SN∕T 1632.4-2022 出口乳粉中克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分：PCR-CRISPR法.pdf

I C S6 7. 0 5 0C C SX1 6中华人民共和国出入境检验检疫行业标准S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2 出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:P C R - C R I S P R 法T e s t m e t h o d o f C r o n o b a c t e r s p p.(E n t e r o b a c t e r s a k a z a k i i)i n e x p o r t m i l k p o w d e rP a r t 4:P C R - C R I S P R m e t h o d2 0 2 2 - 0 3 - 1 4发布2 0 2 2 - 1 0 - 0 1实施中华人民共和国海关总署发 布前 言 本文件按照G B/T 1. 12 0 2 0和G B/T 2 0 0 0 1. 42 0 1 5的规定起草。本文件是S N/T 1 6 3 2 出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检测方法 的第4部分。S N/T 1 6 3 2已经发布了以下部分: 第1部分: 分离与计数; 第2部分:P C R方法; 第3部分: 荧光P C R方法; 第4部分:P C R - C R I S P R法。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位: 中华人民共和国上海海关、 上海市质量监督检验技术研究院、 深圳大学第一附属医院、 大连民族大学。 本文件主要起草人: 杨捷琳、 刘洋、 张清平、 薛俊欣、 杨娟、 张懿翔、 袁辰刚、 李林显、 蒋原、 王金、郭德华、 王越、 申进玲、 曲勤凤、 郑秋月、 张奕南、 赵磊。S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:P C R - C R I S P R法1 范围本文件规定了乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) (C r o n o b a c t e r s p p.) 的P C R - C R I S P R检测方法。本文件适用于乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) (C r o n o b a c t e r s p p.) 的定性检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中, 注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件; 不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。G B 4 7 8 9. 4 0 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 检验G B/T 6 6 8 2 分析实验室用水规格和试验方法G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8 实验室质量控制规范食品分子生物学检测3 术语、 定义和缩略语3. 1 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3. 1. 1 C a s蛋白 C a s p r o t e i nC a s蛋白是指C R I S P R - a s s o c i a t e d蛋白, 它是C R I S P R系统中起功能作用的相关蛋白。3. 1. 2C a s 1 2 b酶 C a s 1 2 b e n z y m eC a s蛋白的一种, 属于I I类V - b型C a s蛋白, 是c r R NA:t r a c r R NA(s g R NA) 依赖的核酸内切酶。3. 1. 3向导R N A g u i d e R N A向导R NA是指引导C a s蛋白特异性结合靶标D NA序列的R NA, 通常由c r R NA或c r R NA:t r a c r R NA(s g R NA) 复合物组成。3. 1. 4N值 N v a l u eC R I S P R方法检测结果的判定值。3. 2 缩略语下列缩略语适用于本文件。C R I S P R: 成簇的规律间隔的短回文重复序列(c l u s t e r e d r e g u l a r l y i n t e r s p a c e d s h o r t p a l i n d r o m i c r e -p e a t s) t r a c r R NA: 反式激活C R I S P R R NA(t r a n s - a c t i v a t i o n C R I S P R R NA)1S N/T1 6 3 2. 42 0 2 24 方法提要本文件通过P C R - C R I S P R方法对乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌) 开展定性检测。首先采用普通P C R进行克罗诺杆菌属f u sA基因特异性扩增, 再用C R I S P R反应特异性切割扩增产物, 观察荧光值增量并给出结果判定。C R I S P R/C a s 1 2 b是基因编辑系统中的一种, 其对应的t r a c r R NA和c r R NA通过碱基互补配对方式形成R NA复合结构, 该结构与C a s 1 2 b结合形成复合物, 如果有目标D NA存在,C a s 1 2 b蛋白在c r R NA:t r a c r R NA引导下特异性结合靶标核酸, 之后其非特异性切割单链D NA的活性被激活, 从而将体系中单链D NA报告分子切开并释放出可检测的信号。5 试剂和材料除另有规定外, 所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合G B/T 6 6 8 2一级水的要求。所有试剂均用无D NA/R NA酶污染的容器分装。5. 1 缓冲蛋白胨水(B PW) 。5. 2 裂解液:2 0 g/L C TA B,1. 4 m o l/L N a C l,0. 1 m o l/L T r i s - HC l,0. 0 2 m o l/L E D TA,p H调至8. 0。5. 3 T E缓冲液:1 mm o l/L T r i s - HC l,0. 1 mm o l/L E D TA,p H 8. 0。5. 4 蛋白酶K:2 0 m g/mL。5. 5 T r i s饱和酚。5. 6 三氯甲烷。5. 7 异戊醇。5. 8 乙醇。5. 9 2P C R缓冲液:P h a n t a M a x B u f f e r。5. 1 0 d NT P 混合液 (1 0 mM) 。5. 1 1 D NA 聚合酶。5. 1 2 N E B u f f e r:1 0 0 mM N a C I,5 0 mM T r i s - HC I,1 0 mM M g C l2,1 0 0 u g/m l B S A,p H 7. 9。5. 1 3 R NA酶抑制剂。5. 1 4 T a q M a n实时荧光P C R预混液:T a q D NA 聚合酶、P C R反应缓冲液、 氯化镁、d NT P s( 含d AT P、d UT P、d C T P、d G T P) ) 和UNG酶按比例配制的溶液。5. 1 5 检测用引物和探针P C R扩增及C R I S P R反应所用引物、c r R NA和探针序列详见表1。表1 克罗诺杆菌属引物、c r R N A与探针引物/探针序列(53 )靶基因碱基数(b p)引物F5AA C A C G C T T T C TAA C G T T GA TAAG G 3引物R5C T T T T G T C G TAAGAG C AGAG G T GAG 3c r R NA5C GAG C GAU C UGAGAAGUG G C A C AUAAG G C C AAUAAUAAUG 3f u s Aa2 52 54 0C a s 1 2 b -t r a c r R NA5GU C UAGAG GA C AGAAUUUUU C AA C G G GUGUG C C AAUG G C C A CUUU C C AG GUG G C AAAG C C C GUUGAG C UU C U C AAAAA 34 8探针5F AM - n n n n n n n n n n n n - E c l i p s e 31 2P C R扩增产物长度6 5 b p a靶序列参见附录B。2S N/T1 6 3 2. 42 0 2 26 仪器和耗材6. 1 P C R仪。6. 2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。6. 3 恒温水浴锅。6. 4 离心机: 离心力1 3 0 0 0 g。6. 5 微量移液器:0. 5 L1 0 L,1 0 L1 0 0 L,2 0 L2 0 0 L,2 0 0 L1 0 0 0 L。6. 6 涡旋震荡器。6. 7 荧光定量P C R仪或其他可检测荧光的设备。6. 8 恒温培养箱。7 试样制备7. 1 增菌培养按照G B 4 7 8 9. 4 0的方法进行样品制备和一次增菌, 样品污染浓度较低时可进行二次增菌。取检样1 0 0 g置灭菌锥形瓶中, 加入9 0 0 mL已预热至4 4 的缓冲蛋白胨水( 参见附录A) , 用手缓缓地摇动至充分溶解,3 6 1 培养1 8 h2 h。7. 2 D N A提取采用下述方法提取D NA, 也可使用等效的商品化D NA提取试剂盒提取制备模板D NA。对于7. 1获得的增菌液, 采用如下方法制备模板D NA: 吸取1 mL增菌液加入1. 5 mL离心管中,1 2 0 0 0 g离心3 m i n, 弃上清; 加入1 mL 0. 8 5%无菌生理盐水, 完全溶解沉淀,1 2 0 0 0 g离心3 m i n, 弃上清; 加入1 0 0 L无菌水混匀后沸水浴1 0 m i n, 置冰上冷却;1 2 0 0 0 g离心1 2 m i n, 上清液即为模板D NA。8 细菌基因组D N A的提取纯化8. 1 增菌液4 留存。8. 2 取2 m L增菌液, 置于5 mL离心管中,1 3 4 0 0 g离心2 m i n, 弃上清, 向沉淀中加入4 0 0 L裂解液,2 0 L蛋白酶K,5 6 振荡2 h,1 3 4 0 0 g离心5 m i n。8. 3 转移上清液到新的离心管中, 加入与上清液等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇(2 52 41, 体积比) 混合液振荡混匀,1 3 4 0 0 g离心1 0 m i n, 将上清液转移到新的离心管中, 再次加入与上清液等体积的三氯甲烷/异戊醇(2 41, 体积比) 溶液, 振荡混匀,1 3 4 0 0 g离心1 0 m i n, 将上清液转移到新的离心管中。8. 4 加入2倍体积的预冷的无水乙醇溶液, 混合均匀后室温放置2 0 m i n,1 3 4 0 0 g离心2 m i n, 弃去上清液, 加入1 mL 7 0%乙醇溶液洗涤沉淀2次, 弃去乙醇溶液, 将D NA晾干后, 加入5 0 L T E溶液充分溶解, 置于4 条件下备用。8. 5 也可用等效试剂盒提取模板D NA。9 P C R扩增9. 1 阴性对照、 阳性对照和空白对照的设置9. 1. 1 检测过程中分别设阴性对照、 空白对照和阳性对照。3S N/T1 6 3 2. 42 0 2 29. 1. 2 空白对照以无菌水作为模板。9. 1. 3 阴性对照以非克罗诺杆菌种属细菌D NA作为模板。9. 1. 4 阳性对照以AT C C 2 5 9 4 4或等效标准菌株D NA作为模板。9. 2 反应体系反应体系配制见表2。每个样品设置2个平行。表2 P C R反应体系试剂体积P C R反应混合液1 2. 5 L正向引物(1 0 m o l/L)1 L反向引物(1 0 m o l/L)1 LD NA模板(5 n g/L)1 L灭菌d d H2O补足至2 5 L9. 3 反应参数9 5 预变性5 m i n;9 5 2 0 s,6 0 2 0 s,7 2 1 0 s, 设3 0个循环;7 2 延伸5 m i n;4 保存。注: 不同型号仪器的使用可参考仪器使用操作说明。1 0 C R I S P R反应与荧光检测1 0. 1 C R I S P R反应体系见表3。表3 C R I S P R反应体系试剂体积N E B u f f e r 3. 1(1 0)2 LC a s 1 2 b(5 M)1 Lc r R NA(1 0 M)1 Lt r a c r R NA(1 0 M)1 L探针(1 0 M)1 LR NA酶抑制剂(4 0 U/L)0. 2 5 LP C R产物2 L灭菌d d H2O补足至2 0 L1 0. 2 仪器检测通道的选择4 8 温度下, 每1分钟检测1次F AM荧光(4 9 2 n m5 1 8 n m) , 持续1 5 m i n。1 1 计算公式判定值N=(1 0 m i n样品荧光值/1 0 m i n对照荧光值) / (2 m i n样品荧光值/2 m i n对照荧光值) , 如4S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2公式(1) 所示。判定值N=(S F1 0 m i n/C F1 0 m i n)(S F2 m i n/C F2 m i n)( 1 )式中:S F 样品荧光值。C F 对照荧光值。1 2 质量控制1 2. 1 空白对照: 无特异性扩增荧光增长。1 2. 2 阴性对照: 无特异性扩增荧光增长, 或N值低于1. 2 0(c u t - o f f值) 。1 2. 3 阳性对照: 有特异性扩增荧光增长, 或N值高于1. 4 0(c u t - o f f值) 。1 2. 4 空白对照和阴性对照有荧光增长时, 实验视为无效。1 3 检测结果判定和表述1 3. 1 N1. 4 0时, 判定在1 0 0 g样品中检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌)f u sA基因。1 3. 2 N1. 2 0时, 判定在1 0 0 g样品中未检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌)f u sA基因。1 3. 3 N在1. 2 01. 4 0之间, 则重复实验一次。重复实验的比值1. 2 0, 则判定为检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌)f u sA基因; 重复实验的比值1. 2 0, 则判定为未检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌)f u sA基因。1 3. 4 检出f u sA基因的样品应进一步将留存的增菌液采用G B 4 7 8 9. 4 0进行确证。1 4 结果报告未检出f u sA基因的阴性样品, 报告1 0 0 g样品中未检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌) ;f u sA基因的阳性样品, 经确证后按照确证结果报告1 0 0 g样品中检出或未检出克诺罗杆菌属( 阪崎肠杆菌) 。1 5 检测过程中防止交叉污染的措施检测过程中防止交叉污染的措施按照G B/T 2 7 4 0 32 0 0 8中附录D的规定执行。5S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2附 录 A( 资料性附录)培养基和试剂A. 1 缓冲蛋白胨水(B PW)A. 1. 1 成分蛋白胨 1. 0 g氯化钠5. 0 g磷酸二氢钾1. 5 g磷酸氢二钠9. 0 g蒸馏水1 0 0 0 mLA. 1. 2 制法加热搅拌至溶解, 调至p H 7. 20. 2, 高压灭菌1 2 1 ,1 5 m i n。6S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2附 录 B( 资料性附录)克罗诺杆菌属f u sA基因片段扩增靶标参考序列B. 1 克罗诺杆菌属f u sA基因片段扩增靶标参考序列(N C B I N o . C P 0 1 1 0 4 7. 1) 如图B. 1所示。图B. 1 扩增靶标参考序列S N/T1 6 3 2. 42 0 2 2220242361T/NS中华人民共和国出入境检验检疫行 业 标 准出口乳粉中克罗诺杆菌属( 阪崎肠杆菌)检测方法 第4部分:P C R - C R I S P R 法S N/T 1 6 3 2. 42 0 2 2*中国海关出版社有限公司出版发行北京市朝阳区东四环南路甲1号(1 0 0 0 2 3)编辑部: (0 1 0)6 5 1 9 4 2 4 2 - 7 5 3 0网址 www. c u s t o m s k b . c o m/b o o k中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本8 8 01 2 3 0 1/1 6 印张0. 7 5 字数2 0千字 年 月第一版 年 月第一次印刷印数 15 0 0*书号: 1 5 5 1 7 57 9 4定价1 2. 0 0元