黄芪多糖对MC-3T3-E1成骨细胞增殖的影响及作用机制研究.pdf

书书书基础研究黄芪多糖对 成骨细胞增殖的影响及作用机制研究王刘玉，万全会，陈军（南阳市第二人民医院，河南南阳 ）摘要目的：探讨黄芪多糖对 成骨细胞增殖的影响及作用机制。方法：将培养的第 代 成骨细胞分为黄芪多糖低、中、高浓度组及黄芪多糖联合抑制剂干预组、对照组，黄芪多糖低、中、高浓度组分别用含有 、黄芪多糖的 培养基进行培养，黄芪多糖联合抑制剂干预组用含有 黄芪多糖和 的 培养基进行培养，对照组用 培养基进行培养。干预 后，检测细胞增殖活力及碱性磷酸酶（，）、骨钙素（，）、淋巴细胞瘤 （，）、相关 蛋白（，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（，）、磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶（，）、内皮型一氧化氮合酶（，）等基因的蛋白表达情况。结果：成骨细胞增殖活力检测结果。黄芪多糖中、高浓度组细胞增殖活力均大于对照组（，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（，；，），黄芪多糖高浓度组细胞增殖活力大于黄芪多糖低、中浓度组（，；，）。成骨细胞成骨标志基因蛋白表达检测结果。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于对照组（：，；，；，；：，；，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；，；：，；，；，），黄芪多糖高浓度组细胞 、的蛋白表达量高于黄芪多糖低、中浓度组（：，；，；：，；，）。成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达检测结果。黄芪多糖中、高浓度组细胞 的蛋白表达量均高于对照组（，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（，；，），黄芪多糖高浓度组细胞 的蛋白表达量高于黄芪多糖低、中浓度组（，；，）；黄芪多糖中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均低于对照组（：，；，；：，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；：，；，），黄芪多糖高浓度组细胞 、的蛋白表达量均低于黄芪多糖低、中浓度组（：，；，；：，；，）。成骨细胞 信号通路相关基因蛋白表达检测结果。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于对照组（：，；，；，；：，；，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；，；：，；，；，）。黄芪多糖高浓度组细胞 、的蛋白表达量高于黄芪多糖低浓度组（，；，）。结论：黄芪多糖能够促进 成骨细胞增殖，且该作用具有一定的浓度依赖性，其作用机制可能与调控线粒体凋亡途径及 信号通路有关。关键词骨质疏松；成骨细胞；细胞增殖；黄芪多糖；信号传导 ：，：通讯作者：陈军 ：中医正骨 年 月第 卷第 期 ，（总 ），（），（），（），（），（），（），（）（）：（，；，）（，；，），（，；，），（：，；，；，；：，；，；，）（：，；，；，；：，；，；，），（：，；，；：，；，）（，；，）（，；，），（，；，）（：，；，；：，；，）（：，；，；：，；，），（：，；，；：，；，），（：，；，；，；：，；，；，）（：，；，；，；：，；，；，），（，；，）：，；骨质疏松症是以骨量丢失、骨微结构破坏为特征的临床常见骨病，骨质疏松症患者骨骼脆性的增加会使骨折风险增加，不仅影响患者的生活质量，也增加了家庭和社会的经济负担。骨质疏松症的发病涉及多因素、多环节、多机制，其中成骨细胞的增殖和分化受到抑制是造成骨量丢失、骨微结构破坏的重要环节 。因此，调节成骨细胞增殖和分化也被认为是治疗骨质疏松症的重要研究方向。近年来，中药汤剂在骨质疏松症治疗中的价值受到了越来越多的关注。黄芪是具有补气升阳、益卫固表作用的一味中药，是多种具有补骨作用的中药方剂的重要组成药物 。黄芪多糖是黄芪中的多糖类活性成分，相关研究发现黄芪多糖能够促进间充质干细胞的成骨分化 ，调控成骨细胞中维生素 受体、羟化酶、羟化酶的表达 。为了进一步探讨黄芪多糖对成骨细胞增殖的影响及作用机制，我们以 成骨细胞为（总 ）中医正骨 年 月第 卷第 期 ，实验对象进行了相关研究，现总结报告如下。材料与仪器 实验材料 成骨细胞，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。实验试剂 培养基、胎牛血清（，）购自美国 公司，黄芪多糖、腺苷一磷酸活化蛋白激酶（，）抑制剂 （美国 公司），细胞活力检测试剂盒（美国 公司），放射免疫沉淀法（，）裂解液、二喹啉甲酸（，）试剂盒（上海碧云天生物科技公司），碱性磷酸酶（，）、骨钙素（，）、淋巴细胞瘤 （，）、相关 蛋白（，）、半胱氨酸天冬氨酸蛋 白 酶（，）、磷酸化 （，）、内皮型一氧化氮合酶（，）一抗及辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白 二抗（美国 公司），增强型化学发光显影液（美国 公司）。实验仪器 型细胞培养箱（美国 公司），型多功能酶标仪（美国 公司），化学显影仪（美国 公司）。方法 成骨细胞培养方法用含有 的 培养基培养 成骨细胞，待细胞铺满培养瓶底面 后，用胰蛋白酶进行消化，按照 的比例进行传代。传代后的细胞继续贴壁培养和消化传代，收集第 代细胞，接种于培养板中进行分组及干预处理。分组及干预方法将收集的第 代 成骨细胞，分别接种于 孔和 孔培养板，各接种 孔，各分为黄芪多糖低、中、高浓度组及黄芪多糖联合抑制剂干预组、对照组，每组各 孔。黄芪多糖低、中、高浓度组分别用含有 、黄芪多糖的 培养基进行培养，黄芪多糖联合抑制剂干预组用含有 黄芪多糖和 的 培养基进行培养，对照组用 培养基进行培养。成骨细胞增殖活力检测方法培养 后，于 孔培养板内，分别加入 试剂，置于培养箱中继续培养 。取出培养板后，充分震荡，在酶标仪上测定各样品于 波长处的吸光值。成骨细胞增殖相关基因蛋白表达检测方法培养 后，弃去 孔培养板内的培养基，加入 裂解液裂解细胞，离心后提取总蛋白。采用 试剂盒测定总蛋白浓度，每个样品取 总蛋白进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜，用 脱脂牛奶在室温封闭 ，加入 、一抗，于 孵育过夜；洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记免疫球蛋白二抗，于室温孵育 ；加入增强型化学发光显影液。于化学显影仪中显影、拍照，用 软件分析蛋白条带灰度值，以 肌动蛋白为参考，计算各蛋白的相对表达量。数据统计方法采用 统计软件对所得数据进行统计学分析。细胞增殖活力及 、蛋白表达量的组间比较均采用单因素方差分析，组间两两比较均采用 检验；检验水准 。结果 成骨细胞增殖活力检测结果黄芪多糖低、中、高浓度组及黄芪多糖联合抑制剂干预组、对照组细胞增殖活力比较，组间差异有统计学意义（，）。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞增殖活力及黄芪多糖联合抑制剂干预组均大于对照组（，；，；，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞增殖活力与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较，差异无统计学意义（，），黄芪多糖中、高浓度组细胞增殖活力均大于黄芪多糖联合抑制剂干预组（，；，）；黄芪多糖低、中浓度组细胞增殖活力均小于黄芪多糖高浓度组（，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞增殖活力中医正骨 年 月第 卷第 期 ，（总 ）小于黄芪多糖中浓度组（，）。成骨细胞成骨标志基因蛋白表达检测结果组细胞 、的蛋白表达量比较，组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于对照组（：，；，；，；：，；，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；，；：，；，；，），黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞 、的蛋白表达量与对照组比较，差异均无统计学意义（，；，）；黄芪多糖低、中浓度组细胞 、的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组（：，；，；：，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量与黄芪多糖中浓度组比较，差异无统计学意义（，），黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量低于黄芪多糖中浓度组（，）。见图 、表 。成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达检测结果 组细胞中 、的蛋白表达量比较，组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低浓度组、黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞 的蛋白表达量与对照组比较，差异均无统计学意义（，；，），黄芪多糖中、高浓度组细胞 的蛋白表达量均高于对照组（，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较，差异无统计学意义（，）；黄芪多糖低、中浓度组细胞 的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组（，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量低于黄芪多糖中浓度组（，）。注：为碱性磷酸酶，为骨钙素，为 肌动蛋白，为对照组，为黄芪多糖低浓度组，为黄芪多糖中浓度组，为黄芪多糖高浓度组，为黄芪多糖联合抑制剂干预组。图 组 成骨细胞成骨标志基因蛋白表达蛋白印迹法检测结果黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量与对照组比较，差异无统计学意义（，），的蛋白表达量低于对照组（，）；黄芪多糖中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均低于对照组（：，；，；：，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；：，；，），黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞 、的蛋白表达量与对照组比较，差异均无统计 学 意 义（，；，表 组 成骨细胞成骨标志基因蛋白相对表达量组别样本量 孔碱性磷酸酶（）骨钙素（）黄芪多糖低浓度组 黄芪多糖中浓度组 黄芪多糖高浓度组 黄芪多糖联合抑制剂干预组 对照组 值 值 （总 ）中医正骨 年 月第 卷第 期 ，）；黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量均低于黄芪多糖联合抑制剂干预组（，；），的蛋白表达量与黄芪多糖联合抑制剂干预组比较，差异无统计学意义（，）；黄芪多糖低、中浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于黄芪多糖高浓度组（：，；，；：，；，）；黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量高于黄芪多糖中浓度组（，），黄芪多糖低浓度组细胞 的蛋白表达量与黄芪多糖中浓度组比较，差异无统计学意义（，）。见图 、表 。注：为 淋巴细胞瘤 ，为 淋巴细胞瘤 相关 蛋白，为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，为 肌动蛋白，为对照组，为黄芪多糖低浓度组，为黄芪多糖中浓度组，为黄芪多糖高浓度组，为黄芪多糖联合抑制剂干预组。图 组 成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白表达蛋白印迹法检测结果 成骨细胞 信号通路相关基因蛋白表达检测结果组细胞中 、的蛋白表达量比较，组间差异均有统计学意义。黄芪多糖低、中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于对照组（：，；，；，；：，；，；，）和黄芪多糖联合抑制剂干预组（：，；，；，；：，；，；，），黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞 、的蛋白表达量与对照组比较，差异均无统计学意义（，；，）；黄芪多糖中、高浓度组细胞 、的蛋白表达量均高于黄芪低糖高浓度组（：，；，；：，；，）；黄芪多糖中浓度组细胞 的蛋白表达量与黄芪多糖高浓度组比较，差异无统计学意义（，），黄芪多糖中浓度组细胞 的蛋白表达量低于黄芪多糖高浓度组（，）。见图 、表 。注：为磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶，为内皮型一氧化氮合酶，为 肌动蛋白，为对照组，为黄芪多糖低浓度组，为黄芪多糖中浓度组，为黄芪多糖高浓度组，为黄芪多糖联合抑制剂干预组。图 组 成骨细胞磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶 内皮型一氧化氮合酶信号通路相关基因蛋白表达蛋白印迹法检测结果表 组 成骨细胞线粒体凋亡途径相关基因蛋白相对表达量组别样本量 孔淋巴细胞瘤（）淋巴细胞瘤 相关 蛋白（）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（）黄芪多糖低浓度组 黄芪多糖中浓度组 黄芪多糖高浓度组 黄芪多糖联合抑制剂干预组 对照组 值 值 中医正骨 年 月第 卷第 期 ，（总 ）表 组 成骨细胞磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶 内皮型一氧化氮合酶信号通路相关基因蛋白相对表达量组别样本量 孔磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶内皮型一氧化氮合酶黄芪多糖低浓度组 黄芪多糖中浓度组 黄芪多糖高浓度组 黄芪多糖联合抑制剂干预组 对照组 值 值 讨论成骨细胞的分化和增殖受到抑制是骨质疏松发生和发展过程中的重要病理环节。成骨细胞参与骨形成过程，其正常的分化与增殖能够保证机体的骨量及骨质量；而成骨细胞的分化和增殖受到抑制，则会导致机体骨量丢失、骨微结构改变，进而逐步发展为骨质疏松症。黄芪是补肾壮骨汤、益肾补骨汤等用于治疗骨质疏松症中药方剂中的君药。黄芪多糖是中药黄芪中的有效成分，具有促进细胞增殖、抑制炎症反应、减少自由基生成等多种生物学作用 。有研究 ，发现，黄芪多糖能够促进间充质干细胞的成骨分化。但对于黄芪多糖对成骨细胞增殖的影响尚未明确。我们采用不同浓度的黄芪多糖干预 成骨细胞，并检测 成骨细胞的增殖活力，结果显示，浓度为 的黄芪多糖能够显著增强 成骨细胞的增殖活力，且 成骨细胞中成骨标志基因 及 的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著增加。成骨细胞增殖受到抑制与线粒体凋亡途径的过度激活关系密切。线粒体释放细胞色素 进入细胞浆，细胞色素 能够通过一系列的级联反应激活 ，进而诱发细胞凋亡 。和 是调控线粒体途径凋亡的重要蛋白，能通过促进线粒体释放细胞色素 ，进而诱发细胞凋亡；而 则能够拮抗 ，抑制细胞色素 的释放及线粒体凋亡途径的激活 。相关研究发现，骨质疏松组织中 的蛋白表达量减少，而 、的蛋白表达量升高 。我们研究发现，成骨细胞 的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著增加，而 和 的蛋白表达量随黄芪多糖浓度升高而显著降低。因此，黄芪多糖可能通过抑制成骨细胞中线粒体凋亡途径的激活，进而减少成骨细胞凋亡。信号通路参与调控细胞的增殖和凋亡 。多项研究 发现，黄芪多糖能够通过激活 信号通路减轻细胞损伤。我们分析了不同浓度黄芪多糖干预后 成骨细胞 信号通路相关基因的蛋白表达，结果显示随黄芪多糖浓度增加，成骨细胞 和 的蛋白表达量显著增加，提示黄芪多糖能够促进成骨细胞中 信号通路的激活。为了进一步验证 信号通路与黄芪多糖促进细胞增殖的关系，我们采用 抑制剂 联合 的黄芪多糖干预 成骨细胞，结果显示，黄芪多糖联合抑制剂干预组细胞中 、的蛋白表达量低于黄芪多糖高浓度组，而细胞增殖活力小于黄芪多糖高浓度组，、的蛋白表达量均低于黄芪多糖高浓度组，、的蛋白表达量均高于黄芪多糖高浓度组。因此，我们认为黄芪多糖对成骨细胞增殖的调控作用依赖于 信号通路的激活。本研究结果表明，黄芪多糖能够促进 成骨细胞增殖，且该作用具有一定的浓度依赖性，其作用机制可能与调控线粒体凋亡途径及 信号通路有关。参考文献 ，（）：，（）：邓宇，刘奎，陈廖斌 补肾壮骨汤联合经皮椎体后凸成形术治疗老年骨质疏松性胸腰椎压缩性骨折 中医学报，（）：李关鑫，郑金尧，冯伟利 益肾补骨汤联合椎体成形术治疗老年骨质疏松性胸腰椎压缩骨折 例 中医研究，（）：（总 ）中医正骨 年 月第 卷第 期 ，：邓艳玲，翁文玉，招泽豪，等 黄芪三仙汤抗绝经后骨质疏松作用机制的研究 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