针杂交，再加入标记有碱性磷酸酯酶的亲和素，与杂交产物上标记的生物素结合，加入显色底物NBT/BCIP孵育后，显现紫色或棕色的条带，不同的条带组合对应不同的基因型。相比第一代产品，二代LiPA HCV增加了核心区序列，可准确地区分1a和1b型，并可避免东南亚地区和我国南部地区较常见的6c-6l型被误分为l型，但仍约有8%的2a型易被lipa误判为1a型，而这两种型别的HCV感染的治疗和预后均存在较大差异。需要注意，不论是Trugene还是Lipa，均要经过PCR扩增，对HCV混合感染进行分型时，不可避免会因不同型别RNA扩增效率不一造成的劣势扩增毒株的漏检。三、直接测序法HCV分型操作程序 随着核酸测序技术的发展，直接测序分型成为目前具有推广潜力的HCV基因型检测方法。该方法需要对HCV RNA进行巢式PCR（nested PCR）扩增，套式PCR是PCR衍生技术中最常用的方法，它使用两对引物，进行两次PCR反应，能够极大地增加PCR扩增反应的敏感性和特异性。套式PCR第二次反应的引物（内引物）位于第一次PCR扩增区域内。外引物进行第一次PCR扩增后，将第一次PCR扩增产物转移至第二次PCR反应管内，使用一对内引物进行第二次PCR扩增反应，最后用凝胶电泳鉴定扩增产物之后对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶纯化回收目的片段，然后测序。1、引物设计原则 除遵循PCR引物设计的一般原则以外，HCV分型主要考虑的是选择哪一段基因序列进行分型才能获得更高的分辨效率。临床上用于HCV基因分型的方法有多种，最常用的是根据（5NCR）序列差异而进行的基因分型方法，如INNO-LiPA、5NCR序列的直接测序、限制性片段长度多态性（RFLP）-PCR等，但一基于5NCR的基因分型方法对不同亚型的分型准确率有较大的差异，对1b、1a、2a、2b、2c、3a亚型的分型准确率分别为76%、91%、20%、50%和96%，几乎不能对4a和4c亚型进行区分，总准确率仅有76%，这与5NCR序列过于保守有关。因为同一基因型、不同亚型HCV 5NCR序列的差异度仅为1.0%3.3%，而NS5B基因序列的差异度为16.5%20.1%，NS5B基因更适用于HCV的基因分型。列举常用的PCR引物：外侧引物：5-TGGGGATCCCGTATGATACCCGCTGCTTTGA-3(上游引物）5-GGCGGAATTCCTGGTCATAGCCTCCGTGAA-3（下游引物）扩增的片段长度为401bp 内侧引物：5-CTCAACCGTCACTGAGAGAGACAT-3（上游引物）5-GCTCTCAGGTTCCGCTCGTCCTCC-3（下游引物，测序引物）扩增的片段长度为339bp 2、扩增体系 引物 各10100pmol/L 4种dNTP（dATP、dTTP或dUTP、dCTP和dGTP）各200mol/L Taq DNA聚合酶 12U Mg2+1.52.0mmol/L 模板DNA 100ng2000 g 三蒸水 加至50l 3、PCR条件 42 60min，94 5min第1轮PCR条件为：94 2min94 30s，50 35s，68 2.5min，35个循环68 9.5min。第2轮：取第1轮PCR产物1l作为模板，进行第2轮PCR，反应条件与第1轮相同。4、切胶纯化 1%琼脂糖凝胶电泳之后，对目的片段切割，回收及纯化。测序，纯化后的DNA片段测序一般由专业的测序公司帮助完成，目的片段大小在500600bp以下可以单向测序，超过500600bp的需要双向测序。5、结果分析 根据序列，使用BioEdit软件进行基因亲缘关系分析并绘制系统进化树，得到分型结果。三、HCV基因分型的临床意义 不同基因型对抗病毒治疗的应答不同，采取的治疗方案也不同，对RNA定量结果也有一定的影响。基因型的测定有助于决定抗病毒疗程和药物剂量。根据临床研究结果，在1型患者中，抗病毒治疗的疗程和利巴韦林的用药剂量不同对持续病毒学应答（SVR)有明显的影响，建议疗程为1年，利巴韦林的用量要达到10001200mg/d，尽管如此，其持续病毒学应答仅达到40%50%；而2和3型患者，疗程半年，利巴韦林的用量只要800mg/d即可达到70%80%的持续病毒学应答。延长疗程或增加利巴韦林的用量都不能进一步提高SVR率。根据不同的基因型和患者肝脏病理学改变情况调整疗程和利巴韦林的用药剂量，可以减少不必要的浪费，同时减轻药物不良反应，提高患者对治疗的依从性。