艾纳香油通过NF-κB非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应.pdf

第 45卷 第2期2024 年 3月Vol.45 No.2March 2024中山大学学报（医学科学版）JOURNAL OF SUN YATSEN UNIVERSITY（MEDICAL SCIENCES）艾纳香油通过NF-B非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应何贤芳1，2，王万林3，王鸿颖1，2，刘瑞秀1，2，易琼2，王鲁2（1.贵州大学药学院，贵州 贵阳 550025；2.西南特色药用生物资源开发利用教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025；3.贵州省三穗县人民医院，贵州 凯里 556000）摘要：【目的】本文旨在探讨艾纳香油（BBO）通过核转录因子B（NF-B）非经典通路影响花生四烯酸（AA）代谢通路发挥抗炎作用。【方法】采用豚鼠离体回肠法检测BBO对慢反应物质（SRS-A）生成的影响，ELISA法检测BBO对脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞前列腺素E2（PGE2）及白三烯 B4（LTB4）产生的影响，qRT-PCR检测BBO对LPS诱导巨噬细胞COX-2、5-LOX、FLAP和RelB表达的影响，Western blot检测BBO对NF-B非经典通路蛋白肿瘤坏死因子受体作用因子3（TRAF3）、肿瘤坏死因子受体作用因子2（TRAF2）、NF-B 诱导激酶（NIK）、p100和RelB浓度的影响。【结果】在1mgmL-1的BBO药物浓度下减弱了豚鼠回肠的收缩张力（P0.001），对SRS-A的生成抑制率达到65.34%；与LPS模型组相比，BBO在40-80 g mL-1浓度下降低AA代谢通路中PGE2（P0.05）和LTB4（P0.05）的浓度，降低COX-2（P0.05）、5-LOX（P0.05）和FLAP（P0.05）的表达；此外，40-80 g mL-1浓度下BBO还降低LPS导致的NF-B非经典通路中TRAF3（P0.05）、TRAF2（P0.05）和NIK（P0.05）的浓度，进一步抑制p100蛋白的磷酸化（P0.05），同时抑制转录因子RelB的表达（P0.05）和RelB蛋白的水平（P0.05），而BBO自身不引起这些基因与蛋白的变化。【结论】BBO可能通过抑制NF-B非经典信号中调节蛋白TRAF3和TRAF2，转录因子RelB的浓度，造成NIK蛋白的诱导激酶作用受到抑制，进一步抑制了p100蛋白的磷酸化及其与转录因子RelB的结合，从而影响到下游AA通路中重要限速酶COX-2、5-LOX和 FLAP的表达与炎症介质PGE2和LTB4的水平发挥抗炎作用。关键词：艾纳香油；脂多糖；NF-B非经典通路；花生四烯酸代谢；抗炎作用中图分类号：R392.3 文献标志码：A 文章编号：1672-3554（2024）02-0216-10DOI：10.13471/ki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240312.001Blumea balsamifera（L.）DC Oil Alleviates LPS-Induced Inflammatory Response in Macrophages by Affecting Arachidonic Acid Metabolism Via NF-B Nonclassical PathwayHE Xianfang1，2，WANG Wanlin3，WANG Hongying1，2，LIU Ruixiu1，2，YI Qiong2，WANG Lu2（1.College of pharmacy，Guizhou University，Guiyang 550025；2.Southwest Biomedical Resources of the Ministry of Education，Guiyang 550025；3.The people s hospital of sansui，Kaili 556000）Correspondence to：WANG Lu；E-mail：Abstract：【Objective】To study the anti-inflammatory effects of Blumea balsamifera（L.）DC oil（BBO）based on nuclear factor kappa-B（NF-B）nonclassical and arachidonic acid（AA）pathway.【Methods】Effects of BBO on the production of slow reacting substance of anaphylaxis（SRS-A）were detected by the ileal smooth muscle method.The contents of prostaglandin E2（PGE2）and leukotriene B4（LTB4）in lipopolysaccharides（LPS）-induced macrophages were detected by ELISA kit.The expression of COX-2，5-LOX，FLAP and RelB were detected by qRT-PCR.Western blot was performed to 基础研究 收稿日期：2024-01-05 录用日期：2024-03-08基金项目：国家自然科学基金（32160849，31760747）作者简介：何贤芳，第一作者，研究方向：中药抗炎活性研究，E-mail：；王鲁，通信作者，教授，研究方向：中药药理学研究，E-mail：第2期何贤芳，等.艾纳香油通过NF-B非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应detect the effects of BBO on the level of NF-B nonclassical pathway proteins TNF receptor associated factor 3（TRAF3），TNF receptor associated factor 2（TRAF2），NF-B-inducing kinase（NIK），p100 and RelB.【Results】The contractile tension of guinea pig ileum was reduced（P0.001），and the SRS-A production inhibition rate reached 65.34%at 1mgmL-1 BBO concentration.Compared with LPS group，BBO reduced the concentrations of PGE2（P0.05）and LTB4（P0.05），and decreased the expressions of COX-2（P0.05），5-LOX（P0.05）and FLAP（P0.05）in AA pathway at concentrations of 40-80 gmL-1.Moreover，40-80 gmL-1 BBO decreased the concentrations of TRAF3（P0.05），TRAF2（P0.05），and NIK（P0.05），and further inhibited the phosphorylation of p100（P0.05），as well as the level of the transcription factor RelB in genes（P0.05）and proteins（P0.05）in nonclassical NF-B pathway，whereas BBO did not cause such changes.【Conclusion】BBO may potentially exert its anti-inflammatory effects by suppressing the regulatory proteins TRAF3 and TRAF2 and the transcription factor RelB in NF-B nonclassical pathway.The inhibitory action extending to the induction kinase function of NIK，further hindering the phosphorylation of p100 and its binding with the transcription factor RelB.Consequently，downstream elements in the AA pathway，including the pivotal rate-limiting enzymes COX-2，5-LOX and FLAP，were altered.This modulation influences the levels of inflammatory mediators such as PGE2 and LTB4.Key words：Blumea balsamifera（L.）DC oil；lipopolysaccharides；nonclassical NF-B pathway；arachidonic acid metabolism；anti-inflammatory effectJ SUN Yatsen Univ（Med Sci），2024，45（2）：216-225在哺乳动物中，核转录因子 B（nuclear factor kappa-B，NF-B）是一种炎症通路相关分子，由RelA（p65）、RelB、c-Rel、NF-B1（p50/p105）和NF-B2（p52/p100）5种转录因子组成。NF-B信号转导包括经典和非经典2条途径，经典信号以p65磷酸化入核诱导靶基因的表达，引起炎性因子肿瘤坏死因子-（tumor necrosis factor-，TNF-）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）、环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide sythase，iNOS）等的转录启动，导致炎性反应 1；而非经典信号通过肿瘤坏死因子受体作用因子 2（TNF receptor associated Factor 2，TRAF2）/肿瘤坏死因子受体作用因子 3（TNF receptor associated factor 3，TRAF3）活化激酶NF-B 诱 导 激 酶（NF-B-inducing kinase，NIK），介 导p100磷酸化入核启动下游基因转录，最终导致炎性因子（如 TNF-和 IL-6）的释放与细胞炎性反应 2-3。TNF-和白细胞介素-1（interleukin-1，IL-1）可调节环氧合酶（cyclooxygenase，COX）、脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）等花生四烯酸（AA）系列代谢酶在内的多种因子的表达 4。AA是生物体内分布最广泛的内源性活性物质，细胞膜磷脂在磷脂酶A2（phospholipase A2，PLA2）的作用下，释放游离形式的AA到细胞液中，游离的AA在AA系列代谢酶催化下产生一系列炎症介质如：前列腺素（prostaglandins，PGs）、血 栓 素 A2（thromboxane A2，TXA2）、白三烯类（leukotrienes，LTs）等 5-7。5-脂氧合酶活化蛋白（arachidonate 5-lipoxygenase-activating protein，FLAP）促进AA向5-LOX的转移，是LTs生物合成所必需 8。抗炎药物的研究基本上都是从AA代谢通路相关信号分子着手，如解热镇痛抗炎药（NSAIDs）抑制 COX减少 PGs合成，糖皮质激素（甾体类）主要抑制PLA2发挥抗炎作用，慢反应物质（SRS-A）特异拮抗剂产生 LTs竞争性抑制作用，拮抗LTs引发的白细胞聚集与炎症反应9。艾纳香油 Blumea balsamifera（L.）DC oil，BBO 经艾纳香 Blumea balsamifera（L.）DC 茎叶提取而得，大量研究已经发现艾纳香油具良好的抗菌、烫伤、氧化应激、湿疹、炎症等作用 10-12。我们前期研究发现 BBO 通过抑制巨噬细胞 NF-B 经典信号中IB与p65蛋白的磷酸化而发挥抗炎作用 13，其所含的（-）-芳樟醇和-石竹烯通过抑制TLR4/NF-B经典信号通路中CD14、TLR4和MyD88的表达和NF-B p65蛋白的浓度，减少炎性因子TNF-、IL-6、iNOS、PGE2和COX-2的分泌，从而缓解LPS引起的血管内皮细胞的炎症损伤14。而BBO能否通过抑制 NF-B 非经典信号中调节蛋白 TRAF3 和TRAF2，诱导激酶蛋白NIK，以及核转录因子p100和RelB，而对下游AA通路中炎症介质水平产生影217第45卷中山大学学报（医学科学版）响，减弱慢性炎症反应。为此，展开本文研究，为研究BBO通过NF-B非经典通路缓解LPS诱导巨噬细胞炎症反应提供实验依据。1 材料与方法1.1实验动物与细胞健康清洁级成年豚鼠，体质量（180 10）g，购自重庆腾鑫实验动物中心（动物许可证号：SYXK（渝）2018-0001）。所有豚鼠饲养于贵州大学清洁级动物房，温度（20 25），相对湿度（555）%，光照时间12 h，饮食饮水自由。所有动物实验均经贵州大学动物实验伦理委员会批准。RAW 264.7细胞购于昆明细胞库（编号：KCB200603YJ）1.2药品与试剂BBO，购自贵州省罗甸县艾利康；硫酸阿托品，购自湖北兴华制药有限公司；卵清蛋白OVA，购自北京索莱宝科技有限公司；槲皮素，购自中国食品药品检定研究院；LPS（血清型O11：B4），购自Sigma-Aldrich 公司；胎牛血清，购自 Invitrogen 公司；DMEM，购自 Thermo scientific 公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术股份有限公司；PGE2（YM0603Mo）、LTB4（JYM0535Mo）ELISA试剂盒，购自武汉基因美生物科技公司；E.Z.N.A.Total RNA Kit I 购自美国 Omega Engineering 公司；StarScript RT Mix with gDNA Remover，购自北京康润诚业生物科技有限；细胞总蛋白提取裂解液（10RIPA buffer）和 RelB（C1E4）、NIK（4994）、TRAF2（C192）、TRAF3（D1N5B）、p-P100（18D10）抗体，均购自美国Cell Signaling Technology 公司；-Actin（YM3138），购自 ImmunoWay生物技术公司。1.3主要仪器Multiscan GO 酶标仪，Thermo 公司产品；PowerUp SYBRTM Green 荧光定量 PCR 仪，Thermo 公司产品；UVP Touch System 化学发光成像仪，德国耶拿Analytik jena公司产品；PHJ-1多功能恒温离体肠管及平滑肌实验槽，成都仪器厂产品；MADLAB-4C/501H型生物信号采集处理系统，北京众实迪创科技发展有限责任公司产品。1.4豚鼠离体回肠法检测BBO对SRS-A生成的影响BBO与吐温-80按1：1混匀后加入三蒸水形成乳化液待用。参考文献15-16方法OVA致敏豚鼠，制备SRS-A，肠管离体固定，组胺定标，待肠管收缩稳定后加入 SRS-A及受试药液，只加 SRS-A为空白模型组，槲皮素为天然药物阳性对照组，加50%吐温-80为溶剂组，记录豚鼠回肠活动曲线，每组重复3次，计算其平均收缩幅度。参照参考文献17，以定量组胺造成张力与定量 SRS-A 造成张力换算 SRS-A 含量，受试药物的药效用回肠收缩幅度抑制率表示，SRS-A 生成抑制率%=（空白组-试验组）/空白组100%。1.5MTT 法检测BBO对巨噬细胞活力的影响取对数生长RAW 264.7细胞以1105 个 mL-1密度铺于96孔板，每孔加入100 L，正常贴壁培养6 h后，设立空白对照组、500 ngmL-1 LPS模型组、BBO（终浓度0、40、60、80、120 gmL-1）+LPS（终浓度500 ngmL-1）共培养实验组，每组设立3个重复孔。加入药物正常培养24 h，根据MTT试剂盒说明书依次检测各组的细胞活性。1.6ELISA 法检测 BBO 对 LPS 诱导巨噬细胞PGE2和LTB4表达的影响取对数生长RAW 264.7细胞以6105个 mL-1密度铺于12孔板，正常贴壁培养6 h后，设立空白对照组、500 ngmL-1 LPS 模型组、BBO（终浓度 0、40、60、80 gmL-1）+LPS（终浓度 500 ngmL-1）共培养实验组和终浓度80 gmL-1 BBO阴性对照组，每组设立3个重复孔。加入药物正常培养24 h，收集各孔细胞上清液。根据ELISA试剂盒说明书依次检测各组细胞上清液中PGE2和LTB4。1.7qRT-PCR 检测 BBO 对 LPS 诱导巨噬细胞COX-2、5-LOX、FLAP和RelB表达的影响参考 1.6 中操作用 6 孔板进行细胞培养和分组。采用 RNApure 细胞试剂盒提取总 RNA，测定浓度与质量后，用StarScript 去基因组DNA反转录预混试剂盒合成cDNA，qRT-PCR定量目的基因mRNA 表达，每组设置 3 个复孔，GAPDH 为内参。PCR反应程序为：95 预变性2 min，95 变性15 s，60 退火延伸30 s，40个循环数，12 保温40 min。各基因相对表达量用2-Ct表示，qPCR的引物序列如表1所示。1.8Western blot 检测 BBO 对 NF-B 非经典通路相关蛋白表达的影响参考1.6中操作用6孔板培养细胞和分组，用RAPI裂解缓冲液（含PMSF）从细胞中提取总蛋白，218第2期何贤芳，等.艾纳香油通过NF-B非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应细胞核蛋白按Beyotime核浆提取试剂盒说明书进行提取，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度。实验以每孔40-100 g蛋白量上样电泳，经120 V电压转移到0.22 m PVDF膜上后用5%脱脂牛奶在室温下持续摇晃封闭90 min，然后用5%脱脂牛奶及5%BSA分别稀释NIK（1：1 000）、RelB（1：1 000）、p-P100（1：500）、TRAF2（1：1 000）、TRAF3（1：1 000）并与膜在 4 过夜孵育。TBST 中洗涤 5 min 6次，室温二抗孵育90 min，TBST中洗涤5 min 6次后ECL试剂显色，在Analytik Jena UVP ChemStudio工作站记录曝光条带灰度值A。胞浆和总蛋白以-Actin为内参，计算相对表达量，实验重复3 次。1.9统计学分析所有数据以三次独立试验的平均数标准差（x s）表示，采用 SPSS 27（ANOVA；IBM，USA）进行数据处理和统计分析，GraphPad Prism 9制作统计图。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，采用Bonferroni法进一步进行两两比较。P0.05表示数据间的差异具有统计学意义。2 结 果2.1BBO对豚鼠回肠收缩张力与SRS-A生成抑制的结果豚鼠肺SRS-A生成量和离体回肠收缩张力如表2与图1所示。单因素方差分析显示，各实验组间豚鼠回肠收缩张力、SRS-A 生成量与 SRS-A 生成抑制率分别具有统计学差异（F=16.07，P0.01；F=16.7，P0.01；F=9.49，P0.01）。Bonferroni 法进行组间两两比较显示，与空白对照组相比，溶剂对OVA致敏豚鼠回肠收缩张力的影响无统计学意义（P0.05），BBO在 1mgmL-1的药物浓度下减弱了豚鼠回肠的收缩张力，差异有统计学意义（P0.01），且与槲皮素阳性对照组相当（P0.05）。与空白对照组相比，溶剂对OVA致敏豚鼠肺SRS-A生成量的影响无统计学意义（P0.05），BBO在0.1%的药物浓度下抑制了豚鼠肺SRS-A生成量，差异有统计学意义（P0.01），抑制率达到65.34%。2.2BBO对RAW 264.7细胞活性的影响MTT结果如图2中所示。单因素方差分析显示，不同浓度BBO实验组间细胞活性具有统计学差异（F=3.981，P=0.023）。Bonferroni 法进行组间两两比较显示，与空白组相比，LPS 模型组与 40-120 gmL-1 BBO对细胞活性无明显影响，差异无统计学意义（P0.05）。2.3BBO 影响 RAW 264.7细胞 AA代谢中 PGE2和LTB4浓度的结果ELISA结果如图3中所示。t检验分析显示，相对于空白对照组，LPS 模型组 AA 代谢中 PGE2和LTB4的水平增加，差异具有统计学意义（P0.01，P0.01）。单因素方差分析显示，LPS模型组、各浓度BBO实验组和BBO阴性对照组间PGE2和LTB4的浓度 分 别 具 有 统 计 学 差 异（F=15.89，P0.01；F=707.99，P0.01）。Bonferroni法进行组间两两比较显示，与LPS模型组相比，60-80 gmL-1 BBO降低PGE2的 浓 度，差 异 有 统 计 学 意 义（P0.01）；表1qRT-PCR引物序列Table 1Primer sequencens of qRT-PCR GeneCOX-2-FCOX-2-R5-LOX-F5-LOX-RFLAP-FFLAP-RRelB-FRelB-RGAPDH-FGAPDH-RPrimer sequenceGGGCCATGGAGTGGACTTAAATGCAGGTTCTCAGGGATGTGACTACATCTACCTCAGCCTCATTGGTGACATCGTAGGAGTCCACAGCATGAAAGCAAGGCGCATAGTACGCATCTACGCAGTTCTGCCGTACCTGGTCATCACAGAGCAGTCTCGAAGCTCGATGGCAGGTCGGTGTGAACGGATTTGTAGACCATGTAGTTGAGATemperature/60.660.45860.2219第45卷中山大学学报（医学科学版）40-80 gmL-1 BBO降低LTB4的浓度，差异有统计学意义（P0.01）。而 BBO 自身不会引起细胞PGE2和LTB4的浓度变化。2.4BBO影响RAW 264.7 细胞AA代谢中COX-2、5-LOX和FLAP表达的结果qRT-PCR 结果如图 4 中所示。t 检验分析显表2BBO对豚鼠肺SRS-A生成量和回肠收缩张力的影响Table 2Effects of BBO on pulmonary SRS-A production and ileal contractile tone in guinea pigs (x s），n=3GroupControl groupSolvent groupBBOQuercetin groupContractile tone of guinea pig ileum/g0.240.020.220.010.080.02*0.120.04*SRS-A production/（U/g tissue）151.7611.53139.756.9452.5913.48*76.1521.78*Inhibition rate of SRS-A/%7.914.5965.348.88*49.82 14.35*SRS-A only as control group；50%Tween-80 as solvent group；0.1%BBO as experimental group；Quercetin as a positive control for natural medicine.BBO is a crude mixture obtained by extracting the dried stem and leaf powder of Blumea balsamifera（L.）DC with 90%ethanol as solvent.Bonferroni test after ANOVA.Compared with control group，*：P0.01，*：P0.05.A:Control group with SRS-A only.B:Solvent group with 50%Tween-80.C:Experimental group with 0.1%BBO.D:Positive control for natural medicine with quercetin.Control group increments are standard control tension increments,and the contractile tension of the guinea pig ileum is progressively manifested.The contractile tension of isolated guinea pig ileum was measured by PHJ-1 thermostatic smooth muscle tank,and the tension signal was collected by a biosignal acquisition system.图1BBO对豚鼠回肠收缩张力的影响Fig.1Effects of BBO on the contractile tone of guinea pig ileum220第2期何贤芳，等.艾纳香油通过NF-B非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应示，相对于空白对照组，LPS 模型组 AA 代谢中COX-2、5-LOX和FLAP的表达显著增加（P0.01，P0.01，P0.01）。单因素方差分析显示，LPS 模型组、各浓度BBO实验组和BBO阴性对照组间COX-2、5-LOX和FLAP的表达分别具有统计学差异（F=15.98，P0.01；F=188.35，P0.01；F=67.34，P0.01）。Bonferroni 法进行组间两两比较显示，与LPS 模型组相比，60-80 gmL-1 BBO 降低 COX-2的表达，差异有统计学意义（P0.01）；40-80 gmL-1 BBO 降低 5-LOX 的表达，差异有统计学意义（P0.01）；40-80 gmL-1 BBO降低FLAP的表达，差异有统计学意义（P0.01）。且BBO自身不影响COX-2、5-LOX 和 FLAP 的表达，结果详见图 4（A、B、C）。A:Expression of COX-2 in the AA pathway.B:Expression of 5-LOX in the AA pathway.C:Expression of FLAP in the AA pathway.Cells were spread in 12-well plates for 6 h and continued to culture for 24 h after addition of BBO.The levels of COX-2,5-LOX and FLAP were detected by qRT-PCR.Bonferroni test after ANOVA.n=3.Compared with control group,*:P0.01.Compared with LPS group,#:P0.01.图4BBO对LPS所致RAW 264.7细胞中COX-2、5-LOX和FLAP表达的影响Fig.4Effects of BBO on the expression of COX-2，5-LOX and FLAP in RAW 264.7 cells by LPSCells were spread in 96-well plates for 6 h and continued to culture for 24 h after addition of BBO.The activity of RAW 264.7 cells were detected by MTT assay.Bonferroni test after ANOVA.n=3,F=3.981,P=0.023.图2BBO对RAW 264.7细胞活性的影响Fig.2Effects of BBO on the activity of RAW 264.7 cellsA:The content of PGE2 in the cell supernatant.B:The content of LTB4 in the cell supernatant.Cells were spread in 12-well plates for 6 h and continued to culture for 24 h after addition of BBO.The levels of PGE2 and LTB4 in the cell supernatants were detected according to the ELISA kit procedure.Bonferroni test after ANOVA.n=3.Compared with control group,*:P0.01.Compared with LPS group,#:P0.01.图3BBO对LPS所致RAW 264.7细胞PGE2和LTB4浓度的影响Fig.3Effects of BBO on PGE2 and LTB4 concentrations of RAW 264.7 cells by LPS221第45卷中山大学学报（医学科学版）2.5BBO影响NF-B非经典通路相关蛋白的结果WB检测结果如图5所示。t检验分析显示，相对于空白对照组，LPS模型组中NF-B非经典通路TRAF3、TRAF2、NIK和p-P100的浓度增加，差异有统计学意义（P0.01，P0.01，P0.01）。单因素方差分析显示，LPS 模型组、各浓度 BBO 实验组和BBO阴性对照组间TRAF3、TRAF2、NIK、p-P100的浓度分别具有统计学差异（F=57.08，P0.01；F=195.32，P0.01；F=418.66，P0.01）。Bonferroni法进行组间两两比较显示，与LPS模型组相比，40-80 gmL-1 BBO 均降低 TRAF3、TRAF2、NIK 和 p-P100蛋白的浓度水平，差异有统计学意义（P0.01或P0.05），且BBO自身不影响这些蛋白的变化，结果详见图5。2.6BBO 影响 NF-B 非经典通路的转录因子RelB表达的结果qRT-PCR与WB检测结果如图6所示。t检验分析显示，相对于空白对照组，LPS模型组中NF-B非经典通路中转录因子RelB和蛋白的浓度水平增加，差异有统计学意义（P0.01，P0.01）。单因素方差分析显示，LPS模型组、各浓度BBO实验组和BBO阴性对照组间RelB和蛋白的浓度分别具有统 计 学 差 异（F=179.29，P0.01；F=195.32，P0.01）。Bonferroni 法进行组间两两比较显示，与LPS模型组相比，40-80 gmL-1 BBO 降低 RelB 与蛋白的浓度，差异有统计学意义（P0.01，P0.01），且BBO自身不影响这些蛋白的变化，结果详见图6。A:Expression of TRAF3 in the nonclassical NF-B Pathway.B:Expression of TRAF2 in the nonclassical NF-B Pathway.C:Expression of NIK in the nonclassical NF-B Pathway.D:Expression of p-P100 in the nonclassical NF-B Pathway.Cells were spread in 12-well plates for 6 h and continued to culture for 24 h after addition of BBO.The levels of TRAF3,TRAF2,NIK and p-P100 were detected by western blot.Bonferroni test after ANOVA.n=3.Compared with control group,*:P0.01.Compared with LPS group,#:P0.05，#:P0.01.图5BBO对LPS所致RAW 264.7细胞中NF-B非经典通路TRAF3、TRAF2、NIK、p-P100的影响Fig.5Effects of BBO on TRAF3，TRAF2，NIK and p-P100 of nonclassical NF-B pathway in RAW 264.7 cells by LPS222第2期何贤芳，等.艾纳香油通过NF-B非经典信号影响花生四烯酸代谢缓解LPS所致巨噬细胞的炎症反应3 讨 论炎症应答起始于细胞对外来病原微生物和自身损伤分子的识别，随后启动一系列信号传导与级联反应，激活相关转录因子调控大量基因表达，从而引发炎症。失调的炎症会导致各种慢性炎症性疾病的发病机制。AA是生物体内分布最广泛的内源性活性物质，AA通路构成的代谢网络与机体炎症的发生及消除过程密不可分。COX-2和5-LOX是 AA代谢通路中的重要限速酶，COX-2催化 AA产生PGE2；FLAP结合AA后经5-LOX催化转化产生 LTA4，再经LTA4水解酶生成高效的细胞炎症趋化因子LTB4 18-19。FLAP 是LOX的主要启动分子，发挥LOX传递作用 20。SRS-A是AA通过脂氧酶途径的代谢产物，主要包含LTs类活性物质，LTs由白细胞、巨噬细胞及其他细胞和组织受免疫性或非免疫性刺激应答形成21。我们的结果表明，BBO抑制 SRS-A的生成；在对细胞活性无影响的浓度范围内，40-80 gmL-1 BBO可降低巨噬细胞AA代谢中炎症介质 PGE2和 LTB4与限速酶 COX-2、5-LOX和FLAP的浓度。这些结果提示，BBO通过抑制巨噬细胞AA代谢途径中炎症信号的传递，抑制炎症的放大反应。NF-B是炎症应答过程中一类重要转录因子，其信号的转导包括经典和非经典2条途径。在经典信号中，NF-B/Rel 蛋白与 IB 蛋白结合并受到抑制，促炎因子激活 IKK 复合体（IKK、IKK 和 NEMO）后诱导IB 蛋白磷酸化、泛素化以及蛋白酶体降解，由此释放出活性NF-B/Rel 复合体并转运入细胞核诱导靶标基因表达1；而非经典信号由NIK 激 活 IKK 复 合 体，NIK 的 表 达 与 激 活 受TRAF2、TRAF3和E3连接酶等复合物调节22，活性 IKK复合体引起 NF-B2 p100磷酸化与泛素化，随后被加工为NF-B2 p52，与RelB形成具备转录能力的 NF-B p52/RelB复合体，并转入细胞核调控下游基因表达，导致炎性因子 TNF-、IL-6 和IL-1 的释放2-3。TNF-和 IL-1 可调控 COX、LOX和CYP450等AA系列代谢酶在内的多种因子的表达4。NF-B2 p100优先抑制RelB核转位，当其C 端残基发生磷酸化导致其自身泛素化时被降解，释放出活性体NF-B2 p52以传递信号23。与经