黄曲条跳甲气味结合蛋白基因PstrOBP1克隆测序及其原核表达.pdf

7期2015黄曲条跳甲气味结合蛋白基因PstrOBP1克隆测序及其原核表达张国辉1，杨岭1，夏根1，田晓丽2，毛永娜3（1长江大学农学院/长江大学昆虫研究所，湖北荆州434025；2长江大学生命科学学院，湖北荆州434025；3湖北省林业科学研究院荆州分院，湖北荆州434020）摘要：【目的】对黄曲条跳甲气味结合蛋白基因PstrOBP1进行克隆测序及其原核表达，以期为深入探究PstrOBP1基因的分子特征、功能机制及异源表达条件提供理论依据。【方法】基于黄曲条跳甲头部转录组数据，通过RT-PCR克隆编码黄曲条跳甲气味结合蛋白的基因PstrOBP1，对其进行生物信息学分析，并采用半定量PCR检测组织表达模式，以原核表达系统和镍柱表达纯化PstrOBP1融合蛋白，采用Western blotting对其进行验证，并对PstrOBP1进行同源比对及构建系统发育进化树。【结果】PstrOBP1基因开放阅读框（ORF）长459 bp，编码152个氨基酸残基，N端含有19个氨基酸残基组成的信号肽序列，其中有6个保守半胱氨酸残基，属于Classic OBPs亚家族。PstrOBP1与榆绿毛萤叶甲PaenOBP13和榆黄毛萤叶甲PmacOBP13的氨基酸序列的相似性较高，分别为52.3%和51.5%，表明其与二者亲缘关系较近，推测具有相似功能。组织表达分析结果显示，PstrOBP1基因特异性表达于黄曲条跳甲成虫的头部，暗示该基因参与了黄曲条跳甲成虫的化学感受过程。经多次优化原核表达条件，表达出大量可溶性PstrOBP1蛋白。Westernblotting检测结果显示，PstrOBP1基因在大肠杆菌中成功表达约32 kD的重组蛋白。【结论】成功克隆PstrOBP1基因，其编码蛋白很可能是一个参与黄曲条跳甲化学通讯过程的重要嗅觉蛋白。通过反复优化原核表达条件，表达出大量可溶性蛋白，为该蛋白后续功能研究所需的蛋白样品准备提供参考。关键词：黄曲条跳甲；气味结合蛋白；序列分析；组织表达模式；原核表达中图分类号：S433.5文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）07-2015-08收稿日期：2022-12-03基金项目：国家自然科学基金面上项目（31972274）；湖北省高等学校优秀中青年科技创新团队项目（T2022009）第一作者：张国辉（1983-），https:/orcid.org/0000-0001-6990-5068，博士，副教授，主要从事昆虫化学生态学相关研究工作，E-mail：Cloning，sequencing and prokaryotic expression of anodorant-binding protein gene PstrOBP1 fromPhyllotreta striolata（Fabricius）ZHANG Guo-hui1，YANG Ling1，XIAGen1，TIAN Xiao-li2，MAO Yong-na3（1College ofAgriculture，Yangtze University/Institute of Entomology，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；2College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；3Jingzhou Branch of HubeiAcademy of Forestry，Jingzhou，Hubei 434020，China）Abstract：【Objective】The purpose of the study was to clone and sequence the odorant-binding protein genePstrOBP1 from Phyllotreta striolata（Fabricius）and conduct prokaryotic expression，in order to provide an importantbasis for in-depth investigation of the molecular characterization，functional mechanism，and heterologous expressionconditions of PstrOBP1 gene.【Method】Based on the head transcriptome data of P.striolata，RT-PCR was used to clonePstrOBP1 gene which encoded the odorant-binding protein of P.striolata.Bioinformatics analysis was performed andsemi-quantitative PCR was used to detect the tissue expression pattern.PstrOBP1 fusion protein was purified by using aprokaryotic expression system and Ni-NTA Hisbind resin column.Western blotting was used to validate it，and homologycomparison and construction of phylogenetic evolutionary tree were performed for PstrOBP1.【Result】The full-lengthopen reading frame（ORF）of PstrOBP1 was 459 bp encoding 152 amino acid residues.It contained a signal peptidesequence of 19 amino acid residues at the N-terminal end，including 6 conserved cysteine residues，and belonged to Clas-南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（7）：2015-2022ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.07.01354卷南 方 农 业 学 报 20160引言【研究意义】黄曲条跳甲 Phyllotreta striolata（Fabricius）属鞘翅目（Coleoptera）叶甲科（Chryso-melidae），是严重危害十字花科蔬菜的世界性害虫。我国黄曲条跳甲的发生危害逐年加重，尤其在广东、福建等地已从次要害虫上升为主要害虫（贺华良等，2012；何玲等，2019）。目前防治黄曲条跳甲主要依赖化学防治，但其对辛硫磷、乙酰甲胺磷、氯氰菊酯等药剂已产生抗药性（周先治和吴刚，2004），降低了化学防治效果，因此黄曲条跳甲的综合防治体系亟需寻找新型、高效的防治技术。目前，利用气味信息素防治害虫是一项高效、环保的技术，在国内外均有应用的实例（汪波等，2015；Sabbahi and Azzaoui，2020；相会明等，2022）。因此，研究黄曲条跳甲气味结合蛋白（Odorant-binding proteins，OBPs），不仅有利于揭示黄曲条跳甲的嗅觉识别机制，而且为研发黄曲条跳甲嗅觉的行为调控技术提供理论依据。【前人研究进展】OBPs是一类小分子量、水溶性分泌蛋白。OBP氨基酸序列在昆虫种内和种间分化明显，序列相似度较低，但通常在OBP氨基酸序列中含有相对保守的半胱氨酸残基。根据序列中半胱氨酸残基的个数，通常将OBPs分为Classic OBPs、Minus-COBPs、Plus-C OBPs和Atypical OBPs。Classic OBPs氨基酸序列含有6个保守的半胱氨酸残基，而Minus-COBPs只含有45个半胱氨酸残基。Plus-C OBPs除含有通常的6个半胱氨酸残基外，至少还含有23个额外的半胱氨酸残基，且在第6个半胱氨酸残基之后有一个保守的脯氨酸残基。Atypical OBPs含有910个半胱氨酸残基和1个长的C端（Pelosi and Maida1995；Hekmat-Scafe et al.，2002；Zhou et al.，2004）。自1981年第1个昆虫气味结合蛋白在多音天蚕蛾（Antheraea polyphemus）雄虫触角中被发现后（Vogtand Riddiford，1981），越来越多的OBPs被报道，比如Li等（2013）通过转录组分析技术从脉翅目草蛉（Chrysopa pallens）中鉴定出14种OBP基因；Miss-bach等（2015）从衣鱼目和石蛃目昆虫中分别鉴定出32和40种OBP基因；Niu等（2016）从蜚蠊目德国小蠊（Blattella germanica）中鉴定出48种OBP基因；Chen等（2019）从双翅目柑橘大实蝇（Bactrocera minax）中鉴定出7种OBP基因；Li等（2020）在鳞翅目菜青虫（Pieris rapae）中鉴定出14种OBP基因。截至目前从不同昆虫中鉴定的OBP基因种类已超过2000种。OBPs在昆虫嗅觉系统中主要功能之一是特异性识别并结合脂溶性的气味分子，提高气味分子在水性触角淋巴液中的溶解度，并将其运输到嗅觉神经元树突膜上的受体（Odorant receptors，ORs），进而使化学信号转变为电信号传入大脑中枢，指导昆虫相应嗅觉行为（Leal，2013）。由此可见，OBPs与气味信息素的识别处于整个嗅觉信号转导通路的最前端。因而，探究OBPs与气味信息素的结合机制对于阐释昆虫整个嗅觉系统极为重要。目前，前人研究已证明气味结合蛋白在昆虫识别重要气味信息素的过程中发挥重要作用，Pelletier等（2010）研究表明，致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）气味结合蛋白CquiOBP1是介导该虫感受其产卵信息素5R,6S-6-acetoxy-5-hexadecanolide（MOP）的关键嗅觉蛋白分子。Zhang等（2017）研究表明，ApisOBP3和ApisOBP7在豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）嗅觉感受其报警信息素（E）-金合欢烯（EBF）的过程中必不可少。Liu等（2020b）研究表明，桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）的气味结合蛋白BdorOBP2是桔小实蝇识别其种特异性的引诱剂甲基丁子香酚（Methyl eugenol）的关键蛋白。这些研究不仅有助于人们深入了解昆虫感受sic OBPs subfamily.The amino acid sequence of PstrOBP1 had high homology with Pyrrhalta aenescens PaenOBP13（52.3%）and Pyrrhalta maculicollis PmacOBP13（51.5%），suggesting PstrOBP1 had a closer relationship with PaenOBP13and PmacOBP13，and might share similar functions.Tissue expression analysis showed that PstrOBP1 gene was specifi-cally expressed in the head of adult P.striolata，implying that the gene was involved in the process of chemical communi-cation of adult P.striolata.After several optimizations of prokaryotic expression conditions，a large amount of solublePstrOBP1 protein was expressed.The result of Western blotting confirmed the PstrOBP1 gene was successfully ex-pressed about 32 kD of recombinant protein in Escherichia coli.【Conclusion】The PstrOBP1 gene is successfullycloned.Its encoded protein may be a significant olfactory protein involves in the process of chemical communication ofP.striolata.After several optimizations of prokaryotic expression conditions，a large amount of soluble protein has beenexpressed，which provides a reference for the preparation of protein samples required for subsequent functional studies ofthis protein.Key words：Phyllotreta striolata（Fabricius）；odorant-binding protein；sequence analysis；tissue expression pat-tern；prokaryotic expressionFoundation items：General Program of National Natural Science Foundation of China（31972274）；The Outstan-ding Youth Science and Technology Innovation Team Project of Colleges and Universities in Hubei（T2022009）7期2017其关键气味信息素的嗅觉机制，对于人们利用OBPs靶标分子设计昆虫嗅觉行为调控技术也具有重要的潜在应用价值，如通过反向化学生态学方法利用OBP分子筛选更高效的引诱剂，或者通过RNAi技术沉默靶标OBP基因干扰害虫的嗅觉行为。【本研究切入点】黄曲条跳甲是典型的寡食性害虫。十字花科植物特异性次生物质芥子油苷的水解产物为异硫氰酸酯，其在指导取食十字花科的寡食性害虫的寄主定位过程中发挥重要作用（Liu et al.，2020a）。目前有关黄曲条跳甲嗅觉信号转导通路上的关键嗅觉蛋白如OBPs和ORs的研究鲜有报道，对黄曲条跳甲如何识别异硫氰酸酯的嗅觉机制尚不清楚。【拟解决的关键问题】基于黄曲条跳甲头部转录组数据，通过RT-PCR克隆编码黄曲条跳甲OBP1基因PstrOBP1，并对其进行生物信息学和组织表达模式分析，以原核表达系统和镍柱表达纯化PstrOBP1融合蛋白，以期为深入探究PstrOBP1基因的分子特征、功能机制及异源表达条件提供理论依据。1材料与方法1.1试验材料黄曲条跳甲采自湖北省枝江市郊区（东经11182，北纬3043）白菜种植地，采回后用油菜叶饲养。主要试剂：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、Premix Taq试剂、限制性内切酶BamH和Hind 及DNA Ligation Kit购自宝生物工程（大连）有限公司；pGEM-T easy vector购自美国Promega公司；Trans2KDNA Marker和Trans1-T1 Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell、BL21（DE3）Chemically CompetentCell购自北京全式金生物技术股份有限公司；Ni-NTA His Bind Resin纯化树脂和超灵敏化学发光检测试剂盒购自上海七海复泰生物科技有限公司；10Tris-Glycine Transfer Buffer（pH 8.3）、10TBST（pH 8.0）、BSA Blocking Buffer和Western AntibodyDilution Buffer购自江苏康为世纪生物科技股份有限公司。1.2总RNA提取及cDNA合成根据MiniBEST Universal RNA Extraction Kit说明书提取黄曲条跳甲雌、雄成虫各20头不同组织（头部、胸部和腹部）的总RNA。利用核酸蛋白浓度测定仪测定RNA浓度及质量，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照PrimeScriptTMRT reagentKit with gDNA Eraser说明书反转录合成cDNA，稀释5倍，置于-20 冰箱保存备用。1.3PstrOBP1基因克隆鉴定从黄曲条跳甲头部转录组中获得具有完整开放阅读框（ORF）的PstrOBP1基因序列，据此利用Primer 5.0设计特异性引物PstrOBP1F和PstrOBP1R（表1），以黄曲条跳甲头部组织的cDNA为模板，PCR克隆PstrOBP1基因。反应体系20.0 L：Premix Taq试剂10.0 L，cDNA模板1.0 L，10.0 mol/L上、下游引物各1.0 L，ddH2O补足至20.0 L。扩增程序：95 预变性3 min；95 30 s，51 30 s，72 30 s，进行35个循环；72 延伸5 min，12 保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段，将其连接至pGEM-T Easy vector。重组克隆载体转化到克隆菌株T1中涂板培养，挑取单菌落振荡培养（37，200 r/min，12 h），并进行菌液PCR验证，将验证正确的菌液委托武汉华大基因科技有限公司测序验证。1.4PstrOBP1基因生物信息学分析通过DNAMAN 7.0推导PstrOBP1基因的氨基酸序列；使用ExPASy分析蛋白质的理化性质；通过SignalP 6.0进行信号肽的预测；利用Deep TMHMM进行跨膜结构的预测；使用NCBI Conserved Domain进行保守结构域和功能域的预测；使用BLAST在数据 库 中 搜 索 同 源 序 列；通 过 DNAMAN 7.0 对PstrOBP1蛋白和搜索到的其他鞘翅目昆虫的气味结合蛋白序列进行多序列比对；采用MEGA 7.0的邻接法构建系统发育进化树，采用Bootstrap法进行1000次循环检验。1.5PstrOBP1基因组织表达模式分析利用PstrOBP1基因特异性引物PstrOBP1F和PstrOBP1R（表1），以黄曲条跳甲雌、雄成虫不同组织（头部、胸部和腹部）的cDNA为模板，利用半定量PCR分析PstrOBP1基因的组织表达模式。反应体系20.0 L：Premix Taq试剂10.0 L，cDNA模板1.0 L，10 mol/L上、下游引物各1.0 L，ddH2O补足至20.0 L。扩增程序：95 预变性3 min；95 30 s，51 30 s，72 30 s，进行35个循环；72 延伸5 min，12 保存。以PstrActin基因作为内参基因，其引物见表1。1.6PstrOBP1基因表达载体构建将1.3测序正确的菌液扩大培养，提取重组质粒pGEM-T-PstrOBP1，用BamH和Hind 进行双酶切，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，回收目的片段。根据DNA Ligation Kit说明书，将目的片段与经BamH 和Hind 双酶切的表达质粒pET-32a（+）进行连接，构建表达载体，再转化克隆菌株T1感受态细胞中涂板培养，挑取单菌落振荡培养并进行菌液PCR验证，将验证正确的菌液委托张国辉等：黄曲条跳甲气味结合蛋白基因PstrOBP1克隆测序及其原核表达54卷南 方 农 业 学 报 2018武汉华大基因科技有限公司测序验证。将测序正确的初始菌液扩大培养，提取重组质粒pET-32a（+）-PstrOBP1，于-20 冰箱保存，用于后续原核表达。1.7PstrOBP1基因原核表达及纯化将上述重组质粒pET-32a（+）-PstrOBP1转化表达菌株BL21（DE3）感受态细胞中，37 过夜培养，挑取单菌落振荡培养并进行菌液PCR验证。取验证正确的菌液20.0 L于10.0 mL LB培养基（含50.0g/mL氨苄西林）37 200 r/min过夜培养，次日以1 100（v/v）转接到LB培养基中培养，当OD600为0.7左右时，添加异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.5 mmol/L，37 200 r/min诱导培养6 h。使用BeckmanX-30离心机，4 8000 r/min离心16 min，弃上清收集菌体，菌体中加入裂解液（50.0 mmol/LTris-HCl，pH 8.0，50.0 mmol/L NaCl，0.5%TritonX-100，2.0 mg/mL溶菌酶）重新悬浮，常温静置18 min（期间每3 min摇晃一次）后，进行超声波破碎。冰浴条件下，超声时间4 s，间歇时间5 s，功率300 W，工作时长30 min。超声波破碎完成后，使用Beck-manX-30离心机，4 12000 r/min离心16 min，分别收集上清液和沉淀，并进行SDS-PAGE电泳检测。含有重组蛋白的溶液使用Ni-NAT His Bind Resin纯化树脂进行纯化。纯化产物经SDS-PAGE电泳检测后，装入透析袋内放进盛有透析液（20 mmol/LTris-HCl，pH 7.4）的1 L烧杯中4 过夜透析。1.8融合蛋白的Western blotting检测上清液纯化后得到的重组蛋白经SDS-PAGE电泳检测后，在300 mA恒流2 h条件下转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上，用15.0 mL 1TBST漂洗PVDF 膜3次，每次8 min，加入BSA Blocking Buffer覆盖PVDF膜，室温摇晃封闭；3 h后，弃封闭液，15.0mL 1TBST漂洗膜4次，每次8 min，加入用WesternAntibody Dilution Buffer按1 12000（v/v）稀释好的鼠抗多聚组氨酸（6His）一抗覆盖PVDF膜，4 孵育；过夜后回收一抗，用15.0 mL 1TBST漂洗膜5次，每次8 min，加入用Western Antibody DilutionBuffer按1 20000（v/v）稀释好的被辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗覆盖PVDF膜，室温摇晃孵育；1 h后回收二抗，用15 mL 1TBST漂洗膜5次，每次8 min，然后均匀滴加ECL工作液到PVDF膜表面，室温孵育；1 min后用全自动化学发光成像分析仪拍照并记录结果。2结果与分析2.1PstrOBP1基因克隆与序列分析结果根据转录组数据以及PstrOBP1基因的PCR克隆验证表明，PstrOBP1基因ORF序列全长459 bp，编码152个氨基酸，其氨基酸序列中含有6个保守的半胱氨酸残基，属于Classical OBPs亚家族（图1）。Ex-PASy对PstrOBP1进行理化性质的预测结果显示，成熟PstrOBP1蛋白质分子量为14.5 kD，是小分子量蛋白；理论等电点（pI）为9.28，为碱性蛋白；不稳定指数为33.17（40.00），较稳定；亲水性总平均值（GRAVY）为-0.372（0），是亲水性蛋白；脂溶系数为82.11（90.00），是水溶性蛋白；带负电荷氨基酸残基（Asp+Glu）总数16个，带正电荷氨基酸残基（Arg+Lys）总数24个。PstrOBP1的信号肽预测结果显示，该蛋白的第1至19位氨基酸为信号肽序列，剪切位点在第19至20位氨基酸之间，表明PstrOBP1为分泌蛋白（图1）。使用Deep TMHMM对PstrOBP1进行跨膜结构预测，结果显示期望跨膜螺旋数为0，表明该蛋白不是跨膜蛋白。PstrOBP1保守结构域及功能域的预测结果显示，PstrOBP1具有PBP-GOBP超家族的保守结构域，位于第29138位氨基酸，E-value为8.72e-10；并且还存在一个PhBP功能结构域，位于第35138位氨基酸，E-value为1.96e-4。2.2PstrOBP1的系统发育进化分析结果利用NBCI数据库中的BLASTP对PstrOBP1的同源蛋白进行搜索，将搜索结果导入DNAMAN 7.0进行氨基酸序列多重比对，结果（图2和表2）表明PstrOBP1与榆绿毛萤叶甲PaenOBP13的氨基酸序列相似性最高，为52.3%；其次是与榆黄毛萤叶甲Pma-cOBP13的相似性，为51.5%；与甘薯小象甲Cfor-OBP28的相似性最低为33.1%。将多重比对结果导入MEGA 7.0构建系统发育进化树（图3），结果显示黄曲条跳甲PstrOBP1与榆绿毛萤叶甲PaenOBP13和榆黄毛萤叶甲PmacOBP13在同一个分支上，表明其与二者的亲缘关系较近。2.3PstrOBP1基因的组织表达模式分析结果通过半定量PCR分析PstrOBP1其在黄曲条跳甲雌、雄成虫不同组织中的表达情况发现，该基因仅引物名称PrimerPstrOBP1FPstrOBP1RPstrAFPstrAR引物序列Primer sequence5-CGCGGATCCTCTTCGATAATAGAC-35-CCCAAGCTTTTATTCCTTTTTAACACTAA-35-TGTCCCACACTGTACCCATC-35-CGTGGCCATTTCCTGTTCAA-3表 1引物序列信息Table 1Primers and their sequences information下划线表示酶切位点The underlined indicated restriction sites7期2019在黄曲条跳甲头部表达，且雄虫与雌虫之间的相对表达量无明显差别（图4）。2.4PstrOBP1基因的原核表达和纯化将测序正确的重组载体pET-32a（+）-PstrOBP1转化表达菌株BL21（DE3），经IPTG诱导后获得一条约32 kD的蛋白（图5，泳道4）。IPTG诱导的含有空载体pET-32a（+）的BL21（DE3）菌株在相应位置无条带产生（图5，泳道2），说明目的蛋白成功表达。为检测目的蛋白在上清还是包涵体中，诱导后的含重组载体pET-32a（+）-PstrOBP1的菌液经超声破碎、离心后，SDS-PAGE电泳检测结果显示，重组蛋白大量存在于上清液中（图5，泳道5），说明本研究用于蛋白表达的条件良好，表达出大量可溶性PstrOBP1蛋白，这对于后续该蛋白功能的研究非常有利。同时，上清液通过Ni-NAT His Bind Resin纯化树脂纯化后，得到纯度较高的PstrOBP1重组蛋白（图5，泳道7）。为证实此蛋白是带His表达标签的融合蛋白，以鼠抗6His为一抗，以辣根过氧化酶标记的羊抗鼠图 1PstrOBP1基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列Fig.1Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of PstrOBP1 gene起始密码子用方框标注；终止密码子用方框和星号标注；下划线部分为预测的信号肽序列；保守的半胱氨酸残基用圆形标注The start codon was marked with rectangle，the stop codon was marked with rectangle and asterisk，the signal peptide was underlined，conservedcysteine residues were circled图 2黄曲条跳甲PstrOBP1与其他鞘翅目昆虫气味结合蛋白的序列比对结果Fig.2Sequence alignments of PstrOBP1 of P.striolata and other OBPs from Coleoptera species图中红色星号标识的为保守的半胱氨酸位点；黑色、粉色和蓝色背景分别表示相似性为100%、75%和50%。各气味结合蛋白的来源及GenBank登录号：PaenOBP13：榆绿毛萤叶甲（APC94286.1）；PmacOBP13：榆黄毛萤叶甲（APC94204.1）；AchiOBP：星天牛（AUF72951.1）；LdecGOBP：马铃薯甲虫（XP_023013010.1）；CbowOBP9：大猿叶虫（ALR72497.1）；SbifOBP：双条杉天牛（UTN00838.1）；MsalOBP48：云杉花墨天牛（QUP79541.1）；CforOBP28：甘薯小象甲（UNA06112.1）；AcorOBP6：铜绿丽金龟（AKC58527.1）Conserved cysteine residues were labeled in red stars；the black，pink，and blue backgrounds indicated 100%，75%，and 50%similarities，respectively.Origin of OBPs and their GenBank accession numbers：PaenOBP13：Pyrrhaltaa enescens（APC94286.1）；PmacOBP13：P.maculicollis（APC94204.1）；AchiOBP：Anoplophora chinensis（AUF72951.1）；LdecGOBP：Leptinotarsa decemlineata（XP_023013010.1）；CbowOBP9：Colaphe-llus bowringi（ALR72497.1）；SbifOBP：Semanotus bifasciatus（UTN00838.1）；MsalOBP48：Monochamus saltuarius（QUP79541.1）；CforOBP28：Cylas formicarius（UNA06112.1）；AcorOBP6：Anomala corpulenta（AKC58527.1）张国辉等：黄曲条跳甲气味结合蛋白基因PstrOBP1克隆测序及其原核表达54卷南 方 农 业 学 报 2020图 6PstrOBP1重组蛋白的Western blotting分析Fig.6Western blotting analysis of PstrOBP1 recombinant pro-teinM：蛋白分子量标准；1：融合蛋白M：Protein Marker；1：Fusion protein55 kD40 kD35 kD25 kD15 kDM1为二抗，表达产物的Western blotting检测结果显示，诱导表达的重组蛋白（约32 kD）与6His抗体发生强烈免疫反应，说明目的融合蛋白得到表达（图6）。3讨论本研究通过转录组数据和PCR克隆获得PstrOBP1基因，其ORF长459 bp，编码152个氨基酸残基，多肽链中含有6个保守的半胱氨酸残基，属于ClassicalOBPs亚家族（Hekmat-Scafe et al.，2002）。该基因编码的蛋白符合Classical OBPs亚家族特点：（1）小分子量、亲水蛋白质；（2）多肽链氨基端具有信号肽，属于分泌蛋白；（3）多肽链中含有6个保守的半胱氨酸残基（Pelosi et al.，2006）。同源比对发现，PstrOBP1氨基酸序列与同科昆虫榆绿毛萤叶甲PaenOBP13的蛋白 ProteinPaenOBP13PmacOBP13AchiOBPLdecGOBPCbowOBP9SbifOBPMsalOBP48CforOBP28AcorOBP6PstrOBP152.351.540.044.645.440.036.233.136.9PaenOBP1387.741.542.350.838.539.236.229.2PmacOBP1340.840.048.536.938.536.229.2AchiOBP56.257.756.986.933.826.2LdecGOBP71.550.051.536.227.7CbowOBP953.155.437.729.2SbifOBP52.341.524.6MsalOBP4834.623.8CforOBP2827.7表 2黄曲条跳甲PstrOBP1与其他鞘翅目昆虫气味结合蛋白的相似性矩阵（%）Table 2Similarity matrix of PstrOBP1 of P.striolata with other OBPs from Coleoptera species（%）图 3基于黄曲条跳甲PstrOBP1与其他鞘翅目昆虫OBPs氨基酸序列构建的系统发育进化树Fig.3PhylogenetictreebasedonaminoacidsequencePstrOBP1of P.striolata and other OBPs from Coleoptera species图 4PstrOBP1基因在雌、雄成虫不同组织中的表达情况Fig.4Tissue expression of PstrOBP1 gene in female and maleof P.striolataM：DL2000 DNA Marker；1：雄性头部；2：雄性胸部；3：雄性腹部；4：雌性头部；5：雌性胸部；6：雌性腹部；7：未加cDNA模板的阴性对照M：DL2000 DNA Marker；1：Male head；2：Male throax；3：Male abdo-men；4：Female head；5：Female throax；6：Female abdomen；7：Nega-tive control without using cDNAtemplate500 bp250 bp250 bp100 bpM1234567PstrActinPstrOBP1图 5PstrOBP1基因表达和纯化产物的SDS-PAGE电泳分析结果Fig.5SDS-PAGE electrophoresis analysis of expression andpurified product of PstrOBP1 geneM：蛋白分子量标准；1：诱导前的空载体pET-32a（+）；2：诱导后的空载体pET-32a（+）；3：诱导前的重组载体pET-32a（+）-PstrOBP1；4：诱导后的重组载体pET-32a（+）-PstrOBP1；5：上清液；6：包涵体；7：纯化后含有His-Tag的重组蛋白M：Protein Marker；1：Non-induced empty vector pET-32a（+）；2：In-duced empty vector pET-32a（+）；3：Non-induced recombinant vectorpET-32a（+）-PstrOBP1；4：Induced recombinant vector pET-32a（+）-PstrOBP1；5：Supernatant；6：Inclusion body；7：Purified recombi-nant protein containing His-Tag40 kD35 kD25 kD15 kDM1234567M7期2021相似性最高，为52.3%；其次是与榆黄毛萤叶甲Pmac-OBP13，相似性为51.5%，与系统发育进化树的结果一致。说明PstrOBP