猴痘病毒CrmB蛋白的结构特征及其抗原表位分析.pdf

基金项目:湖南省自然科学基金青年项目()湖南省教育厅优青项目()湖南省财政厅卫生科技计划项目()作者简介:王道 男主管技师博士 主要从事病原生物学研究:.通讯作者收稿日期:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析王 道 罗洲飞 刘 丹(.中南大学 湘雅二医院湖南 长沙.湖南农业大学 生物科学技术学院湖南 长沙)摘 要 为了深入了解猴痘病毒()的()蛋白的结构特征和抗原表位运用 、.、.、.、.、.、等多种生物信息学方法分析 蛋白的开放阅读框、理化性质、信号肽、跨膜区、亚细胞定位、结构域、糖基化/磷酸化位点、二级/三级结构、/细胞抗原表位、抗原决定簇、蛋白同源性、配体结合位点、小分子抑制药物等 蛋白是由 个氨基酸组成的不稳定蛋白质相对分子量为 .理论等电点为.分子式为二级结构以不规则卷曲为主有信号肽具有 个糖基化位点和 个磷酸化位点 个抗原决定簇 个 细胞优势抗原表位 个 细胞优势表位 个 细胞优势表位与天花病毒同源性较高 此外还预测存在 个可能的配体结合区域和 个潜在的小分子抑制药物 为阐明猴痘病毒和宿主细胞相互作用的分子机制以及抗病毒药物和疫苗研发提供参考关键词 猴痘病毒 蛋白生物信息学分子结构抗原表位中图分类号 文献标识码 文章编号 ():./.(.)():./.微生物学杂志 年 月第 卷 第 期 .猴痘是一种罕见的人畜共患疾病由猴痘病毒()引起 猴痘病毒是一种双链 病毒为非洲西部和中部特有的人畜共患 病 毒 属 于 正 痘 病 毒 属()该 属 还 包 括 天 花 病 毒()和痘苗病毒()等 年 在丹麦哥本哈根的血清研究所被发现并从灵长类动物分离出来随后该病毒又在动物园的灵长类动物群落中被实验室人员检测到 年首次被确定为人类病原体年 成为继 后人类致病性最强的 过去的半个世纪 在中非和西非的偏远地区以低水平流行主要由啮齿动物和灵长类动物携带病毒传染给人类现今首次在北美和欧洲广泛传播引起全球的不安 截止 年 月 日全球 个国家和地区猴痘确诊报告病例超过 例美国猴痘确诊人数占全球感染的近 年 月 日世界卫生组织()宣布猴痘疫情已构成“国际关注的突发公共卫生事件”猴痘病毒一般通过接触被病人污染的环境和物品、体液或呼吸道飞沫传播首发临床症状表现为发烧、淋巴结肿、寒战、头痛、肌肉酸痛、背痛和严重疲劳斑丘疹在发烧后 出现并逐渐发展成小水泡然后在大约 内结皮 猴痘感染者死亡率为 大多数死亡病例为 岁以下的儿童 的细胞因子应答调节物()基因存在于病毒基因组的末端反向重复序列中用来编码一种肿瘤坏死因子()结合 蛋白 是一种由 细胞和巨噬细胞分泌的细胞因子其保护细胞免受病毒感染的侵袭杀死已被病毒感染的细胞 是一种分泌的病毒蛋白能与 和 结合 已有研究表明在与宿主长期共同进化的过程中正痘病毒能够编码由受染细胞分泌的蛋白结合和阻断宿主免疫系统重要成分的生物活性其中包括肿瘤坏死因子、不同种类的干扰素、白介素、趋化因子等 相关文献也报道正痘病毒具有多种免疫逃逸机制:编码 泛素连接酶和衔接蛋白直接影响病毒的识别、产生抗病毒信号和炎症生成抑制宿主细胞凋亡的多种 模拟物干扰 途径 使病毒成功感染和复制还包括 诱饵受体同系物()、丝氨酸蛋白酶抑制剂、高尔基抗凋亡蛋白 及双链 诱导的抑制凋亡作用的其他蛋白 另外 被发现均具有结合亲和力和特异性的独特特征以及不同程度的生物活性由正痘病毒物种差异地表达表现不同的免疫调节特性 目前尽管天花疫苗具有一定实质的交叉保护作用人类仍然缺乏针对 特 殊 治 疗 的 方 法 或 疫 苗 此 外 还被部分研究者称有同性传播的可能性 因此亟需对猴痘病毒 蛋白的结构特性和致病性进行深入了解才能遏制 流行的蔓延 本文借助多种生物信息学工具探究 蛋白的理化性质、分子结构和抗原表位等为我国预防和控制这种新出现的感染猴痘病毒的疫情暴发加速研发抗 的特异性疫苗和药物提供参考 材料与方法.材料通过美国国立生物技术信息中心数据库()搜寻数据并且下载得到 蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列信息 基因登录号为编码蛋白登录号为 通过 查询得到该蛋白由 个氨基酸构成序列如下:微 生 物 学 杂 志 卷.方法采用多种生物信息学工具(表)对 蛋白 格式的氨基酸序列和核苷酸序列进行预测和分析利用 网站预测 基因开放阅读框的数目运用 和 对 蛋白的理化性质与亲/疏水性进行分析采用.和.分别分析 蛋白的信号肽和跨膜结构采用 和.预测 蛋白的结构域以及其在宿主细胞的亚细胞定位运用 预测蛋白的二级结构 预测蛋白的三级结构运用.和.预测磷酸化位点和糖基化修饰位点通过 筛选 蛋白的线性优势 细胞表位通过 对 蛋白的优势 细胞表位进行分析运用 软件比对 蛋白与其他物种的相似性利用本地 .软件构建进化树表 重要生物信息数据库和网站 数据库名称 网址:/./:/././.:/./.?./.:/./.?./:/./:/./:/./.:/./.:/./.:/./:/./:/./:/././:/./:/./:/./.结果与分析.基因的开放阅读框 在线网站输入 基因的核苷酸序列进行预测结果表明 基因位于全基因组(.)的 位总长度为 基因总共包含 个开放阅读框 是最长的开放阅读框起始密码子为“”终止密码子为“”编码 个氨基酸与目的蛋白全长一致证明 蛋白全长可以完全表达(图)图 基因的开放阅读框分析.期 王 道等:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析 .蛋白的理化性质和亲/疏水性进入 网站 利用 在线对 蛋白的理化性质分析结果表明该蛋白的相对分子量为 .理论等电点为.分子式为 分别含有 个带正电荷的氨基酸残基()和 个带负电荷的氨基酸残基()总原子数 消光系数 半衰期 不稳定系数.属于不稳定蛋白脂肪系数为.亲水性平均值为.组成 受体蛋白的氨基酸共有 种 其中含量最高的为丝氨酸 占.含量最低的为甲硫氨酸占.不含色氨酸、吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸(表)表 蛋白的氨基酸组成 氨基酸数目百分比/氨基酸数目百分比/.利用 在线分析 蛋白的亲疏水性结果表明最强的亲水位点在第 位的酪氨酸亲水值为.最强的疏水氨基酸是 位的丝氨酸亲水值为.亲水性氨基酸残基数目比疏水性氨基酸残基多推测该蛋白属于亲水性蛋白(图)图 蛋白的亲/疏水性分析./.蛋白的信号肽结构、跨膜结构及结构域登录 .网站分析 蛋白信号肽序列结果显示存在信号肽的概率为.大于阈值.表明该蛋白是分泌型蛋白信号肽切割位点位于 之间概率为.信号肽序列可能为“”(图).网站预测 蛋白不具有跨膜结构(图)预测结果表明 蛋白在 位氨基酸序列存在 超家族结构域该家族包含病毒 同源物有助于 介导的抗病毒过程的修饰在 位氨基酸序列存在 超家族结构域该家族由几种长度约为 的正痘病毒蛋白组成一些家族成员被注释为 蛋白但功能未知(图)图 蛋白的信号肽预测.微 生 物 学 杂 志 卷图 蛋白的跨膜结构预测.图 蛋白的结构域预测.蛋白的二级结构和三级结构 在线网站预测 蛋白质的二级结构 结果显示多肽链中 螺旋占.延伸片段占.无规则卷曲则占.转角占.无规则卷曲所占比例最高(图)运用 构建出 个同源模型然后根据 和 数值的大小选取最为可靠的 蛋白的三级结构模型 其 分值为.分值为.利用拉氏图验证蛋白三级结构模型的可靠性模型 拉氏图表明.的氨基酸残基位于最合理区.的氨基酸残基位于其他合理区说明形成的二面角合理推测模型 具有较好的可信度(图)图 蛋白的二级结构.期 王 道等:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析 图 蛋白的三级结构.:模型:模型:模型:模型:.蛋白磷酸化和糖基化位点及亚细胞定位进入 网站利用.、.在线分别对 蛋白 糖基化和磷酸化位点进行分析 结果表明 蛋白存在 个潜在的 糖基化位点分别位于第、和 位的氨基酸其中 (.)、(.)、(.)和(.)位点的糖基化概率较高(图)设定阈值为.时 蛋白具有 个潜在的磷酸化位点其中丝氨酸磷酸化位点个苏氨酸磷酸化位点图 蛋白的 糖基化位点预测.个酪氨酸磷酸化位点 个(图)全部磷酸化位点和对应激酶见表 利用.预测 蛋白的亚细胞定位结果显示主要在宿主细胞的细胞质膜上发挥作用(图)图 蛋白磷酸化位点预测.图 蛋白亚细胞定位预测.微 生 物 学 杂 志 卷表 蛋白的磷酸化位点和对应激酶 位点分数激酶位点分数激酶位点分数激酶.蛋白的 细胞表位分析进入 在线网站预测 蛋白的优势 细胞表位阈值为.蛋白共有 个线性 细胞抗原表位分别为 、(图)图 蛋白 细胞抗原表位预测.蛋白的 细胞表位分析运用 网站对 蛋白的 细胞表位进行预测分析其中 类分子亚型 限制性 表位分值在 以上检测出 个 细胞优势表位(表)类分子亚型 辅助性 细胞表位分值在 以上检测出 个 细胞表位(表)表 蛋白 细胞优势表位分析 序号起始位置氨基酸序列得分表 蛋白 细胞优势表位分析 序号起始位置氨基酸序列得分 期 王 道等:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析 .蛋白的抗原决定簇分析采用 在 线 网 站 对 蛋白的抗原决定簇预测分析平均抗原倾向性为.总共有 个抗原决定簇表位主要位于氨基酸序列的 、位点(图)表明该蛋白抗原倾向性高容易形成抗原决定簇.蛋白的配体结合位点和小分子药物分析基于随机森林算法利用 平台预测 蛋白表面上的配体结合位点 图 的序列可视化中 种颜色的矩形分别代表预期蛋白质口袋结构和实际配体相结合的可能区域 图 的结构可视化中蛋白质表面用不同颜色表示各个口袋区域灰色代表保守性区域灰色越深表示保守性越高 表 的数据显示蓝色区域()总分值是.排名为 大于其他颜色区域的总分值说明蓝色区域是最大可能的配体结合区域其平均可能性得分为.表面氨基酸残基数目为 平均保守性得分.同时基于药物基因组学利用 数据库预测小分子药物 结果显示存在两种小分子药物可能能够抑制 蛋白(数据库登录号分别为 和)其化学式如图 所示图 蛋白抗原决定簇预测.:进化同源性:蛋白配体结合位点:图 蛋白的配体结合区域分析.图 蛋白的小分子药物预测.:甲氧基雌激素()四烯甲酰胺:(硝基苯基)硫氧基(吗啉丙基)二氢硫二唑环戊二烯酮:():()()微 生 物 学 杂 志 卷表 蛋白的配体结合区域数据 名称排名总得分保守性分值氨基酸残基数目口袋.口袋.口袋.口袋.口袋.蛋白在不同物种中的序列比较和同源性分析运用 数据库获取不同物种 蛋白的氨基酸序列 对其进行同源性比对分析(图)从 蛋白同源性矩阵可以得出猴痘病毒()与猫痘病毒()、天花病毒()、骆驼痘病毒()以及牛痘病毒()蛋白序列的同源 性 分 别 为.、.、.、.(图)进化树结果显示猴痘病毒与猫痘病毒亲缘关系最近其次是天花病毒牛痘病毒和骆驼痘病毒构成一小分支与猴痘病毒距离较远(图)图 不同物种间 蛋白同源性比对分析.期 王 道等:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析 图 不同物种 蛋白的百分比同源性矩阵.图 不同物种间 蛋白的进化树.讨 论现今国内继香港发现首起猴痘病例以来重庆又出现了一起境外输入猴痘病例 但由于这次 的特点和未知的风险特别是中国人口众多大规模传播的风险并不能完全排除 我们应加强对 的基础研究利用生物信息学工具快速追踪病毒源头识别病毒和宿主之间的相互作用分析包括开放阅读框、同源性、序列比对、糖化位点、蛋白二级和三级结构、抗原表位、配体结合区域等 这是短时间内找到预防和治疗 最有效的方法本研究比对结果显示 和、氨 基 酸 序 列 同 源 性 分 别 为 、.说明三者 蛋白相似程度较高并且进化树也表明三者亲缘关系较近 所以 引起人类疾病的症状类似 但没有 那 么 严 重 相 关 文 献 报 道 是、祖先最近的亲属虽然它们有一个共同的祖先 但 不是 的直接祖先或者后代 以往研究表明虽然 和 在遗传上和抗原上是相关的但是两者基因组的毒力因子和宿主范围编码区域内的序列是不同的 所以尝试 作为 替代模型特别是在疫苗检测和治疗对策方面基因组的差异可能导致不同宿主的发病机制明显不一样 而且 基 因 组 与/相比较鉴定存在 个单核苷酸变异对于 在各国传播也还没有明确的预防方法仅天花疫苗被证明对预防 有的有效率本研究发现 蛋白含有一段约为 个氨基酸的信号肽序列但不存在跨膜结构区域提示该蛋白在宿主细胞合成转运时信号肽并没有被清除 信号肽是细胞膜靶标和膜插入的关键因素在其他种类病毒如乙型脑炎病毒、丙型肝炎病毒都有报道推测此信号肽可能具有定位作用有利于 蛋白在宿主体内稳定合成且促使子代病毒复制 若将信号肽进行阻断干扰影响蛋白的正常功能进而使子代病毒不能合成复制不失为一种遏制病毒大量传播的新途径从 蛋白的结构上分析该蛋白的二级结构以无规则卷曲为主结构域分析表明属于 超家族 因为无规则卷曲结构的存在使蛋白空间结构容易发生变化有利于与其他物质结合 三级结构模型 具有较好的可靠性因为拉氏图显示.氨基酸残基点在深红色区域和.氨基酸残基点在深黄色区域 同时模型 三级结构的 折叠 由 条大的反平行链组成而 折叠 也由 条链组成 这些结果都与 等报道正痘病毒属编码的蛋白质采用特征性的 夹心折叠相一致 理化性质还表明 蛋白在哺乳动物中的半衰期为 不稳定系数为.脂肪系数为.属于不稳定蛋白说明该蛋白更容易折叠形成一定的空间结构这可能与猴痘病毒入侵宿主的方式相关 另外 蛋白还是一种不稳定的亲水 微 生 物 学 杂 志 卷性蛋白相关文献证实该蛋白是一种可溶性蛋白质拥有 胞外结构域能与溶液中的肿瘤坏死因子配体超家族()成员结合阻碍其与细胞表面中的同源受体相互作用从而反向信号转导抑制炎症蛋白糖基化具有广泛的作用包括介导蛋白质折叠和稳定性、免疫逃逸、宿主受体附着和细胞进入 同样蛋白磷酸化也是调节蛋白功能最普遍机制 本研究发现 蛋白可能存在 个糖基化位点、个磷酸化位点、个配体结合区域以及 个小分子抑制药物这些结果都将为药物设计提供参考 美国药监局已经批准抗病毒口服药 作为首选治疗人类猴痘但其安全性还有待大规模数据观察 对比其他两种药物 和 前者安全性可能较好但在动物模型中的研究较少虽然大多数猴痘患者症状轻微或具有自限性但先前文献报道注射免疫人痘疫苗可能具有一定的保护效应和改善临床感染症状 本研究通过 网站分别对 蛋白的 细胞线性表位进行了分析筛选出 个最可能的优势抗原表位通过 网站依据分值筛选出 细胞最可能的优势表位有 个 细胞优势表位有 个 网站也证实 蛋白容易形成抗原决定簇这些结果为研发特异性强、副反应小、安全性高的疫苗提供了可能性以替代现今美国和欧洲批准的人用天花疫苗和 与仍在流行的 有着很大的不同 基因组非常庞大比 大 倍以上 现今 在自然界中的死灰复燃是否会替代新冠病毒的流行病学地位仍然不确定 本研究借助生物信息学手段迅速分析了 蛋白结构预测了配体结合位点和抗原表位为加快疫苗和药物研发提供参考参考文献:.():.():.:.:.():.:.():.():.():.():.():.:.():.():./.():.():.():.期 王 道等:猴痘病毒 蛋白的结构特征及其抗原表位分析 .().():.():.:.():.:.():.?.():.():.():.:.:.:.():.():.().():.():.():.():.():.():.:.():.():.():.():.():.():.微 生 物 学 杂 志 卷