基于Nrf2_HO-1通路探讨金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响及机制.pdf

基于/通路探讨金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响及机制陈 洁杨林燕郝晓娟何 琦侯世杰(邯郸市中心医院河北 邯郸)摘要 目目的的 探讨金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾组织损伤的影响及其可能的分子机制方方法法 取雄性 大鼠 只随机选择 只作为正常组其余大鼠采用一次性腹腔注射链脲佐菌素 /的方法复制糖尿病肾病模型 将 只成模大鼠随机分为模型组、金雀异黄酮组、鸦胆子苦醇组和金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组每组 只 金雀异黄酮组给予 /金雀异黄酮灌胃鸦胆子苦醇组给予鸦胆子苦醇/灌胃金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组给予/金雀异黄酮和鸦胆子苦醇 /灌胃均 次/连续灌胃 周 检测各组大鼠空腹血糖()水平及肾功能指标血清肌酐()、尿素氮()和 尿微量白蛋白()计算肾脏指数 染色、染色、染色观察肾组织形态透射电子显微镜观察肾细胞超微结构分光光度法检测肾组织中总超氧化物歧化酶()、过氧化氢酶()活性和丙二醛()含量 法检测肾组织中肿瘤坏死因子 ()、白细胞介素()、白细胞介素 ()含量 法检测肾组织中 相关因子()、血红素加氧酶()、醌氧化还原酶()、总核因子()、胞核 蛋白表达情况 结结果果 与正常组比较模型组大鼠、水平和肾脏指数均明显升高(均.)肾小球肥大、硬化炎性浸润胶原沉积肾小球细胞可见足突肿胀或消失、基底膜弥漫性增厚、线粒体嵴断裂或消失肾组织中 、活性均明显降低(均.)、含量均明显升高(均.)肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显降低(均.)胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值均明显升高(均.)与模型组比较金雀异黄酮组和金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠、水平和肾脏指数均明显降低(均.)肾组织病理改变和肾小球细胞超微结构病变均明显减轻肾组织中 、活性均明显升高(均.)、含量均明显降低(均.)肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显升高(均.)胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值均明显降低(均.)鸦胆子苦醇组上述指标变化趋势与模型组相同且更加严重鸦胆子苦醇可明显逆转金雀异黄酮对上述指标的调控作用 结结论论 金雀异黄酮能够抑制糖尿病肾病大鼠肾组织氧化应激和炎症反应减轻肾组织病变和肾细胞超微结构病变其机制可能与促进/通路活化、抑制 核转位有关关键词 金雀异黄酮糖尿病肾病肾损伤血红素加氧酶 相关因子氧化应激炎症反应:./.中图分类号 文献标识码 文章编号 ()作者简介 陈洁女硕士主治医师研究方向为肾脏疾病的诊治基金项目 国家“十三五”科技支撑计划项目()河北省医学科学研究课题()/()现代中西医结合杂志 ():././.()()()()()()()()()()()()()().(.)(.)(.)/(.)/(.).(.)(.)(.)/(.)/(.)./.:糖尿病肾病是糖尿病最常见的一种微血管并发症是引发终末期肾病的第二大原因仅次于慢性肾小球肾炎具有较高的致残、致死率 病理学研究发现持续高血糖导致糖脂代谢紊乱引发氧化应激和炎症反应破坏肾微血管内皮细胞结构和功能导致肾小球滤过率降低、肾细胞代偿性增生和组织纤维化 由 相关因子()及其下游血红素加氧酶()、醌氧化还原酶()组成的信号通路在细胞氧化应激和炎症反应过程中发挥着关键调控作用激活/信号通路能够抑制氧化应激和炎症反应而减轻糖尿病肾病肾损伤 金雀异黄酮(又名染料木素)广泛存在于金雀花、大豆、皂荚、槐角等豆科植物中具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤等多种药理学作用 既往实验研究证实金雀异黄酮能够通过调控/信号通路减轻糖尿病大鼠心肌组织损伤可通过现代中西医结合杂志 ()调控/核因子()通路减轻糖尿病肾病大鼠肾细胞线粒体损伤 但金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响以及是否与调控/信号通路有关尚需进一步研究故本实验基于该通路探讨了金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠肾损伤的影响及其可能的分子机制 实验材料与方法 实验动物 只清洁级雄性 品系大鼠周龄体重 购于河北伊维沃生物科技有限公司(冀)在室温 、相对湿度 、/光暗交替的控制环境中分笼饲养 研究中所有动物操作遵循减少、替代、优化原则 本实验通过邯郸市中心医院伦理委员会审批通过()药物与试剂 金雀异黄酮(纯度)购自上 海 源 叶 生 物 科 技 有 限 公 司(批 号:)鸦胆子苦醇(抑制剂)、链脲佐菌素()、马森()染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公 司(货 号 分 别 为)苏木精 伊红()、过碘酸 雪夫()染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司(批号分别为)锇酸、醋酸铀、柠檬酸铅购自美国 公司(货号分别为)肌酐()、尿素氮()、尿微量白蛋白()、肿瘤坏死因子 ()、白细胞介素()、白细胞介素()检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所(货号分别为 )总超氧化物歧化酶()、过氧化氢酶()、丙二醛()检测试剂盒购自北京百奥莱博科技有限公司(货号分别为)兔源、核因子()、组蛋白()抗体购自北京博奥森生物技术有限公司(批号分别为 )裂解液、法蛋白含量检测试剂盒、核蛋白提取试剂盒、羊抗兔 二抗、增强化学发光()试剂盒购自北京索莱宝 生 物 科 技 有 限 公 司(货 号 分 别 为)主要仪器 型动物血糖仪(美国强生公司)型全自动生化分析仪(日本 公司)型高速低温离心机(德国 公司)型酶标仪(芬兰雷勃公司)型烤片机、型石蜡切片机、型超薄切片机(德国 公司)型透射电子显微镜(日本电子株式会社)型垂直电泳系统、型蛋白转膜仪(美国 公司)型化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司)实验方法随机取 只大鼠作为正常组剩余的 只大鼠参照祁珊珊等报道方法采用一次性腹腔注射(/)的方法复制糖尿病肾病大鼠模型 分别于注射 后 和 取尾静脉 血检测空腹血糖()次检测均./则判定糖尿病模型制备成功 周后检测./且 尿微量白蛋白()/即可判定糖尿病肾病模型制备成功 成模 只分别剔除 水平最高和最低各 只大鼠将剩余的 只糖尿病肾病大鼠随机分为模型组、金雀异黄酮组、鸦胆子苦醇组、金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组各只参考文献 给药剂量金雀异黄酮组给予金雀异黄酮 /灌胃鸦胆子苦醇组给予鸦胆子苦醇/灌胃金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组给予金雀异黄酮 /鸦胆子苦醇 /灌胃正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃均 次/连续灌胃 周 检测指标及方法 、及 水平末次灌胃 后由尾静脉采血并通过动物血糖仪检测 水平 采用 /戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉大鼠腹主动脉采血室温静置 后 /()离心 取血清然后按照试剂盒操作说明采用肌氨酸氧化酶法检测 水平、脲酶法检测 水平 末次灌胃完成后收集各组大鼠 尿液按照试剂盒操作说明采用免疫比浊法检测 水平 肾脏指数末次灌胃 后称量各组大鼠体重后摘取双侧肾组织生理盐水冲洗并用滤纸拭干后称重计算肾脏指数 肾脏指数 (双侧肾重/体重)肾组织病理形态取部分左侧肾组织于中性福尔马林溶液中固定 经脱水、石蜡包埋、切片、展片、烤片、脱蜡水化等处理后分别按照试剂盒操作说明行 染色、染色和现代中西医结合杂志 ()染色通过光学显微镜观察肾组织病理形态 肾细胞超微结构 取部分左侧肾组织修饰成 小块后加入戊二醛溶液 固定、锇酸 固定 梯度丙酮脱水处理后 包埋树脂进行包埋 厚度切片进行醋酸铀和柠檬酸铅电子双染色然后通过透射电子显微镜观察肾细胞超微结构 肾组织中 、活性和 含量取部分右侧肾组织冰上剪碎后加入 倍量 生理盐水冰上研磨匀浆 /()离心 取上清液然后按照试剂盒操作说明采用分光光度法检测 、活性和 含量 肾组织中 、含量 取.制备的肾组织匀浆上清液采用 法检测 、含量 肾组织中、总 、胞核 蛋白表达情况采用 法检测:取 右侧肾组织加入 裂解液后冰上研磨匀浆冰上静置 后 下 /()离心 取上清液 下 /()离心 取沉淀即为总蛋白按照胞核蛋白提取试剂盒操作说明制备胞核蛋白 法进行蛋白含量测定配平后以/孔上样十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转至 膜脱脂奶粉溶液封闭 膜 一抗稀释液()、()、()、()、()、()、()避光孵育 洗膜后二抗稀释液()室温孵育.洗膜后 显色通过 图像分析软件检测各蛋白条带灰度值 统计学方法运用 .进行数据统计学处理计量资料均呈正态分布以 表示多组间均数比较采用单因素方差分析方差齐时组间两两比较采用 检验方差不齐时组间两两比较采用 检验 .为差异有统计学意义 结 果 各组大鼠、及 水平比较模型组大鼠、及 水平均明显高于正常组(均 .)鸦胆子苦醇组大鼠、及 水平均明显高于模型组(均 .)金雀异黄酮组和金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠、及 水平均明显低于模型组(均 )但金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠、及 水平均明显高于金雀异黄酮组(均 )见表 表 正常组和糖尿病肾病各组大鼠、水平比较()组别只数/(/)/(/)/(/)/正常组.模型组.金雀异黄酮组.鸦胆子苦醇组.金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组.注:与正常组比较.与模型组比较.与金雀异黄酮组比较.各组大鼠肾脏指数比较正常组和模型组大鼠的肾脏指数分别为(.)、(.)模型组明显高于正常组(.)金雀异黄酮组、鸦胆子苦醇组、金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠的肾脏指数分别为(.)、(.)、(.)鸦胆子苦醇组明显高于模型组(.)金雀异黄酮组和金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组均明显低于模型组(均.)但金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组明显高于金雀异黄酮组(.)各组大鼠肾组织病理形态比较正常组大鼠肾小球、肾小管、肾间质形态正常结构完整细胞分布均匀 模型组大鼠肾组织 染色见肾小球肥大基质增生系膜扩张炎性浸润细胞固缩染色见肾组织出现糖原沉积、肾小球硬化染色见肾小球、肾小管、肾间质有大量胶原沉积 与模型组比较金雀异黄酮组大鼠肾组织病变明显减轻鸦胆子苦醇组肾组织病变明显加重 与金雀异黄酮组比较金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组肾组织病变明显加重 见图 现代中西医结合杂志 ()图 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织病理形态()各组大鼠肾细胞超微结构比较正常组大鼠肾细胞超微形态、细胞器结构等均未见异常模型组大鼠肾小球细胞可见足突肿胀或消失基底膜弥漫性增厚线粒体嵴断裂或消失与模型组比较金雀异黄酮组肾细胞超微结构病变明显减轻鸦胆子苦醇组肾细胞超微结构病变明显加重与金雀异黄酮组比较金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组肾细胞超微结构病变明显加重 见图 图 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾细胞超微结构()各组大鼠肾组织中 、活性和 含量比较 与正常组比较模型组大鼠肾组织中 、活性均明显降低(均 .)含量明显升高(.)与模型组比较鸦胆子苦醇组 活性明显降低(.)含量明显升高(.)金雀异黄酮组 、活性均明显升高(均.)含量明显降低(.)与金雀异黄酮组比较金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组 、活性均明显降低(均 )含量明显升高(.)见表 表 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中 、活性和 含量比较()组别只数 /(/)/(/)/(/)正常组.模型组.金雀异黄酮组.鸦胆子苦醇组.金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组.注:与正常组比较.与模型组比较.与金雀异黄酮组比较.现代中西医结合杂志 ()各组大鼠肾组织中 、含量比较 模型组大鼠肾组织中 、含量均明显高于正常组(均.)鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 、含量均明显高于模型组(均.)金雀异黄酮组和金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 、含量均明显低于模型组(均 )但金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 、含量均明显高于金雀异黄酮组(均 )见表 表 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中 、含量比较(/)组别只数 正常组.模型组.金雀异黄酮组.鸦胆子苦醇组.金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组.注:与正常组比较.与模型组比较.与金雀异黄酮组比较.各组大鼠肾组织中、总 、胞核 蛋白表达情况比较与正常组比较模型组大鼠肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显降低(均.)胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值均明显升高(均.)与模型组比较鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显降低(均.)胞核 蛋白相对表达量及胞核/总 比值均明显升高(均.)金雀异黄酮组大鼠肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显升高(均 .)胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值均明显降低(均.)与金雀异黄酮组比较金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组大鼠肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值均明显降低(均.)胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值均明显升高(均.)见图 及表 图 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中、总 、胞核 蛋白表达情况 讨 论糖尿病肾病主要表现为白蛋白尿及肾小球滤过率持续低下治疗以降糖调脂、控制血压、改善肾功能等为主但仍不能有效阻断糖尿病肾病进行性加重以及发展为终末期肾病的结局 中医根据糖尿病肾病的症状将其归于“消渴”“尿浊”“水肿”“溺毒”等范畴认为气阴两虚、瘀血阻络、水湿浊毒阻滞为该病的主要病机 近年来中药及中药提取物防治糖尿病肾病成为医药研究者关注的热点本实验采用一次性腹腔注射 的方法复制糖尿病肾病模型观察了金雀异黄酮对肾损伤的影响结果显示糖尿病肾病大鼠肾功能明显降低病现代中西医结合杂志 ()表 正常组和糖尿病肾病各组大鼠肾组织中各蛋白相对表达量及 /、胞核 /总 比值比较()组别只数/正常组.模型组.金雀异黄酮组.鸦胆子苦醇组.金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组.组别只数/总 /胞核 /胞核 /总 正常组.模型组.金雀异黄酮组.鸦胆子苦醇组.金雀异黄酮 鸦胆子苦醇组.注:与正常组比较.与模型组比较.与金雀异黄酮组比较.理观察显示肾小球肥大、基质增生、系膜扩张、炎性浸润、糖原沉积、肾小球硬化、胶原沉积肾小球细胞可见足突肿胀或消失、基底膜弥漫性增厚、线粒体嵴断裂或消失与江波等报道一致但尹江宁等研究结果显示糖尿病肾病大鼠呈现肾小球萎缩这可能与造模方法不同及糖尿病肾病严重程度不同有关 金雀异黄酮组大鼠肾功能明显改善肾组织病理性改变和肾小球细胞超微结构病变明显减轻说明金雀异黄酮能够减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤保护肾功能氧化应激和炎症反应是糖尿病肾病发生进展的重要因素 活性氧簇()是引发氧化应激损伤的物质基础而长期高血糖可刺激细胞线粒体大量产生 抗氧化酶 、被过度消耗破坏体内 动态平衡不能及时清除的 将攻击破坏生物膜脂质双分子层结构和、结构蛋白等大分子并生成有害分子 导致细胞损伤及组织病变 并且长期高血糖将导致血管内皮细胞受损白细胞在受损处聚集并大量释放促炎因子其中 可促进炎性细胞浸润 和 可促进白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞等聚集并释放炎症因子从而进一步加重炎症损伤 本实验结果显示金雀异黄酮组大鼠肾组织中 、活性明显高于模型组、含量明显低于模型组提示金雀异黄酮能够通过抑制氧化应激和炎症反应减轻糖尿病肾病大鼠肾损伤 是一种核转录因子其结构中含有 个高度保守的环氧氯丙烷相关蛋白同源结构域()其中 为 与 样环氧氯丙烷相关蛋白()结合位点生理状态下以无活性“/”结合态形式存在于细胞质 可刺激 磷酸化促使“/”解离 核转位后可与抗氧化反应元件结合诱导 、等抗氧化酶转录表达提高机体抗氧化能力 和 为 下游靶蛋白 为血红素降解限速酶能够阻止血红素参与氧化应激反应并且血红素降解产物、胆绿素等均为内源性抗氧化剂 是一种具有抗氧化能力的黄素蛋白酶可催化醌类及其衍生物还原降解从而阻止其产生 参与氧化应激反应 是定位于细胞质的一种核转录因子核转位后可诱导 、等多种炎症因子转录表达从而加重炎症反应而 具有抑制 核转位的作用 本研究发现金雀异黄酮组大鼠肾组织中 、蛋白相对表达量及 /比值明显高于模型组胞核 蛋白相对表达量及胞核 /总 比值明显低于模型组鸦胆子苦醇组大鼠各检测指标变化趋势与模型组相同且更加严重鸦胆子苦醇可明显逆转金雀异黄酮对糖尿病肾病大鼠上述指标的调控作用 证实金雀异黄酮抑制糖尿病肾病大鼠氧化应激和炎症反应的作用可能与促进/通路活化、抑制 核转位有关现代中西医结合杂志 ()综上所述金雀异黄酮能够抑制糖尿病肾病大鼠肾组织氧化应激和炎症反应减轻肾组织病变和肾细胞超微结构病变其机制可能与促进/通路活化、抑制 核转位有关本研究为金雀异黄酮用于糖尿病肾病的防治提供了一定理论依据利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .:.():.():.:.():./.():.:.():.():.贾强王元元刘小粉等.金雀异黄酮对糖尿病大鼠心肌/通路的影响.中南大学学报(医学版)():./.():.祁珊珊何佳孙泽等.糖尿病肾病 大鼠模型的建立和评价.中国临床药理学杂志():.陶春鹤张玉笛轩晨等.芪精益肾汤对糖尿病肾病大鼠/信号通路的作用及机制研究.中国中西医结合杂志():.:.():.江波孙勤国张贤梅等.加味济生肾气汤对 诱导的糖尿病肾病大鼠足细胞及其自噬的影响.世界科学技术 中医药现代化():.尹江宁卢国元.二至丸提取物对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的保护作用研究.南京中医药大学学报():.熊昕瞿华郑宏庭等.线粒体氧化应激在糖尿病微血管并发症发病机制中的研究进展.中华内分泌代谢杂志():.闫燕宝群苗永政等.线粒体抗氧化剂 对糖尿病肾脏疾病大鼠肾组织腺苷酸活化蛋白激酶/沉默信息调节因子/过氧化物酶体增殖激活受体 共激活因子 信号通路及氧化应激影响的研究.中国糖尿病杂志():.():.刘文娜甘玉金张璐等.信号通路在急性肾损伤中作用的研究进展.中华实用诊断与治疗杂志():./.()():.():.():./.():.收稿日期 现代中西医结合杂志 ()