环丙沙星生物条形码检测技术的研究.pdf

食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究基金项目:河北省重点研发计划项目（19225504D）；河北北方学院省属高校基本科研业务费项目（JYT2022010）作者简介：栗慧（1992），女（汉），硕士，研究方向：食品安全与检测。*通信作者:魏东（1971）,男（汉），研究员，博士，研究方向：药物残留检测。DOI：10.12161/j.issn.1005-6521.2023.18.023环丙沙星生物条形码检测技术的研究栗慧1，2，3，于苗1，2，3，孙丰梅1，2，3，魏玉文4，魏东1，2，3*（1.河北北方学院 河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室，河北 张家口 075000；2.河北北方学院 农林科技学院，河北 张家口 075000；3.河北北方学院 张家口市特色农产品质量安全重点实验室，河北 张家口 075000；4.张家口市动物卫生监督所，河北 张家口 075000）摘要：该文对快速检测食品中环丙沙星残留的生物条形码检测技术进行研究。首先将环丙沙星多克隆抗体与条形码 DNA 链共同修饰在纳米金颗粒上制备纳米金复合探针、环丙沙星单克隆抗体与磁性颗粒结合制备磁性探针，然后对其采用可见光光谱法、透射电镜法进行鉴定；其次将上述探针与环丙沙星标准品进行杂交反应，在磁场的作用下，去除未结合的纳米金复合探针，然后收集标记成功的纳米金复合探针释放出的 DNA 链，采用微孔板银染的生物条形码技术进行检测，得到环丙沙星残留量。检测环丙沙星的最低检出限为 2.13 ng/mL。该方法与常规免疫检测方法相比灵敏度增强，具有实用性，为未来检测小分子物质残留量提供了新思路，也为制备环丙沙星生物条形码检测试剂盒奠定了基础。关键词：环丙沙星；纳米金复合探针；磁性探针；三明治结构；生物条形码Biological Barcode Detection of CiprofloxacinLI Hui1，2，3，YU Miao1，2，3，SUN Fengmei1，2，3，WEI Yuwen4，WEI Dong1，2，3*（1.Hebei Key Laboratory of Quality&Safety Analysis-Testing for Agro-Products and Food，Hebei NorthUniversity，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；2.College of Agriculture and Forestry Science and Technology，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；3.Zhangjiakou Key Laboratory of Quality&Safetyfor Characteristics Agro-Products，Hebei North University，Zhangjiakou 075000，Hebei，China；4.ZhangjiakouAnimal Health Supervision Institute，Zhangjiakou 075000，Hebei，China）Abstract：This study investigates the biobarcode detection technology for rapid detection of enrofloxacinresidues in food.Firstly，enrofloxacin polyclonal antibodies and barcode DNA strands are immobilized on goldnanoparticles to prepare nanocomposite probes，while enrofloxacin monoclonal antibodies are conjugated tomagnetic particles to prepare magnetic probes.The probes are characterized using visible light spectroscopy andtransmission electron microscopy.Then，the probes are hybridized with enrofloxacin standard samples，and unbound nanocomposite probes are removed using a magnetic field.The released DNA strands from the successfully labeled nanocomposite probes are collected，and the residual enrofloxacin is detected using the biological barcode technique with silver staining on a microtiter plate.The method achieves a minimum detection limit of 2.13ng/mL for enrofloxacin.Compared to conventional immunoassay methods，this approach enhances sensitivity anddemonstrates practicality，providing a new strategy for the detection of small molecule residues and laying thefoundation for the development of enrofloxacin biobarcode detection kits in the future.Key words：ciprofloxacin；nano-gold composite probe；magnetic probe；sandwich structure；biological barcode引文格式：栗慧，于苗，孙丰梅，等.环丙沙星生物条形码检测技术的研究J.食品研究与开发，2023，44（18）：172-178.LIHui，YUMiao，SUNFengmei，etal.BiologicalBarcodeDetectionofCiprofloxacinJ.FoodResearchandDevelopment，2023，44（18）：172-178.检测分析172食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究环丙沙星（ciprofloxacin，CPFX）属于氟喹诺酮类药物，物理形态为结晶粉末，颜色呈现为白色或微黄色，化学分子式为 C17H18FN3O31。其药物作用为破坏细菌DNA 的双螺旋链，干扰其 DNA 转录、复制及重组等过程。医学上一般应用于由敏感病原体引起的呼吸道感染、胃肠道感染、肺部感染、泌尿道感染和局部感染等疾病2-5。由于其抗菌活性比其他氟喹诺酮类药物强，尤其是对革兰氏阴性菌和支原体，是氧氟沙星和培氟沙星的 4 倍，所以在动物养殖过程中被广泛应用，但其存在一定的不良反应发生率、二重感染率以及细菌耐药性等问题，特别是耐药性问题，对环丙沙星产生耐药性后，可能也会引发对其他喹诺酮类药物的交叉耐药性，甚至对氨基糖苷类药物也产生耐药性6-8。目前，对我国食品中兽药的最大残留限量采用 GB 316502019 食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量，标准中规定了环丙沙星在牛、羊、猪的肌肉中允许残留的最大限量为 400 g/kg，在家禽肌肉中允许残留的最大限量为 300 g/kg，鱼（皮+肉）中允许残留的最大限量为 300 g/kg9。近年来，动物源性食品中的环丙沙星残留问题引起了消费者的广泛关注。目前，对动物源性食品中 CPFX 残留的检测方法包括微生物法10与仪器方法11-12等，其中最常用的方法是高效液相色谱法和高效液相串联质谱法，这些方法结果可靠，可满足一般检测。但这些方法样品前处理较为繁琐，需要操作人员有较高的专业性知识，且仪器价格较为昂贵13-15。因此，迫切需要建立一种灵敏性高、操作简单易学、结果可靠的检测手段。生物条形码检测技术是近年兴起的一种快速检测新技术，其原理是指通过化学、静电耦合等方式首先将相同序列的 DNA 条形码耦连在纳米金颗粒表面，其次将检测抗原耦连在磁性微球表面，以形成“纳米金探针目标物磁性探针”的三明治结构，检测其条形 DNA 码含量，以此实现高灵敏度检测残留药物的方法。该技术具有操作步骤相对简便、准确度高、特异性强、不需要大型仪器辅助等优点，被广泛应用于医学检验与检疫、食品卫生检测、环境监测等各个领域16-20。目前，生物条形码检测技术与其他多种技术相结合，包括生物芯片印染技术、酶标纳米金探针技术、生物传感器技术、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）技术以及微孔板银染技术等。通过与上述技术相结合，更加提高了生物条形码技术的灵敏性和准确度。本研究采用生物条形码技术与微孔板银染技术相结合的方法，首先将 DNA 链与环丙沙星多克隆抗体标记于纳米金颗粒表面制备纳米金探针，其次将环丙沙星单克隆抗体标记于磁性微珠表面制备磁性探针；然后制备三明治结构，获取 DNA 链，建立一种使用酶标仪快速检测 CPFX 残留的方法。为 CPFX 药物残留的定量定性检测研究开拓思路，对保障我国动物源性食品质量安全具有重大的意义。1材料与方法1.1材料与试剂环丙沙星标准品：中国兽医药品监察所；纳米金：上海金标生物科技有限公司；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）：美国Sigma 公司；环丙沙星单克隆抗体：MedChemExpress 试剂公司；羧基化的磁珠：海狸生物有限公司；银染增强液（A 液、B 液）、杂交缓冲液：瑞士罗氏公司；DNA 链：生工生物工程（上海）股份有限公司；环丙沙星多克隆抗体：河北北方学院河北省农产品食品质量安全分析检测重点实验室自制。1.2仪器与设备电子天平（LE225D）：北京赛多利斯仪器系列有限公司；恒温磁力搅拌器（JB-2 型）：上海雷磁新经仪器有限公司；离心机（TGL-16A）：金坛市仪都仪器有限公司；紫外-可见分光光度计（Lambda365）：铂金埃尔默仪器有限公司；透射电子显微镜（7650）：日本日立公司。1.3寡核苷酸链的设计与合成试验用 DNA 链如表 1 所示。1.4试验方法1.4.1纳米金探针的制备首先取1mL纳米金溶液，通过加入浓度为0.25mol/LK2CO3将其 pH 值调节为 9.0；然后将 1.2 g/mL 的环丙沙星多克隆抗体加入到上述纳米金溶液中，在室温条件下，充分振荡孵育 1 h；而后加入稳定剂（5%BSA），以防止胶体金颗粒和抗体发生聚集和沉淀。将寡核苷酸 A 链（0.5 OD/mL）加入上述已制备完成的混合液中，室温静置 48 h，用磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）调节 pH 值至 7.0，然后离心 15 min，转速为 10 000 r/min；最后加入寡核苷酸D 链（0.5 OD/mL），室温杂交 8 h，离心 20 min，转速为10 000 r/min 即得到纳米金复合探针，4 保存备用。表 1试验用 DNA 链Table 1DNA chain for testDNA 链序列A5-GGCAATCATGCAATCCTGAATGCGA10-（CH2）-SH-3B5-Bio-（A10）-ATGGATGATGTGGTA-3C5-HS-（CH2）6-A10-TACGAGTTGAGACCGTTAAGACGA-3D5-CGCATTCAGGATTGCATGATTGCCTCGTCTTAACGGT-CTCAACTCGTA-3检测分析173食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究1.4.2纳米金探针的鉴定1.4.2.1可见光光谱法鉴定纳米金探针使用紫外-可见分光光度计，波长选择在 400700 nm 之间，对纳米金探针溶液进行扫描，得到纳米金探针的可见光吸收光谱，观察其波形是否为光滑曲线，是否有最大吸收峰，以此确定纳米金探针是否制备成功。1.4.2.2透射电镜法鉴定纳米金探针在鉴定前对纳米金探针溶液进行 15 min 超声处理，目的是分离样品，防止样品发生团聚。先将少量纳米金探针溶液滴于承载样品的铜网上，然后用滤纸吸收多余试剂，在室温条件下干燥 30 min，放置于透射电镜下观察其形状及分布情况，进一步鉴定纳米金探针是否制备成功。1.4.3磁性探针的制备1.4.3.1磁性颗粒的活化取 5 mL 磁珠放入含有 45 mL PBS 的离心管中充分振荡混匀，然后放置于磁力架上磁性分离，弃去上清溶液；为保证完全去除保护磁珠的活化液，用 PBS缓冲液冲洗磁珠 4 次；加入 5%戊二醛溶液 30 mL，放入振荡器中振荡 3 h，振荡完成后重复上述步骤 1 次；最后将磁珠混匀于 20 mL 的含吐温-20 的磷酸盐缓冲液中，于 4 保存。1.4.3.2磁性颗粒与 CPFX 单克隆抗体结合完成 1.4.3.1 步骤后，将 10 L 浓度为 2 g/mL 的CPFX 单抗加入到磁珠溶液中，振荡反应 24 h，放置于磁力架上磁性分离，弃去上清液；加入 40 mL PBS 缓冲溶液和 20 mL 甘氨酸溶液先后与分离后的磁珠混匀，振荡反应 30 min，重复进行磁性分离，弃去上清液，用PBS 缓冲溶液重复清洗 3 次，完成清洗后加入 45 mLPBST 溶液置于 4 条件下保存。1.4.4磁性探针的鉴定磁性探针的鉴定选用透射电镜法，先将少量磁性探针溶液滴于承载样品的铜网上，然后用滤纸吸收多余试剂，在室温条件下干燥 30 min，放置于透射电子显微镜下观察其形状与分散情况，以此鉴定磁性探针是否制备成功。1.4.5检测探针的制备将寡核苷酸 C 链用 TE 缓冲液溶解，再按照 1300的体积比与三（2-羧乙基）膦溶液混合，二者充分混匀12 h。然后将上述溶液加入到制备好的纳米金溶液中混合均匀，室温放置 20 h。在此过程中，分 6 次加入4 mL NaCl 溶液（0.2 mol/L），老化 40 h。在 4 条件下以 10 000 r/min 的转速离心 30 min，弃去上清液，最后加入 1 mL 的磷酸盐缓冲液（浓度为 10 mmol/L）混匀，所得到检测探针 4 保存。1.4.6检测探针的鉴定1.4.6.1可见光光谱法鉴定检测探针参照 1.4.2.1 的方法对检测探针溶液进行扫描鉴定，得到检测探针的可见光吸收光谱，观察吸收光谱是否为光滑曲线，并且有最大吸收峰值，以此鉴定其是否制备成功。1.4.6.2透射电镜法鉴定检测探针在鉴定前对检测探针溶液进行 10 min 超声处理，参照 1.4.2.2 的方法对检测探针溶液进行观察，鉴定其是否制备成功。1.4.7竞争免疫体系的建立在室温条件下，将待检样品（CPFX 标准品）0.01 mmol/L 加入到磁性探针溶液中，振荡反应 1 h，使其充分杂交融合。振荡完成后，置于磁力架上磁性分离，用 PBS 溶液清洗 34 次，去除未结合上的待检样品。分离完成后加入纳米金复合探针溶液，使其三者形成一个夹心结构，振荡反应 45 min；同样进行磁性分离和 PBS 缓冲溶液清洗步骤 45 次，除去未结合成功的探针。在上述制备完成的溶液中加入无菌水，在60 的条件下，充分振荡反应 1 h，置于磁力架上分离，收集上清液，此时该上清液中含有生物条形码。1.4.8基于生物素-亲合素系统酶标板杂交体系的建立取 25L1.4.7 中制备完成的溶液，向其中加入 2L生物素探针溶液和 25 L 罗氏杂交缓冲液，于室温条件下混合均匀，充分反应 15 min；再向其中加入 5 L检测探针溶液继续反应 15 min；反应完成后将上述所得溶液加入到已预先包被好链霉亲和素的酶标板中，25 条件下，孵育 1 h；孵育完成后用含吐温-20 的磷酸盐缓冲液进行洗板工作，共 3 次；将 50 L 银染增强A 液和 B 液迅速混匀后加入酶标板内，置于避光环境下反应一段时间，放入超纯水中终止银染反应，完成终止反应后用酶标仪记录各孔在 630 nm 处的吸光度。1.4.9优化微孔板内的杂交体系1.4.9.1优化包被浓度建立微孔板内的杂交体系中关键步骤为链霉亲和素的包被浓度，依次选择 0、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/kg5 个浓度值，按照 1.4.8 中的步骤，测定各孔在 630 nm处的吸光度，从中选出链霉亲和素的最佳包被浓度。1.4.9.2优化检测探针浓度检测探针浓度的优化有利于提高检测技术的灵敏度，依次选择 0、30、60、90、120 nmol/L 5 个浓度值，按照 1.4.8 中的步骤，测定各孔在 630 nm 处的吸光度，从中选出检测探针的最佳浓度。1.4.9.3优化生物素探针浓度若生物素探针浓度过高可能会抑制检测技术的灵敏度，浓度过低而会使杂交体系反应不充分。因此检测分析174食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究图 5检测探针透射电镜图Fig.5Transmission electron microscope of detection probe依次选择 0、25、50、75、100、125、150 nmol/L 7 个浓度值，按照 1.4.8 中的步骤，测定各孔在 630 nm 处的吸光度，从中选出生物素探针的最佳浓度。1.4.9.4优化银染时间若银染反应时间过长则会导致阴离子产生聚集现象，反应时间过短则会导致反应不充分。因此依次选择 0、2、4、6、8 min 5 个不同的银染时间，按照 1.4.8中的步骤，测定各孔在 630 nm 处的吸光度，从中选出最佳的银染时间。1.5数据处理采用 Origin 2019 软件进行试验数据处理与绘图，WPS 2020 软件进行统计与计算。2结果与分析2.1纳米金探针的鉴定结果2.1.1纳米金探针的可见光光谱鉴定结果纳米金探针可见光谱如图 1 所示。以波长为横坐标，吸光值 A 为纵坐标，测试试验所得纳米金探针溶液，得到一条光滑曲线，具有明显的吸收峰，最大吸收峰 位于 528 nm 附近，其对应的吸光度为 0.952 9。根据杜鹏飞18对纳米金探针的研究，初步证明纳米金探针制备成功。2.1.2纳米金探针的透射电镜鉴定结果纳米金探针的透射电镜鉴定结果如图 2 所示。由图 2 可知，多克隆抗体与 DNA 链标记在粒径为15 nm 的纳米金颗粒上，纳米金探针分散比较均匀，并且纳米金颗粒周围有明显的灰黑色晕环，表明纳米金颗粒、多克隆抗体及 DNA 链标记较为成功。2.2磁性探针的鉴定结果磁性探针的透射电镜鉴定结果如图 3 所示。如图 3 所示，将 CPFX 单克隆抗体与粒径大小为2.8 m 的磁性颗粒修饰完成后，其磁性探针在颗粒外围形成一圈清楚的光晕，这表明外围有一层低电子密度的物质包围在磁性颗粒表面；从图中可以看出修饰后的磁性颗粒分散较均匀，表明磁性探针制备成功。2.3检测探针的鉴定结果2.3.1检测探针的可见光光谱法鉴定结果检测探针的可见光光谱法鉴定结果如图 4 所示。在波长 400700 nm 下，对检测探针溶液进行检测，以波长为横坐标，吸光度 A 为纵坐标，得光滑曲线（图 4），具有明显吸收峰，最大吸收峰 位于 524 nm附近，其对应的吸光度为 0.762 2，初步证明纳米金探针制备成功。2.3.2检测探针的透射电镜鉴定结果检测探针的透射电镜鉴定结果如图 5 所示。图 1纳米金探针可见光谱图Fig.1Visible spectrum of nano-gold probe图 2纳米金探针透射电镜图Fig.2Transmission electron microscope of nano-gold probe图 3磁性探针透射电镜图Fig.3Transmission electron microscope of magnetic probe图 4检测探针可见光谱图Fig.4Visible spectrum of detection probe检测分析JONJON175食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究图 10银染时间的优化Fig.10Optimization of silver dyeing time1.00.80.60.40.206208银染时间/min吸光度4由图 5 可以看出检测探针分布均匀、颗粒大小一致且颗粒与颗粒之间没有出现重叠在一起的现象，与杜鹏飞18的研究成果较为匹配，证明检测探针制备成功。2.4测定 CPFX 的标准曲线CPFX 标准曲线如图 6 所示。标准曲线的横坐标选用环丙沙星浓度的对数值，纵坐标选用抑制率的倒数，由图 6 可知，环丙沙星浓度的对数值与抑制率的倒数呈良好的线性关系，其回归方程为 y=-2.372 6x+5.709 8，R2=0.994 1，根据所得方程计算，取抑制率 I 为 1.5 时为最低检出限，则环丙沙星浓度为 2.13 ng/mL。结果显示，应用微孔板银染的生物条形码检测方法具有超高的灵敏度与准确性。2.5优化微孔板内的杂交体系2.5.1包被浓度优化结果链霉亲和素包被浓度优化结果如图 7 所示。包被链霉亲和素作为建立杂交体系的基础，其浓度的选择至关重要。由图 7 所知，包被浓度达到 0.10mg/kg后，吸光度值变化趋近于平缓，为保证杂交体系的建立，链霉亲和素的最佳包被浓度为 0.15 mg/kg。2.5.2检测探针浓度优化结果检测探针浓度的优化结果如图 8 所示。由图 8 可知，当检测探针浓度达到 90 nmol/L 后，吸光度值后续变化幅度变小，为优化药品用量，检测探针的浓度确定为 90 nmol/L。2.5.3生物素探针浓度优化结果生物素探针浓度优化结果如图 9 所示。生物素探针作为构成三明治结构的一部分，其浓度的确定尤为重要。由图 9 可知，当生物素探针浓度达到 125 nmol/L 后，吸光度值变化缓慢，为优化生物素探针浓度，因此生物素探针最适浓度确定为 125 nmol/L。2.5.4银染时间优化结果银染时间优化结果如图 10 所示。图 6环丙沙星的标准曲线Fig.6Standard curve of ciprofloxacin图 7链霉亲和素包被浓度的优化Fig.7Optimization of streptavidin coating concentration图 8检测探针浓度的优化Fig.8Optimization of detection probe concentration图 9生物素探针浓度的优化Fig.9Optimization of biotin probe concentration9876543210-1.51.51.00.50-0.5-1.02.0lg 环丙沙星浓度/（ng/mL）1/Iy=-2.372 6x+5.709 8R2=0.994 10.80.60.40.20.200.1000.30链霉亲和素包被浓度/（mg/kg）吸光度3210检测探针浓度/（nmol/L）吸光度-1011010090807060504030201001202.01.51.00.50生物素探针浓度/（nmol/L）吸光度-101101009080706050403020100120140130150检测分析0.150.050.25176食品研究与开发23 年 9 月第 44 卷第 18 期基础研究表 2常见方法结果比对Table 2Comparison of common methods and results方法检出限优点缺点参考文献高效液相色谱法5 g/L高准确度、高灵敏性、高特异性样品前处理复杂、所需仪器贵重、需要较高知识水平的操作人员11酶联免疫吸附法16.29 ng/mL操作简便，成本适中易出现假阳性，准确性特异性稍差1微生物法0.020 g/kg操作简便、价格低廉、前处理简单易受其他药物干扰，准确性、特异性差10本文方法2.13 ng/mL在基础的酶联免疫吸附法上进行改进，提高了特异性及准确性目前仍在研究中，未做到量产应用于实践中银染反应作为测定步骤前的最后一步，反应时间的优化也是关键因素。由图 10 可知，当银染时间达到6 min 后，吸光度值变化缓慢，因此最佳银染时间确定为 6 min。2.6常见方法结果对比环丙沙星残留的检测方法众多，每种方法各有优缺点。通过将本试验方法与其他检测方法进行对比，结果见表 2。由表 2 可知，本研究方法的检出限较低，并且提高了检测的准确度，适合广泛应用于检测过程中。3结论生物条形码检测技术灵敏度高于酶联免疫吸附法检测的灵敏度，并且结合微孔板银染技术，能够对环丙沙星进行微量检测，该技术具有操作相对简便、灵敏度高、特异性强、并且无需大型仪器辅助等优点。本研究所建立的基于微孔板银染的生物条形码检测技术能够实现对环丙沙星残留量快速、准确的检测，首先通过可见光光谱法、透射电镜法鉴定 3 种探针制备成功，其次建立竞争免疫体系和基于生物素-亲合素系统酶标板杂交体系，通过测定其吸光度值确定检出限为 2.13 ng/mL，应用该方法测得的检出限要低于酶联免疫吸附法测得的检出限。由表 2 可知，该方法的建立为未来检测小分子物质残留量提供了新思路，也为制备环丙沙星生物条形码检测试剂盒奠定了基础。参考文献：1杨燕燕.水产品中环丙沙星 ELISA 快速检测试剂盒的初步研制D.福州:福建农林大学,2011.YANG Yanyan.The development of a rapid ELISA test kit for CPFXdetection in aquatic productD.Fuzhou:Fujian Agriculture andForestry University,2011.2李俊锁,王超,邱月明.兽药残留分析M.上海:上海科学技术出版社,2002:258-261.LI Junsuo,Wang Chao,Qiu Yueming.Veterinarydrug residue analysisM.Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,2002:258-261.3孟庆纯.环丙沙星的临床应用及不良反应分析研究J.中国卫生标准管理,2015,6(17):97-98.MENG Qingchun.Clinical application and adverse reaction analysisof ciprofloxacinJ.China Health Standard Management,2015,6(17):97-98.4陆秋习.环丙沙星的特点与临床应用J.右江医学,2000,28(1):41-42.LU Qiuxi.Characteristics and clinical application of ciprofloxacinJ.Youjiang Medical Journal,2000,28(1):41-42.5BROWN S A.Fluoroquinolones in animal healthJ.Journal of Veterinary Pharmacology and Therapeutics,1996,19(1):1-14.6VAN BOECKEL T P,GANDRA S,ASHOK A,et al.Global antibiotic consumption 2000 to 2010:An analysis of national pharmaceutical 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