基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法.pdf

QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期0引言哺乳动物细胞冷冻的标准方法是将细胞置于含有 5%10%二甲基亚砜渊DMSO冤和一定比例血清的细胞保存液中袁于液氮中进行长期保存遥DMSO 是一种有机极性分子袁能够渗透入细胞袁在一定程度上通过调节冷冻过程中溶质浓度的增加来减轻细胞的受损程度1遥 同时袁DMSO 的存在可以减少细胞内部冰晶的形成袁从而减少细胞膜的机械破坏和细胞器的损伤2遥 而在细胞冻存液中添加一定比例的血清袁可以帮助细胞在冷冻和解冻过程中提供多种细胞生长因子尧蛋白质和营养物质袁以更好地保持细胞状态和减少损伤遥 也因此袁自 20 世纪 50 年代开始袁该方法一直是细胞冻存领域的金标准方法遥随着技术的发展袁 对上述细胞冻存方法进行了更深入地研究和优化遥 例如袁DMSO 作为有机溶剂袁对细胞存在一定毒性袁 可诱导细胞凋亡或破坏细胞内酶活性袁 因此有研究使用包括抗冻蛋白尧 聚乙烯醇尧海藻糖尧脯氨酸尧高分子多聚物等在内的成分作为冻存保护剂渊Cryoprotectants袁CPAs冤袁以替代或减少 DMSO 的用量3-4遥 又例如袁由于血清中含有的动物源成分和成分的不确定性袁 研究使用其他蛋白替代血清袁进而研究无血清尧无蛋白的细胞冻存液5遥再例如袁传统细胞冻存都依赖于液氮的低温环境袁但液氮的使用存在一定限制袁所以研究在-80益长期保存细胞的细胞冻存液袁以摆脱对液氮的依赖等等6遥上述研究方向中一种可能的思路是袁 利用细胞基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法姬莉莉1*石文迪2赵大力3孙玉4渊1.北京市怀柔区疾病预防控制中心北京101400曰2.北京亦泰生物技术有限公司曰3.吉林国际旅行卫生保健中心曰4.吉林省中医药科学研究院冤摘要院本文使用一种基于高分子聚合物的细胞保护剂渊CCM046冤冻存和复苏悬浮型 MDCK 细胞袁并探索开发一种更加便捷的流感病毒培养方法遥 结果显示袁CCM046 细胞冻存液可稳定的于-80条件下保存悬浮型 MDCK 细胞袁且细胞活力稳定袁可在复苏后快速恢复细胞增殖遥 在细胞复苏 24 h 后进行攻毒实验袁培养 48 h 后所产生的流感病毒含量基本与持续培养的新鲜细胞相同袁初步证明该方法可用于建立一种快速尧便捷的使用 MDCK 细胞培养和分离流感病毒的技术方法遥关键词院悬浮型 MDCK 细胞曰细胞冻存曰细胞复苏曰流感病毒中图分类号院R183.1A method for cultivating and isolating influenza virus based oncryopreservation and rapid revival of MDCK cells cultured in suspensionJI Lili1*袁SHI Wendi2袁ZHAO Dali3袁SUN Yu4渊1.Huairou District Centers For Disease Control And Prevention袁Beijing袁101400袁China曰2.Beijing Yitai Biotech Co.袁Ltd.曰3.Jilin International Travel Health Care Center曰4.Jilin Province traditional Chinese medicine institute冤Abstract院MDCK cells cultured in suspension were subjected to cryopreservation and subsequent revival using a cryopreser-vation medium supplemented with high molecular weight polymers.This approach was employed to assess the feasibility ofdeveloping a streamlined procedure for cultivating influenza virus.The findings indicated that the cryopreservation solutioneffectively maintained the viability of MDCK cells cultured in suspension at-80 degrees Celsius袁ensuring consistent cell via-bility and enabling rapid cellular proliferation upon revival.Furthermore袁following a 48-hour influenza virus infection period袁the viral yield obtained from cells recovered 24 hours after cryopreservation was comparable to that from continuously cul-tured fresh cells.These preliminary findings imply that this method holds promise for the establishment of a rapid and ex-pedient protocol for both influenza virus cultivation and isolation袁built upon MDCK cell cultures.Keywords院MDCK cells cultured in suspension曰Cell cryopreservation曰Cell resuscitation曰Influenza virus第一作者渊通信作者冤E-mail院基金项目院海南省重点研发计划项目渊ZDYF2021SHFZ069冤收稿日期院2023-08-31窑56窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING冻存液中的高分子聚合物袁 在冷冻过程中通过化学方式在细胞表面形成一层高分子聚合物保护层袁该保护层可以减轻冷冻过程中溶液中形成的冰晶对细胞膜所造成的机械性损伤袁从而实现在冷冻过程中对细胞的保护遥 同时袁这一保护机制也为在更高温度下袁例如-80益袁保存冻存的细胞提供了可能4袁7遥 CCM046细胞冻存液即是一种基于上述思路研发的细胞冻存液遥 该冻存液具有不含血清尧不含蛋白质尧成分简单明确等特点袁同时袁使用该细胞冻存液冻存的细胞袁可于-80益放置袁极大方便细胞冻存的储存和运输遥本文拟利用 CCM046 细胞冻存液冻存悬浮型MDCK 细胞渊后简称 MDCK-S冤袁并通过评估冻存前后细胞的存活率和细胞活力等指标袁 探索开发一种更加便捷的流感病毒培养流程的可能性遥1材料和方法1.1细胞培养悬浮型 MDCK 细胞渊MDCK 33016PF冤使用编号为 CDM Lonza 00194243 的无血清培养基培养袁并添加双抗遥培养时使用摇床于 5%CO237益环境下袁转速为 125 r/min遥1.2细胞冻存和复苏将MDCK-S细胞培养至增值期袁浓度约为5伊106/mL袁使用新鲜培养基调整浓度至约 2.5耀3伊106/mL 后袁取10 mL袁175 g 离心 5 min遥 离心后去上清袁使用 1 mLCCM046 细胞冻存液重悬袁或者使用 1 mL 含有 10%DMSO 的无血清培养基重悬遥 重悬后加入到 1.8 mL细胞冻存管内袁于-80益冷冻过夜遥 使用 CCM046 细胞冻存液冻存的细胞袁于-80益保存遥 使用 DMSO 冻存的细胞则转入液氮保存遥细胞复苏时袁取 1 管待复苏细胞袁立即于 37益温水中顺时针旋转细胞冻存管袁 直至细胞冻存管内细胞冻存液完全融化遥 之后将融化后的细胞冻存液加入到 10 mL 无血清培养基内袁混匀并使于 175 g离心 5 min遥 离心后去上清袁使用 10 mL 新鲜无血清培养基重悬遥 重悬后的细胞加入到 50 mL 体积的细胞培养管内袁使用摇床于 5%CO237益环境下培养袁转速 125 r/min遥 复苏后的细胞培养 24 h 后袁取 10 mL加入 40 mL 新鲜无血清培养基袁并转入 250 mL 细胞摇瓶中袁继续传代培养遥1.3细胞存活率测定使用台盼蓝染色对细胞存活率进行计数遥 具体方法为院根据细胞生长情况对细胞进行稀释曰稀释后的细胞与 0.4%的台盼蓝溶液 1颐1 混合曰使用血球计数板对活细胞数尧死细胞数进行计数曰每个细胞样品取样 2 次袁分别计数袁最终结果取平均值遥 在进行数据分析时袁为方便不同次实验之间的结果对比袁将单次实验内冻存前细胞数定值为 100袁 复苏后和复苏24 h 后的细胞数根据其与冻存前细胞数的比值袁按100 的相应比例定值袁细胞死亡率=死细胞数/渊活细胞数+死细胞数冤伊100%遥1.4甲型流感病毒接种和检测取 1 株实验室保存的甲型流感病毒样本袁 向使用 CCM046 细胞冻存液冻存后复苏 24 h 的 MDCK-S细胞中接种 100 滋L遥 同时向细胞浓度相同的持续培养的 MDCK-S 细胞中接种 100 滋L 同一毒株袁作为对照组遥分别培养 2 d 后袁根据叶国家流感中心标准操作规程曳渊2007 版冤8袁收集培养上清袁提取核酸并使用实时荧光 RT-PCR 对甲型流感病毒 RNA 进行测定遥2结果与分析2.1 细胞冻存前后细胞数量的变化和细胞存活率评价MURRAY 等9研究指出袁细胞在冻存过程中袁如果仅评估复苏后细胞的存活率袁 则冻存液的实际保护效能有可能被高估袁 有必要同时对细胞冻存前后细胞数量进行测定袁评估细胞在冻存过程中的损失袁以便更加准确的判断细胞冻存液对细胞的保护情况遥 因此袁本实验对 MDCK-S 细胞在冻存前尧复苏后和复苏后 24 h袁使用台盼蓝染色方法对 MDCK-S 细胞数量和细胞存活率进行测定并记录和分析遥 结果如图 1A 和图 1B遥图 1B注院图 1A 为 MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞数量的对比结果曰图 1B 为 MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞死亡率的对比结果遥图 1MDCK-S 细胞冻存前尧复苏后和复苏 24 h 后细胞数量和细胞死亡率的对比结果Fig.1Cell number and cell death rate of MDCK-S cellsbefore cryopreservation袁after revival袁and 24 hours after revival图 1A窑57窑QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期图 2使用 CM046 冻存 MDCK-S 细胞袁复苏后细胞状态能够得到快速恢复Fig.2Rapid recovery of cell viability after revival usingCM046 for cryopreservation of MDCK-S cells分别使用 CCM046 细胞冻存液和含有10%DM鄄SO 的无血清培养基的常规细胞冻存液对 MDCK-S细胞进行冻存和复苏测试遥 从图 1A 可见袁MDCK-S细胞使用 DMSO 冻存液或 CCM046 冻存液进行冻存尧复苏后袁细胞数量均较冻存前稍降低袁CCM046冻存液的细胞数量略低于 DMSO 冻存液袁低约 5%左右遥在复苏 24 h 后袁使用 DMSO 冻存液或 CCM046 冻存液冻存并复苏的细胞袁均有明显增殖袁使用 CCM046冻存液的细胞数量略高于使用 DMSO 冻存液的细胞袁略高约 10%遥 因复苏后 CCM046 冻存液处理的细胞袁其数量与经 DMSO 冻存液处理后的略低袁故使用 CCM046 冻存液冻存和复苏 MDCK-S 细胞袁较好地维持了细胞活力袁复苏后可快速恢复增殖状态袁其对 MDCK-S 细胞的保护能力等同于或略高于 DM鄄SO 保存液的保护能力遥图 1B 所显示的 MDCK-S 细胞经冻存和复苏后袁 细胞死亡率的数据也支持上述结论遥 由此可知袁 使用 CCM046 和 DMSO 冻存和复苏MDCK-S 细胞袁在复苏后和复苏 24 h 后袁两者的细胞死亡率数据基本保持一致遥2.2复苏后 MDCK-S 细胞增殖情况评价细胞增殖情况是表征细胞状态的重要指标袁本实验对复苏后的细胞增殖情况采用台盼蓝计数的方法袁 对 MDCK-S 细胞在复苏 24 h 后并传代培养的细胞增殖情况进行了测试遥 实验同时使用持续培养的 MDCK-S 作为对照组袁细胞数量经调节至与测试组细胞浓度相同遥 使用 CCM046 冻存液冻存的细胞袁复苏了 24h 后传代培养袁分别在培养 1尧2d 后对细胞数量进行计数遥 同时对持续传代培养的 MDCK-S细胞进行计数袁两者比较细胞增殖情况遥 由图 2 可见袁使用CCM046 冻存液的 MDCK-S 细胞在复苏 24 h后传代袁其增殖速度基本与持续培养的 MDCK-S 细胞相同袁说明采用 CCM046 冻存液冻存的 MDCK-S细胞袁在冻存和复苏后袁较好的保持了细胞活力袁在复苏 24 h 后即可基本恢复细胞增殖状态遥2.3稳定性评价为评估使用 CCM046 细胞冻存液冻存 MDCK-S 细胞后于-80益保存的稳定性袁将冻存后的细胞分别于-80益保存 0 个月尧1 个月尧3 个月和 6 个月袁到期后取出复苏遥 对刚复苏和复苏后 24 h 的细胞袁使用台盼蓝染色对细胞数量和细胞存活率进行测定并记录袁结果如图 3遥由图 3 可见袁在 6 个月期内袁使用 CCM046 细胞冻存液冻存并保存于-80益的 MDCK-S 细胞袁细胞数量和细胞存活率基本稳定袁在复苏后增殖情况基本一致袁保持了良好的细胞状态遥2.4甲型流感病毒攻毒实验根据前述结果袁可以认为使用 CCM046 细胞冻存液冻存的 MDCK-S 细胞袁在冻存尧复苏和储存过程中袁 可稳定保持 MDCK-S 的细胞数量和存活率袁同时细胞状态在复苏后亦能够得到快速恢复遥 为进一步评估该结论袁使用本实验室保存的 1 株甲型流感病毒毒株对复苏 24 h 后的 MDCK-S 细胞进行了攻毒实验袁同时与使用持续培养的 MDCK-S 细胞攻毒实验结果进行对比袁评估使用 CCM046 细胞冻存液冻存和复苏 24 h 后袁MDCK-S 细胞状态对于流感病毒分离尧培养效果的影响遥 攻毒 48 h 后袁收集细胞培养上清袁提取 RNA 并使用实时荧光 RT-PCR对细胞培养上清中的 RNA 浓度进行检测遥 结果如图 4遥本试验使用实时荧光 RT-PCR 结果的 CT 值作为样品中 RNA 含量的表征袁 由图 4 可知袁 使用CCM046 细胞冻存液冻存和复苏 24 h 后攻毒并培养 48 h袁 细胞培养上清中的 RNA 含量与使用持续培养的 MDCK-S 细胞培养上清中 RNA 含量基本相同袁说明使用 CCM046 细胞冻存液冻存的 MDCK-S细胞袁在复苏后可快速恢复袁复苏 24h 后即可用于流感病毒的培养和分离遥图 3MDCK-S 细胞使用 CCM046 冻存后长期保存的稳定性测试Fig.3Long-term stability test of MDCK-S cellscryopreserved using CCM046窑58窑质量安全与检验检测Vol.33 No.5 2023年第5期QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING3讨论使用 MDCK 细胞渊Madin-Darby canine kidney冤培养和分离流感病毒的方法是国际国内通用的标准技术方法8,10遥 悬浮型 MDCK 细胞是在贴壁型 MD鄄CK 细胞的基础上经驯化后袁 实现无血清大规模悬浮培养11遥同时袁悬浮型 MDCK 细胞拥有更高的病毒吸附表面积袁从而提高病毒培养和分离的灵敏度12遥然而采用上述方法过程繁琐复杂袁一方面袁MDCK 细胞复苏后需至少一周左右的传代培养才能用于病毒培养袁严重影响实验效率曰另一方面袁虽然可以选择在实验室长期维持培养 MDCK 细胞袁但由于流感病毒培养需使用低传代数的细胞10袁也意味着该方法不仅费时费力袁意义也并不显著遥 因此袁探索能够在MDCK 细胞冻存和复苏过程中能够维持细胞活力袁并在复苏后能够快速恢复的 MDCK 细胞冻存和复苏方案袁 并在此基础上尝试建立更加便捷的流感病毒培养和分离方案袁具有一定的意义和价值遥本研究使用 CCM046 细胞冻存液用于悬浮型MDCK-S 细胞的冻存和复苏袁 并参考了 Murray 等9提出的评估方法遥 结果显示袁该细胞冻存液可稳定的于-80益条件下保存 MDCK-S 细胞袁 且细胞活力稳定袁可在复苏后快速恢复细胞增殖遥 进一步的袁在细胞复苏 24 h 后进行攻毒实验袁48 h 后所产生的流感病毒含量基本与持续培养的新鲜细胞相同袁 也证明细胞冻存和复苏前后细胞状态保持了相对稳定遥综上所述袁 本研究尝试探索一种更加简便快捷的流感病毒培养和分离的方法遥 初步证明该方法可在需要时复苏悬浮型 MDCK 细胞并在复苏 24 h 后进行攻毒实验袁无需进行持续的细胞培养袁实验步骤简单袁提高了检测效率袁是一种值得继续深入研究和验证的技术改进方法遥参考文献1OCK S A袁RHO G J.Effect of dimethyl sulfoxide渊DMSO冤on cryopreservation of porcine mesenchymal stem cells渊pMSCs冤 J.J Cell transplantation袁2011袁20渊8冤院1231-9.2MANDUMPAL J B袁KRECK C A袁MANCERA R L.Amolecular mechanism of solvent cryoprotection in aqueousDMSO solutionsJ.Physical Chemistry Chemical Physics袁2011袁13渊9冤院3839-42.3LIU X袁PAN Y袁LIU F袁et al.A review of the materialcharacteristics袁antifreeze mechanisms袁and applications ofcryoprotectants 渊CPAs冤J.Journal of Nanomaterials袁2021袁2021院9990709.4MURRAY K A袁GIBSON M I.Chemical approaches tocryopreservationJ.Nature Reviews Chemistry袁2022袁6渊8冤院579-93.5SASAKI M袁KATO Y袁YAMADA H袁et 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