红景天提取物的护肤功效及安全性评价研究.pdf

1180第 53 卷第 10 期2023 年 10 月Vol.53 No.10Oct.2023日 用 化 学 工 业（中英文）China Surfactant Detergent&Cosmetics Study on the skincare efficacy and safety evaluation of Rhodiola rosea extractYanZhou*,RuinaHan（Tangshan Vocational&Technical College,Tangshan,Hebei 063017,China）Abstract:This paper aimed to study the skincare efficacy and safety of Rhodiola rosea extract.The antioxidant effect of Rhodiola rosea extract was verified through DPPH free radical scavenging experiment.The results show that within a certain concentration range,Rhodiola rosea extract can effectively eliminate DPPH free radicals and reactive oxygen species,which plays a protective role on the cells damaged by oxidation,and has a certain antioxidant effect.The effect of Rhodiola rosea extract on maintaining skin elasticity was verified through the inhibition rate of elastase,and Rhodiola rosea extract can effectively inhibit elastase activity.The inhibitory effect of Rhodiola rosea extract on melanogenesis was verified through the inhibition rate of tyrosinase activity and the elimination rate of melanin in mouse melanoma cells.Rhodiola rosea extract can significantly inhibit tyrosinase activity,delay melanogenesis,and has potential whitening effects.The safety of Rhodiola rosea extract was verified through a repeated open application test on human skin.The results show that no adverse skin reactions occurred after 48 hours,indicating that within a certain concentration range,Rhodiola rosea extract has no irritating effect on human skin.Key words:Rhodiola rosea;skin care;antioxidant;safetyReceived:October 25,2022;Revised:September 26,2023.*Corresponding author.Tel.:[phone],E-mail:.DOI：10.3969/j.issn.2097-2806.2023.10.0091181第 10 期开发与应用周 妍，等：红景天提取物的护肤功效及安全性评价研究 红景天，为景天科植物大花红景天（Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba）的干燥根和根茎。具有益气活血，通脉平喘之功。主要用于气虚血瘀，胸痹心痛，中风偏瘫等疾病的治疗1,2。现代药理学表明，红景天提取物中富含红景天苷、没食子酸、酪醇、没食子酸乙酯等众多生物活性物质3,4，具有抗氧化、抗衰老、美白等多种功效，并已应用在多种化妆品和日化用品中5,6。李志强等7研究了不同质量浓度的长鞭红景天（Rhodiola fastigiata（HK.f.et Thoms.）S.H.Fu）提取物对DPPH、OH自由基的清除能力，结果表明当长鞭红景天提取物的固形物含量达到30 mg/L时，其DPPH清除率可高达91.3%。孙熙浛等8探讨60Co-射线辐照处理对高山红景天（Rhodiola cretinii（Hamet）H.Ohba subsp.sino-alpina（Frod.）H.Ohba）乙醇提取物抗氧化及美白作用的影响，实验结果表明辐照红景天乙醇提取物抑制酪氨酸酶的IC50值为244.10 g/mL，并能够有效降低小鼠黑色素瘤细胞中黑色素的合成。周思思等9采用中波紫外照射的人皮肤成纤维细胞和人永生化皮肤角质形成细胞衰老模型探索红景天总皂苷等有效成分体外抗皮肤衰老作用，结果表明红景天的不同粗提物对人皮肤细胞均有一定的抗衰老修复能力。以上研究均表明，红景天及其有效成分在护肤方面具有良好的功效和广阔的前景。本研究通过抗氧化检测、抗衰老功效检测、美白功效检测等实验，验证不同质量浓度红景天提取物的体外护肤功效，为其在化妆品中的应用提供实验依据。1 实验部分1.1 主要试剂与仪器新鲜大花红景天（Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba），产自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县；DPPH、蘑菇酪氨酸酶、左旋多巴（L-Dopa）、刚果红弹性蛋白、猪胰弹性蛋白酶、胎牛血清、嗜热菌蛋白酶、胶原酶A、去离子水，美国Sigma公司；人成纤维细胞、小鼠黑色素瘤细胞，中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。ZN-04B小型粉碎机，广州市旭朗机械设备有限公司；HH-6恒温水浴锅，天津鑫高伟业科技有限公司；DHZ-2001A（B）全温度振荡培养箱，常州金坛精达仪器制造有限公司；TE2000-S倒置显微镜，日本Nikon公司；KLCZ-1680A超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；ENSPIRE 2300全波长酶标仪，美国PE公司；Nano Drope 2000微量紫外分光光度计，美国Thermo公司。1.2 实验方法1.2.1 红景天提取液制备将新鲜大花红景天（Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.）H.Ohba）根茎洗净后置入烘箱60，60 min烘干。干燥后用粉碎过筛（60目孔），将燥干粉末配制为无水乙醇溶液，质量比为120，在水浴锅中提取3次，70，每次30 min。将三次提取液合并，用纱布过滤。通过减压蒸馏法使用旋转蒸发仪去除乙红景天提取物的护肤功效及安全性评价研究周 妍*，韩蕊娜（唐山职业技术学院，河北 唐山 063017）摘要：研究红景天提取物的护肤功效及安全性。通过DPPH自由基清除实验验证红景天提取物的抗氧化作用。结果表明，在一定浓度范围内，红景天提取物可有效消除DPPH自由基和活性氧，对氧化损伤的细胞发挥保护作用，具有一定的抗氧化作用；通过弹性蛋白酶抑制率验证红景天提取物维持皮肤弹性的作用，红景天提取物可有效抑制弹性蛋白酶活性；通过酪氨酸酶活性抑制率和小鼠黑色素瘤细胞黑色素消除率验证红景天提取物对黑色素生成的抑制作用，红景天提取物可显著抑制酪氨酸酶活性、延缓黑色素生成，存在潜在的美白功效；通过人体皮肤重复性开放型涂抹试验验证红景天提取安全性，结果表明48 h后无受试者出现皮肤不良反应，证明在一定浓度范围内，红景天提取物对人体皮肤无刺 激性。关键词：红景天；护肤；抗氧化；安全性中图分类号：TQ658 文献标识码：A 文章编号：2097-2806（2023）10-1180-061182第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）醇，再经过乙酸乙酯萃取，真空干燥得到红棕色粉末，即为干燥的红景天提取物。经测定，提取物中红景天苷含量为24.5 mg/g。1.2.2 红景天提取物清除DPPH自由基能力检测将红景天提取物用含有10%胎牛血清的DMEM培养基稀释为50，100，500，1 000 g/mL一系列质量浓度样品溶液，分别取0.1 mL样品溶液加入1 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液，避光摇匀，静置30 min后待用。以紫外分光光度计法测定517 nm处吸光度，每份样品平行操作3次。通过下式计算红景天提取物的DPPH自由基清除率：DPPH自由基清除率=A溶剂-A样品 /A溶剂100%（1）1.2.3 红景天提取物对氧化损伤细胞保护作用测定将成纤维细胞置于含有生长添加剂、胎牛血清和双抗的DMEM培养基中，置于37、湿度50%、5%CO2恒温培养箱中，每48 h更换培养基，细胞爬满培养皿后用含EDTA的0.05%的胰蛋白酶进行消化、传代。后置入96孔板，加入250 mol/L H2O2培养2 h，制备氧化损伤成纤维细胞模型。收集状态良好细胞，分别加入不同质量浓度的红景天提取物溶液，恒温培养箱孵育24 h，PBS冲洗3遍，加入250 mol/L H2O2继续培养2 h，重复PBS冲洗步骤，MTT法测定细胞活力。空白组不加入H2O2，不做其他干预处理。1.2.4 活性氧（ROS）含量测定收集生长状态良好的成纤维细胞，加入20 mol/L 的活性氧荧光探针（DCFH-DA），培养箱孵育60 min后使用PBS反复冲洗三次充分去除DCFH-DA，加入250 mol/L H2O2作用2 h后立即检测，以488 nm激发波长、525 nm发射波长检测ROS含量。1.2.5 红景天提取物的弹性蛋白酶抑制率检测前胶原C端蛋白酶（BMP-1）是一种较为准确的皮肤生物靶点。在皮肤中BMP-1通过真皮成纤维细胞分泌，在细胞外基质中发挥生物功能。因此可在此基础上通过体外实验检测红景天提取物对弹性蛋白酶的抑制率。采集人皮肤组织，采用嗜热菌蛋白酶消化将真皮组织分离出来，采用胶原酶A消化培养，传代后得到的真皮成纤维细胞在37、5%CO2、饱和湿度的恒温恒湿培养箱中7 d备用。提取真皮成纤维细胞培养液，系列质量浓度的红景天提取物作为样品，使用紫外分光光度计于495 nm处测定OD值，重复3次。在真皮成纤维细胞培养液中添加抑制剂后OD值会降低，对照未添加抑制剂时测得OD值，通过下式计算弹性蛋白酶抑制率：弹性蛋白酶抑制率=（1-加入红景天提取物后溶液OD值/未加红景天提取物时溶液OD值）100%（2）1.2.6 红景天提取物抑制酪氨酸酶活性检测将红景天提取物与左旋多巴溶液混合，加入酪氨酸酶溶液，配制成终浓度为25 U/mL的混合溶液，设定3个重复孔开始反应，室温条件下静置5 min，使用酶标仪于490 nm波长处测定OD值。通过下式计算红景天提取物的酪氨酸酶活性抑制率：酪氨酸酶活性抑制率=（1-加入红景天提取物后溶液OD值/未加红景天提取物时溶液OD值）100%（3）1.2.7 对黑色素合成影响同1.2.5方法培养小鼠黑色素瘤细胞，并用H2O2制备氧化损伤细胞模型。收集生长状态良好的黑色素瘤细胞计数，置于37、湿度50%、5%CO2恒温培养箱中培养。加入不同质量浓度的红景天提取物样品，培养48 h，PBS重复冲洗，加入1 mol/L的NaOH溶液裂解细胞，收集裂解液，置入离心管中80 水浴45 min，吸取上清液，至475 nm处读取吸光度值。1.2.8 人体皮肤重复性开放型涂抹试验将红景天提取物用超纯水稀释至1 000 g/mL待用。按受试者入选标准10，选择30名人员参加试验；以受试者前臂屈侧作为受试部位，面积3 cm3 cm，受试部位保持干燥，避免接触其他外用制剂；将红景天提取物均匀地涂于受试部位，（0.0500.005）mL/次、每天2次，连续7天，同时观察皮肤反应，根据表1中判定标准对皮肤反应进行观察评判，并记录结果。表1 重复性开放型涂抹试验皮肤反应评分标准表Tab.1 Sk in reaction scoring standard of repeated open application test反应程度评分等级皮肤反应临床表现-0阴性反应1微弱红斑、皮肤干燥、皱褶+2红 斑、水肿、丘疹、风团、脱屑、裂隙+3明显红斑、水肿、水疱+4重 度红斑、水肿、大疱、糜烂、色素沉着或色素减退、痤疮样改变2 结果与讨论2.1 红景天提取物清除DPPH自由基能力DPPH在有机溶剂里是一种稳定的自由基，在自由基清除剂的存在时，DPPH的单电子被捕捉从而使其在紫外光下颜色变浅，最大光吸收波长处的吸光值下降从而评价样品的抗氧化能力。如图1所示，不同1183第 10 期开发与应用周 妍，等：红景天提取物的护肤功效及安全性评价研究 质量浓度红景天提取物均表现出一定的DPPH自由基清除能力，其清除作用与提取物溶液质量浓度呈正相关，500 g/mL和1 000 g/mL红景天提取物的DPPH清除率显著增强，说明红景天提取物具有一定的DPPH自由基清除作用。2.2 红景天提取物对ROS的清除作用当细胞发生氧化损伤，ROS自由基产生过多，便会引起细胞自由基链式反应、脂质过氧化，破坏细胞结构和功能等。是否能够清除多余的ROS是评价抗氧化能力的重要指标之一。如图2所示，与模型组相比，501 000 g/mL质量浓度的红景天提取物均能够清除一定的细胞模型ROS。通过减少细胞内ROS的含量从而对细胞氧化损伤起到一定保护作用，其保护作用与红景天提取物质量浓度呈正相关。图1 不同质量浓度红景天提取物DPPH清除率比较Fig.1 Co mparison of DPPH free radical scavenging rates of Rhodiola rosea extracts at different mass concentrations-20040601 00050010050080100DPPH?/%(?)/(g/mL)20图2 不 同质量浓度红景天提取物对氧化损伤细胞模型ROS的清除作用比较Fig.2 Co mparison of ROS scavenging effects of Rhodiola rodiola extract at different mass concentrations on oxidative injury cell models05001 000?1 0005001005001 5002 000?(?)/(g/mL)2.3 红景天提取物对氧化损伤细胞的保护作用如图3所示，不同质量浓度的红景天提取物溶液作用于过氧化氢损伤的成纤维细胞后，细胞成活率均有所提升。且随着质量浓度升高，细胞成活率呈现上升趋势。说明一定质量浓度范围内，红景天提取物对细胞氧化损伤具有一定的保护作用。2.4 红景天提取物弹性蛋白酶的抑制作用弹性蛋白在维持皮肤弹性中发挥重要作用，抑制弹性蛋白酶可减缓弹性蛋白流失导致的皮肤老化松弛进程，有柔肤抗皱的作用。因此弹性蛋白酶抑制剂常应用于各类抗皱活肤类护肤品中。如图4所示，不同质量浓度红景天提取物均表现出一定的弹性蛋白酶抑制作用，其抑制作用与提取物溶液质量浓度呈正相关，500 g/mL和1 000 g/mL红景天提取物的弹性蛋白酶抑制率显著增强，说明红景天提取物具有一定的维持皮肤弹性作用。图3 各质量浓度红景天提取物对成纤维细胞成活率作用比较Fig.3 Co mparison of the effects of different concentrations of Rhodiola rodiola extracts on fibroblast survival rate050?1 000500100500100150?/%(?)/(g/mL)图4 不同质量浓度红景天提取物弹性蛋白酶抑制率比较Fig.4 Co mparison of the elastase inhibition rate of Rhodiola rosea extracts at different mass concentrations-20040601 00050010050080?/%20(?)/(g/mL)1184第 53 卷开发与应用日 用 化 学 工 业（中英文）2.5 红景天提取物对酪氨酸酶活性抑制作用人的表皮基层细胞间广泛分布黑色素细胞，含有的酪氨酶可以将酪氨酸氧化成多糖，中间经过一系列的代谢过程后便生成黑色素。酪氨酸酶活性增加会导致产生的黑色素增多，酪氨酸酶决定了皮肤黑色素合成的速率。因此，酪氨酸酶作为黑色素合成的关键酶，酪氨酸酶抑制剂常因美白作用而作为添加剂用于化妆品中。如图5所示，不同质量浓度红景天提取物均表现出一定的酪氨酸酶活性抑制作用，其抑制作用与提取物溶液质量浓度呈正相关，500 g/mL和 1 000 g/mL红景天提取物的酪氨酸酶活性抑制率显著增强，说明红景天提取物具有一定的延缓黑色素生成作用。2.6 红景天提取物对黑色素合成的抑制作用如图6所示，随着红景天提取物的质量浓度升高，图5 不同质量浓度红景天提取物酪氨酸酶活性抑制率比较Fig.5 Co mparison of tyrosinase activity inhibition rates of Rhodiola rosea extracts at different mass concentrations-20040601 000500100500?/%20(?)/(g/mL)对小鼠黑色素瘤细胞中的黑色素合成抑制作用则更为显著，说明一定质量浓度范围内，红景天提取物对细胞黑色素合成具有一定的抑制作用。2.7 红景天提取物的安全性评价重复性开放型涂抹试验在临床上用于检测潜在的过敏原或刺激物，多用于临床诊断变态反应性疾病，如接触性皮炎、湿疹等，不仅是诊断化妆品接触性皮炎的金标准，还对其他化妆品不良反应的评估及诊断起到重要作用。重复性开放型涂抹试验对产品安全性（适应性）评估、配方及原料的筛选与优化、人群皮肤基础调研、化妆品皮肤病的临床研究等方面都发挥着不可替代的作用。如表2所示，涂抹红景天提取物水溶液30 min后，发现有28例0级阴性反应，1例1级可疑反应，1例2级弱阳性反应；24 h后，原28例阴性反应涂抹部位无变化出现，有1例可疑反应微弱水肿消除，变为阴性反应；48 h后，最初的1例弱阳性反应者转变为可疑反应，7天内重复涂抹均无变化，试验结束后全部受试者均为阴性反应。说明红景天提取物具有较好的安全性。表2 红景天提取物重复性开放型涂抹试验结果Tab.2 Th e results of the repeated open application test of Rhodiola rosea extract样品名称评分等级反应人数/例30 min后24 h后48 h后红景天提取物02829301 12 1 1343 结论红景天提取物能有效地清除DPPH自由基、抑制弹性蛋白酶活性维持皮肤弹性。同时红景天提取物在一定程度上表现出对细胞内酪氨酸酶活性的抑制作用，表明其可以抑制黑色素合成，存在潜在的美白功效。在人体皮肤重复性开放型涂抹试验中，根据化妆品安全性评价实验结果可以看出红景天提取物对皮肤基本无刺激作用，安全性良好。以上研究为红景天这一传统中药的进一步开发和应用提供了新的思路，在后续的研究中还需深入明确红景天苷等有效成分的具体功效、作用机制和量效关系，促使红景天早日应用于生产实践。参考文献：1 Han X J,Guo N,Zhu M X,et al.Research progress in pharmacological 图6 不 同质量浓度红景天提取物对B16细胞黑色素合成的抑制率Fig.6 In hibitory rate of Rhodiola rosea extracts at different mass concentrations on melanin synthesis in B16 cells050?1 000500100500100150?/%(?)/(g/mL)1185第 10 期开发与应用周 妍，等：红景天提取物的护肤功效及安全性评价研究 activities and related mechanism of salidroside J.Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics,2015,35（1）:171-175.2 Luo J T,Zhao W J,Wang C F,et al.Analysis of the biological function and application prospect of Rhodiola polysaccharide J.Feed Research,2022（16）:134-137.3 Zhang R,Wang X,Wang Y Q,et al.Optimal extraction of herba Rhodiolae antioxidant active ingredients by multi-factors response surface methodology J.World Chinese Medicine,2020,15（14）:2019-2025.4 Ma X D,Li Z Q,Su S S,et al.Determination of five phenolic components in Rhodiola tanguti root by UHPLC J.Journal of Chinese Medicinal Materials,2017,40（8）:1895-1897.5 Wang Y C,Tang X L,Liu D,et al.Evaluation of biochemical and cytological efficacy of Rhodiola crenulata extract used in cosmetics J.Detergent&Cosmetics,2018,41（3）:44-50.6 Liu Y T,Liu Y H.Study on whitening efficacy of Rhodiola crenulata extract on the biochemistry and cell level J.Journal of Zhengzhou University of Light Industry,2016,31（4）:39-43.7 Li Z Q,Zhang H N,He M Z,et al.Study on the chemical constituents by UHPLC-Q-TOF/MS and antioxidant activities in vitro of Rhodiola fastigiata J.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research,2021,32（10）:2361-2365.8 Sun X H,Qi X,Cui C B.Antioxidant and whitening effects of ethanol extract from irradiated Rhodiola rosea J.Science and Technology of Food Industry,2020,41（23）:325-331.9 Zhou S S,Jiang J G.Anti-aging effect of Rhodiola on the HSF and HaCaT cell J.Modern Food Science&Technology,2018,34（8）:16-23.10 Xue J,Wang G L,Chen Y F.Analysis of the technical evaluation essential on the cosmetics toxicology and human body test report J.Flavour Fragrance Cosmetics,2021,49（4）:46-50（编辑：杨 旭）