基于网络药理学及动物实验的杜仲腰痛丸治疗腰椎间盘突出症慢性下肢痛的作用研究.pdf

2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 基于网络药理学及动物实验的杜仲腰痛丸治疗腰椎间盘突出症慢性下肢痛的作用研究陈祁青1，马东2，赵继荣2，黄军凯2，杨云云2，朱宝1，赵宁1（1.甘肃省中医院 兰州 730050；2.甘肃中医药大学中医临床学院 兰州 730030）摘要：目的通过对杜仲腰痛丸作用于腰椎间盘突出症慢性下肢痛大鼠模型镇痛效果动物实验的观察，并结合网络药理学及分子对接技术探讨其分子机制。方法以腰椎间盘突出症慢性下肢痛模型大鼠为研究对象，使用中药复方制剂杜仲腰痛丸对其进行干预，观察分析杜仲腰痛丸对模型大鼠的镇痛效应，并用TCMSP数据库检索并筛选获得杜仲腰痛丸的有效成分及其对应靶标，检索OMIM、GeneCards、DrugBank及PharmGkb数据库筛选合并获得腰椎间盘突出症疾病相关基因。利用Cytoscape_v3.8.0软件构建中药复方调控网络，通过STRING网络平台构建PPI网络关系并筛选出核心基因；然后进行GO与KEGG富集分析；最后利用AutoDock Vina软件进行分子对接。结果机械痛阈值组间比较，治疗组较正常组、模型组恢复快，差异有统计学意义（P0.05）；热痛阈值组间比较，治疗组较正常组、模型组恢复快，差异有统计学意义（P0.05），且随着药物干预时间的延长，其治疗效果也越显著。网络药理学研究结果显示共筛选出335种有效成分、321个相关靶标以及90个药物治疗疾病的靶标；获得排名前5的关键成分（槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素、甘草查尔酮A）与9个核心靶标（JUN、MAPK14、RELA、MYC、FOS、TP53、MAPK1、STAT3、ESR1）；共涉及2302条相关GO分子条目及157条信号通路；所有分子对接结果的最小结合能均小于-7.0 kcalmol-1，具有强烈的结合活性。结论杜仲腰痛丸能够有效缓解腰椎间盘突出症慢性下肢痛大鼠模型的疼痛行为、改善其机械刺激与热刺激痛觉过敏现象，且可能是通过槲皮素、木犀草素、山柰酚等关键活性成分，作用于JUN、MAPK14、RELA等潜在核心靶点，调控PI3K-Akt、TNF等信号通路，从而发挥抗炎镇痛的效果。关键词：杜仲腰痛丸 腰椎间盘突出症 网络药理学 动物实验 分子对接doi:10.11842/wst.20220326012 中图分类号:R285 文献标识码:A腰椎间盘突出症是（Lumbar disc herniation，LDH）常见的骨科慢性疾患之一，会导致腰痛、放射状腿痛和感觉障碍1。发病率约占人口 1.00%，多发于 20-40岁人群。主要由于髓核中的水潴留减少，髓核和纤维环内1型胶原蛋白比例增加，胶原蛋白和细胞外物质的破坏，以及基质等降解系统的活性上调金属蛋白酶表达、细胞凋亡和炎症通路。最终，导致炎症趋化因子的局部增加和突出的髓核对神经施加机械压迫而产生腰腿痛等症状2-3。近年来，伴随着当下生活办公方式的转变，LDH发病率仍呈上升趋势，给人们带来了巨大的经济与精神负担。杜仲腰痛丸是赵继荣主任医师将中医理论与临床实践相结合，经相关药理研究后组方而成，由杜仲、牛膝、狗脊、酒萸肉、槲寄生、川芎、当归、细辛、红花、收稿日期：2022-03-26 修回日期：2023-02-17 国家自然科学基金委员会地区科学基金项目（81760877）：基于RS-fMRI及ERK-CREB-BDNF信号通路杜仲腰痛丸干预腰椎间盘突出症慢性疼痛的脑机制研究，负责人：赵继荣；甘肃省自然科学基金委员会创新基地和人才计划项目（17JR5RA051）：纤维环源干细胞培养体系建立及中药诱导定向成纤维环细胞分化，负责人：陈祁青；甘肃省中医院博士启动基金项目（2018-1）：纤维环源干细胞的体外分离培养、鉴定及生物学特性研究，负责人：陈祁青。通讯作者：马东，硕士研究生，主要研究方向：中医药防治脊柱疾患的研究。1702 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究赤芍、乳香、没药等17种中药组成，具有补肾壮腰、活血化瘀、通络止痛之功。方鹏飞等4研究发现，杜仲腰痛丸能够有效地提高患者APTT、PGI2、TT及PT值，降低血瘀症积分等相关凝血指标（TXA2、BPC、D-D、FIB），有效改善LDH患者血瘀状态，减轻腰背部疼痛，提高日常生活能力。赵宁等5研究发现运用经皮激光汽化减压术联合脊柱调衡手法及杜仲腰痛丸能够有效改善LDH患者VAS疼痛评分，具有较好的临床应用价值。王国慧等6通过临床研究发现，杜仲腰痛丸联合电针刺激能够显著降低 LDH 患者 CRP、TNF-及IL-6等血清炎性细胞因子的水平，改善VAS评分，从而缓解患者腰部及下肢部的疼痛、麻木、酸楚症状。相关前期研究发现，杜仲腰痛丸对LDH疗效显著，其主要机理在于药物成分能够有效降低机械压迫后相关神经根组织的水肿，促进炎性物质的吸收，改善微循环，从而发挥出良好的消炎止痛效果，并促使突出的相关髓核组织达到一种“无害化”的疗效作用7-8。虽然杜仲腰痛丸临床疗效突出，但其对于治疗LDH的作用机制及物质基础尚不明确。为此，本研究通过动物实验、网络药理学方法联合分子对接技术对杜仲腰痛丸治疗LDH的有效成分以及作用机制进行探讨分析，以期为临床的使用和进一步研究提供参考。1 资料与方法 1.1药物与试剂具体内容见表1。1.2仪器与设备具体内容见表2。1.3动物与饲养选取72只6-8周龄，重量为25020 g的实验用SD大鼠（雄性），其购置于南京医科大学【SCXK（苏）2019-0018】。实验伦理编号：（1ACUC-1909034）。动物饲养、灌胃等相关实验均在南京医科大学医药实验动物中心 SPF级实验室中进行。实验室温度控制在22，湿度50%，噪声37-45 dB，光照12 h明/暗循环。1.4数据库软件准备TCMSP数据平台下载相关中药及靶标；GeneCards、OMIM、DrugBank及PharmGkb数据平台下载相关疾病基因；并且TCMSP数据平台是以系统模块化药理学研究为基础，对中药单体中的潜在靶标、有效活性成分、药代动力学以及相关疾病数据进行有效整合构建而成，为系统的研究中药单体成分的作用机理、阐明其相关靶标以及发现有效活性物质提供了可靠的基础公共平台；而DrugBank数据平台是以临床试验药物相关数据为基础构建而成，为研究者提供了全面而丰富的药物靶标信息和相关药物数据。OMIM、GeneCards以及 PharmGkb 数据平台都是以文献为基础进行构建，各数据库优势互补。R 语言软件进行 Venn 图绘制；Uniport数据平台与Perl语言软件进行药物靶点ID的转换；Cytoscape软件进行网络调控图构建；STRING网络数据平台进行蛋白互作网络构建；利用Cytoscape软件中 CytoNCA 插件进行 PPI网络核心筛选；R语言软件进行疾病药物相关基因symbol的ID转换并做GO和KEGG分析；PubChem与PDB数据平台下载蛋白与受体并用PyMol和AutoDockTools软件进行分子对接。2 方法 2.1杜仲腰痛丸对LDH慢性下肢痛模型大鼠镇痛效应实验2.1.1药物配比实验大鼠的给药剂量以药理试验中，人与动物的体表面积等效剂量为标准进行换算，将杜仲腰痛丸（规格：40 g/瓶，生药：0.2 g/粒）使用水溶配制为含生药浓度：0.05 gmL-1的药液。相关模型制备完毕后，将杜仲腰痛丸药液以0.26 gkg-1为标准对治疗组大鼠进行灌胃。2.1.2动物分组以随机数字表法进行实验分组：正常组（无任何手术处理，正常饲养）、模型组及治疗组，每组24只。表1主要药物与试剂药物/试剂杜仲腰痛丸碘伏酒精水合氯醛异氟烷生产商甘肃省中医院浙江欧洁科技股份有限公司浙江欧洁科技股份有限公司天津市大茂化学试剂厂北京友诚生物科技有限公司生产批号2019105120191024201911132018100620180827表2主要仪器与设备仪器设备大鼠麻醉机电子天平电子VonFrey测痛仪手术器械热板痛觉测试仪生产商北京友诚生物科技有限公司上海精科天美科学仪器有限公司美国IITC Life Science公司，2390系列上海医疗器械集团有限公司美国IITC Life Science公司，8390系列1703 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 2.1.3造模动物模型参照Shamji等9采用自体髓核移植法建立腰椎间盘突出症慢性下肢痛模型大鼠，模型大鼠建立之后7天内以2次/日为间隔对其腹部进行顺时针按摩（每只10 min），以防止麻醉后发生肠粘连，有效减轻术后腹胀以及辅助排便，同时进行疼痛行为学（运动行为异常，有垂足跛行现象）观察确保造模成功。2.1.4干预方式对造模成功后的大鼠进行分组干预，其中将杜仲腰痛丸药液以0.26 gkg-1为标准对治疗组大鼠进行灌胃（2次/日）；模型组与正常组则以同等剂量的生理盐水进行灌胃。2.1.5检测指标（1）机械痛阈值检测将大鼠置于半透明玻璃电子VonFrey测痛仪中，实验前适应15 min，对大鼠足底进行刺激，观察是否能够引起大鼠舔足以及缩足的相关阳性反应，若出现则记录该读数数值，且该数值则为机械缩足反射阈值（MWT），阈值记录分为造模前0天、造模后2天、7天、14天、药物干预0天、药物干预2天、7天、14天、21天、28天共9个时间点。以5 min为间隔标准对单只大鼠在各时间点进行5次检测并记录相应MWT，同时去除单只检测值中的最高和最低 MWT，取平均值为最终取值。（2）热痛阈值检测实验开始前热板痛觉测试仪设定为恒定温度，置大鼠于半透明热板痛觉测试仪玻璃箱中，开始前适应15-30 min，记录大鼠开始出现抬足、舔足、逃避的阳性反应时间为热缩足反射潜伏期阈值（TWL），阈值记录分为造模前 0 天、造模后 2 天、7 天、14 天、药物干预0天、药物干预2天、7天、14天、21天、28天共9个时间点。为避免大鼠热损伤，单次检测时间不超过 30 s。以5 min为间隔标准对单只大鼠在各时间点进行5次检测并记录相应TWL，同时去除单只检测值中的最高和最低TWL，取平均值为最终取值。2.1.6统计学处理方法采用 SPSS 22.0 软件对数据进行统计处理分析。计量资料以均值标准差（x s）表示，使用单因素方差分析对数据进行处理，2检验统计处理计数资料，秩和检验或Ridit分析处理等级资料，P0.05），具有可比性；组内比较，造模后2天、7天及药物干预后0天、2天时，模型组与治疗组MWT较造模前显著减小，差异有统计学意义（P0.05），同时药物干预后2天、7天、14天、21天、28天时，治疗组MWT较前一时间点减小（其中模型组在药物干预后14天及21天时，MWT较前一时间点减小），差异有统计学意义（P0.05）；组间比较，在药物干预后2天、7天、14天、21天、28天时，治疗组与模型组MWT较正常组恢复快，差异有统计学意义（P0.05）；组间比较，在药物干预后2天、7天、14天、21天、28天时，治疗组 MWT 较正常组、模型组恢复快，差异具有统计学意义（P0.05），具有可比性；组内比较，造模后2天、7天及药物干预后0天、2天时，模型组与治疗组TWL较造模前显著降低，差异有统计学意义（P0.05）；药物干预后2天、7天、14天、21天时，治疗组TWL较前一时间点提高（其中模型组在药物干预后28天时，TWL较前一时间点提高），差异有统计学意义（P0.05）；组间比较，在药物干预后2天、7天、14天、21天、28天时，治疗组与模型组 TWL 较正常组恢复快，差异有统计学意义（P0.05）；组间比较，在药物干预后2天、7天、14天、21天、28天时，治疗组TWL较正常组、模型组恢复快，差异有统计学意义（P0.05）。表明杜仲腰痛丸能够有效缓解LDH慢性下肢痛大鼠模型的疼痛症状，且在大致药用剂量下，治疗效果会随着时间的增加变得越加显著（见表4、图2）。3.3网络药理学3.3.1杜仲腰痛丸有效成分与靶标检索TCMSP数据平台，设定口服生物利用度OB值30%及类药性DL值0.18为筛选标准下载获得药物有效成分 335 种，其中赤芍 29 种，牛膝 4 种，川芎7种，当归2种，杜仲28种，甘草92种，红花22种，槲寄生7种，没药45种，木香6种，乳香8种，三七8种，山茱表3机械痛阈值比较结果分析时间段造模前0天造模后2天造模后7天造模后14天（药物干预0天）药物干预2天药物干预7天药物干预14天药物干预21天药物干预28天正常组38.232.7438.413.3438.223.4737.863.4138.273.9237.794.0338.373.5638.143.8237.583.49模型组38.543.3211.322.3411.572.1813.212.8713.622.7413.874.2814.662.79*16.423.41*16.742.17治疗组38.342.9311.442.0712.482.3613.622.5818.774.16*23.613.26*29.263.33*33.083.16*36.691.28*注：与造模前组内比较，P0.05；与前一时间点组内比较，*P0.05；与同一时间点正常组比较，P0.05；与同一时间点正常组、模型组比较，P0.05。图1机械痛阈值比较结果分析1705 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 萸20种，细辛8种，延胡索49种，狗脊与土鳖虫未检索到。检索 Uniprot 数据平台去重后剩余靶标共计321个。3.3.2筛选LDH相关疾病靶标通过检索DrugBank数据平台检索去重下载得到LDH相关疾病靶标10个，GeneCards数据平台检索去重下载得到164个，OMIM数据平台检索去重下载得到10个、PharmGkb数据平台检索去重下载得到1552个；将各数据平台靶标相关数据整合去重后共得到1734个LDH相关疾病靶标。运行R语言软件对杜仲腰痛丸治疗LDH的相关靶标与疾病相关靶标进行处理后取交集得到相关性靶标90个（如图3、图4）。3.3.3中药复方调控网络结果运行Cytoscape软件绘制成药物、成分及疾病相关靶标关系网络调控图（图5），该图中节点数为117个，产生相互作用关系的边共有414条，其中杜仲腰痛丸各单味药化合物成分共计有199种作用于90个相关靶标发挥治疗LDH的效果。3.3.4PPI蛋白互作网络结果将90个交集靶标导入至STRING数据平台得到蛋白互作网络TSV文件，使用Cytoscape软件运行该文件得到蛋白互作网络图（图6），图中基因节点数为73，相互作用关系线条数为350；利用软件自带CytoNCA插件进行靶标蛋白的筛选处理，以基因所在各项指标参179901734杜仲腰痛丸腰椎间盘突出症图4杜仲腰痛丸靶标与LDH靶标交集Venn图GeneCardsDrugBankOMIMPhamGkb图3不同数据库LDH疾病靶标并集Venn图表4热痛阈值比较结果分析时间段造模前0天造模后2天造模后7天造模后14天（药物干预0天）药物干预2天药物干预7天药物干预14天药物干预21天药物干预28天正常组18.371.7718.242.0718.431.5417.822.6318.581.5917.932.2418.511.4218.082.3317.723.08模型组18.282.075.321.436.331.287.081.547.321.447.411.688.331.578.621.749.882.07*治疗组18.472.285.321.176.531.496.921.639.111.28*11.541.42*14.191.53*16.131.38*16.221.29注：与造模前组内比较，P0.05；与前一时间点组内比较，*P0.05；与同一时间点正常组比较，P0.05；与同一时间点正常组、模型组比较，P0.05。图2热痛阈值比较结果分析1706 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究数均大于中位值为标准进行2次筛选得到9个PPI蛋白互作网络核心靶标（图7）；构建该9个靶标与对应有效化合物成分的网络可视化图（图8），计算有效化合物成分Degree值筛选得到前5的成分分别为quercetin（槲皮素）、luteolin（木犀草素）、licochalcone a（甘草查尔 酮 a）、kaempferol（山 奈 酚）以 及 naringenin（柚皮素）。3.3.5GO及KEGG富集分析结果将LDH与杜仲腰痛丸的90个交集靶标导入至R语言软件，设定过滤条件为矫正后P值，利用软件自带Bioconductor 程序包处理后得到 GO 及 KEGG 分析结果。结果显示共有2302条GO相关条目，其中2118条涉及生物过程（BP）条目、53条涉及分子组成（CC）条目、131条涉及分子功能（MF）条目；KEGG结果显示共得到157条相关信号通路，依据P值的大小筛选获得GO分析中前10的条目以及KEGG分析中前20的信号通路绘制相关柱状图和气泡图（如图9、图10）。BP分析结果显示杜仲腰痛丸治疗LDH涉及的主要生物过程有细胞对化学应激与氧化应激的反应、对细菌源性分子的反应以及对脂多糖的反应等；CC分析结果显示交集靶标主要参与的分子组成有膜区、膜微区、转录调节复合物、与膜筏等；MF分析结果显示交集靶标主要涉及产生影响的分子功能有细胞因子受体结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合以及磷酸酶结合等。KEGG分析结果显示杜仲腰痛丸能够有效缓解LDH患者的临床症状主要是通过AGE-图6药物-疾病交集靶标蛋白互作网络图图5杜仲腰痛丸调控网络图注：橙色六边形代表交集靶标基因；深绿色矩形代表各单味药共有成分，其余各颜色均为单味药中文名首字母缩写：延胡索（YHS）、杜仲（DZ）、甘草（GC）、没药（MY）、川芎（CX）、细辛（XX）、槲寄生（HJS）、山茱萸（SZY）、川牛膝（CNX）、木香（MX）、红花（HH）、乳香（RX）、赤芍（CS）、三七（SQ）。1707 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 RAGE、IL-17、P13-Akt 以 及 TNF 等 信 号 通 路 来 实现的。3.3.6分子对接结果分析根据网络调控图Degree值大小筛选得到位于前3的靶标基因JUN、RELA、MAPK1以及位于前3的成分槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）和甘草查尔酮A（licochalcone a）完成分子对接。一般认为分子对接中结合能数值越小，其分子间具有越高的结合稳定性，当结合能数值（Binding energy）-4.25 kcalmol-1时表明分子受体与相关配体间具有一定的结合活性；-5.0 kcalmol-1时表明分子间具有较好的结合活性；-7.0 kcalmol-1时则表明该受体与相关配体间具有强烈的结合活性10。根据表 5 分子对接结果显示槲皮素、木犀草素、甘草查尔酮A三种关键药物成分与相关核心靶标MAPK1、JUN、RELA之间的结合能值均-7.0 kcalmol-1，说明两者间具有强烈的分子结合活性。使用 Pymol 软件进行分子对接可视化分析（图11）。结果显示槲皮素与MAPK1主要通过氢键位点附近的MET-108、LEU-103、ASP-167、GLU-71四个氨基酸键产生结合；木犀草素与JUN主要通过氢键位点附近的 DA-37、DG-38、DT-5、DA-6、DG-8 五个氨基酸键产生结合；甘草查尔酮A与RELA主要通过氢键位点附近的 ASN-283、THR-284、GLN-226、TYR-297四个氨基酸键产生结合。4 讨论 中医将LDH归类于“腰痛病”或“痹证”的范畴，并认为其主要病机为肝肾亏虚、湿热积聚、筋脉受损而致使血脉瘀阻，不通则痛11。其中90%LDH患者可通过积极适当的非手术治疗获得较满意的疗效12。西医临床保守治疗多选择非甾体类与激素类相联合的方式，该方式治疗过程中可发生消化道相关不良反应，因此探寻可代替的安全且有效的临床保守治疗手段尤为必要13。杜仲腰痛丸为甘肃省中医院院内制剂，具有较好的活血化瘀、补肾壮腰、通路止痛之功。经临床多年使用证实该药单独使用或联合其他疗法对LDH腰腿痛具有较好的临床疗效，且未出现消化道等不适反应，是一种安全有效的中医药保守治疗选择14-15。且本研究通过观察杜仲腰痛丸干预LDH慢性下肢痛大鼠模型后发现，杜仲腰痛丸能够有效地缓解LDH慢性下肢痛大鼠模型的疼痛行为、改善其机械刺激与热刺激痛觉过敏现象，且随着药物干预时间的延长，其治疗效果也越显著。通过此次杜仲腰痛丸治疗LDH的网络药理学预测分析，结果显示槲皮素、木犀草素及甘草查尔酮 A为其主要有效成分。槲皮素类属于多酚类化合物，在抗炎及抑制病毒活性等方面有着广泛的作用16。Muto73Nodes 350Edges24Nodes 126Edges9Nodes 34Edges图7PPI网络核心靶标图8成分-靶标筛选网络图1708 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究等17发现槲皮素可以通过对模型大鼠神经胶质细胞中纤维酸性蛋白有效抑制来减轻其神经性疼痛，这可能是杜仲腰痛丸治疗LDH时能够发挥较好止痛效果的作用机制原因之一。木犀草素是黄酮类的主要成分，广泛分布于植物中，在镇痛效果中起着关键作用。Zhou等18研究发现木犀草素可通过调节脊髓背角中图9GO富集分析网络图（排名前10）图10KEGG富集分析网络图（排名前30）1709 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 的p38 MAPK活性来阻碍神经胶质细胞和NLRP3炎症小体的活化，从而抑制神经炎症，缓解小鼠疼痛。甘草查尔酮A是一种从甘草根中提取的生物活性查尔酮成分，其在药物治疗中具有显著的抗炎、抗氧化、抗菌和抗肿瘤特性。研究发现，甘草查耳酮A可抑制多种促炎介质（IL-1、PGE 2、IL-6、NO、LTB）19。此外，Phan等20研究发现甘草查耳酮A可以显著抑制T淋巴细胞中IL-2的释放和增殖，T淋巴细胞是调节炎症的关键细胞。此结果表明甘草查耳酮A是一种且有效的抗炎剂，于临床具有较好的抗炎镇痛效果。以上研究表明通过筛选获得的杜仲腰痛丸关键成分槲皮素、木犀草素及甘草查耳酮A能够有效减缓机体促炎介质的释放，抑制炎症的发生，从而发挥治疗 LDH 的作用。本研究通过 PPI 蛋白互作网络打分过滤后得到MAPK1、STAT3、MAPK14等9个关键靶标。An等21研究发现，MAPK1可以有效抑制 NEAT1的表达并通过miR-211-5p 轴减轻了脊髓损伤的炎症反应。RELA是NF-B家族成员中一种炎症反应基因的有效转录激活因子，可通过暴露于病原体和炎性细胞因子来激活许多炎症和免疫反应基因的表达22。STAT3是细胞对细胞因子和生长因子的反应所必需的7种转录因子之一，参与调节细胞周期、细胞存活和免疫反应。其中STAT1和STAT3通路的相互调节可引导细胞从存活转向凋亡或从炎症反应转向抗炎反应23。MAPK14在缓解应激信号自噬对炎症的抑制控制方面发挥着重要作用，其可通过对ULK1激酶活性的有效抑制，破坏其与ATG13复合物之间的相互作用，缓解了自噬对炎症的抑制，实现机体全面的免疫反应24。FOS 是AP-1 转录因子家族的成员，Makino 等25研究发现，FOS的上调表达可能是促进椎间盘退变发展的重要因素之一，且使用AP-1选择性抑制剂T-5224证明抑制c-Fos/AP-1可防止椎间盘退变和相关疼痛，从而起到治疗LDH的作用。GO分析及KEGG分析同样与抗氧化、炎症反应及免疫调节有关。依据GO分析结果，杜仲腰痛丸中关键化合物成分主要是通过对细胞化学应激与氧化应激的反应、对细菌源性分子的反应以及对脂多糖的反应等生物过程的调控参与膜区、膜微区、转录调节复合物、与膜筏等分子组成，从而对细胞脱氧核糖核酸-结合转录因子结合、RNA聚合酶II特异性DNA结合转录因子结合、细胞因子受体结合、磷酸酶结合及蛋白磷酸酶结合等分子功能产生影响来发挥治疗LDH的功效。而 KEGG分析结果显示杜仲腰痛丸治疗 LDH可能与P13-Akt、TNF、IL-17以及AGE-RAGE等信号通路有关。其中P13K-Akt信号通路涉及许多生物过程，包括细胞存活、凋亡和炎症。研究发现，在炎症环境中，P13K-Akt通路的激活可以有效地 保护髓核细胞免于凋亡并促进其增殖。此外，AKT的自噬可以促进髓核细胞抗氧化能力的增强26-27。TNF-是一种多效性促炎细胞因子，属于TNF配体超家族。Wang等28在猪模型椎间盘中注入TNF-后，出现退行性特征，包括纤维环破裂、髓核基质降解、细胞聚集和血管化，表明对TNF通路的有效抑制可以减缓椎间盘的退变图11分子对接模式图表5杜仲腰痛丸关键成分与对应核心靶标的分子对接成分quercetinluteolinlicochalcone a结合能（kcalmol-1）MAPK1(1PME)-7.1-7.47-7.31JUN(5T01)-7.21-7.51-7.54RELA(3QXY)-7.97-8.32-8.571710 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化整合药理学研究及炎症反应，从而缓解机体疼痛症状。IL-17是一种促炎细胞因子，在介导自身免疫中起关键作用。Wang等29研究发现靶向IL-17A的单克隆抗体可改善放射学和非放射学中轴型脊柱关节炎患者的体征和症状，以及脊柱和骶髂关节的MRI炎症，且在对非甾体抗炎药疗效差的患者以及用肿瘤坏死因子抑制剂治疗失败的患者中作用也很明显。AGEs是异质分子，来源于葡萄糖或其他糖类对包括蛋白质、脂质和核酸在内的大分子的翻译后非酶修饰，并通过与其受体RAGEs结合，可以促进氧化应激，从而导致促炎细胞因子和炎症反应的产生30。研究发现，AGE积累与软骨内骨化有关，并通过AGE-RAGE通路诱导椎间盘细胞肥大和成骨分化31。且Lin等32发现，AGEs的积累与氧化应激密切相关，并会导致髓核细胞氧化微环境的改变，进而引起椎间盘退变。因此，通过AGE-RAGE通路靶向清除AGEs可以有效调节抗氧化应激和炎症反应来延缓椎间盘的退变。本研究所筛选获得的核心成分与关键靶标全部成功对接，且槲皮素、木犀草素及甘草查尔酮a三种关键成分与核心靶标MAPK1、JUN、RELA之间的结合能值均小于-7.0 kcalmol-1，表明其分子间的结合活性较为强烈。本研究通过运用生物信息学、网络药理学33-34构建及分子对接的前沿技术联合动物实验，从微观层面展示了杜仲腰痛丸能够有效缓解LDH患者临床症状主要是通过槲皮素、木犀草素、甘草查尔酮a、山奈酚、柚皮素等有效成分作用于 JUN、MAPK1、RELA、MYC、STAT3、ESR1、MAPK14、FOS、TP53等多种基因靶标，从而影响PI3K-Akt信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17信号通路及AGE-RAGE等信号通路而发挥功效，此研究为后续临床应用杜仲腰痛丸治疗LDH常见疼痛症状提供了实验数据支持，证实了中药可以从多靶点、多成分、多通路对疾病的发生、发展及预后进行干预。但是本文仅从网络计算机模拟预测出发，未考虑到药物间成分含量在进入人体内代谢后各成分间的药理学变化，所以更深入的分子机制仍然需要进一步验证。参考文献 21Kim H,Hong J Y,Lee J,et al.IL-1 promotes disc degeneration and inflammation through direct injection of intervertebral disc in a rat lumbar disc herniation model.Spine J,2021,21(6):1031-1041.2秦晓宽,孙凯,方圣杰,等.基于文献数据挖掘和网络药理学分析的腰椎间盘突出症用药规律及作用机制研究.中药新药与临床药理,2021,32(10):1490-1499.3Al Qaraghli MI,De Jesus O.Lumbar Disc Herniation.San Francisco:StatPearls,2023.4方鹏飞,温剑涛,刘宗玮.杜仲腰痛丸治疗腰椎间盘突出症临床研究.新中医,2021,53(21):125-129.5赵宁,赵继荣,张海清,等.PLDD联合脊柱调衡手法及杜仲腰痛丸治疗腰椎间盘突出症的临床疗效观察.应用激光,2021,41(2):416-420.6王国慧,赵继荣,赵宁.杜仲腰痛丸联合电针刺激治疗腰椎间盘突出症的临床观察.中国中医急症,2019,28(3):522-524.7张思胜,赵继荣,张绍文,等.杜仲腰痛丸对髓核非压迫性突出大鼠背根节中降钙素基因相关肽含量的影响.兰州大学学报(医学版),2006,32(2):35-39.8赵继荣,张思胜,徐磊.杜仲腰痛丸对髓核非压迫性突出大鼠背根节中P物质含量的影响.中医正骨,2008,20(2):3-5.9Shamji M F,Allen K D,Stephen S,et al.Gait abnormalities and inflammatory cytokines in an autologous nucleus pulposus model of radiculopathy.Spine,2009,34(7):648-654.10 裴超,邵霖霖,刘晶,等.基于网络药理学与分子对接技术探讨红花治疗视网膜静脉阻塞的作用机制研究.天然产物研究与开发,2020,32(11):1844-1851.11 钟远鸣,万通,何炳坤,等.活血化瘀类中药注射剂辅助治疗腰椎间盘突出症的网状Meta分析.中华中医药学刊,2021,39(3):1-5.12 沈毅弘,朱立,吴子健,等.中药熏蒸联合体外冲击波治疗气滞血瘀型腰椎间盘突出症的临床疗效观察.中国中西医结合杂志,2021,41(7):801-805.13 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