固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用.pdf

生物技术通报技术与方法BIOTECHNOLOGYBULLETIN2023,39(9):97-104固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用Cinnamyl Acetate陈金行1张逸2张军涛未本美王宏勋郑明明12.3（1.武汉轻工大学生命科学与技术学院，武汉430 0 2 3；2.中国农业科学院油料作物研究所，武汉430 0 6 2；3.湖州市菱湖新望化学有限公司，湖州3130 18）摘要：采用模板法结合辛基（C8）表面修饰制备疏水有序介孔SiO,载体（OMS-C），在此基础上制得固定化脂肪酶（CSLOMS-Cg），成功应用于乙酸肉桂酯的无溶剂酶法制备。利用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）、N2-吸附脱附、傅里叶红外（FTIR）对载体材料和固定化酶进行表征。结果显示，OMS具有整齐有序的介孔结构，比表面积达149.9m/g，平均孔径为15nm。经过疏水改性后，接触角从2 0 提高到12 0。优化获得了乙酸肉桂酯的最佳反应条件为温度50，肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比1：5，固定化酶添加量2 g/L，反应时间2 h，转化率达到9 6.6%催化剂经过5次重复使用肉桂醇的转化率仍能达到8 0%。关键词：固定化脂肪酶；无溶剂；风味酯；乙酸肉桂酯；酯交换D0I:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0028Preparation of Immobilized Lipase for the Solvent-free Synthesis ofCHEN Jin-hang01,2,3(1.School of Life Science and Technology,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023;2.Oil Crops Research Institute,Chinese Academy ofAgricultural Sciences,Wuhan 430062;3.Linghu Xinwang Chemical,Huzhou 313018)Abstract:Hydrophobically ordered mesoporous SiO,(OMS)carrier was prepared by template method combined with octyl surfacemodification,and immobilized lipase was prepared on this basis(CSLOMS-Cg),which was successfully applied to the solvent-free enzymaticpreparation of cinnamyl acetate.Scanning electron microscope(SEM),transmission electron microscopy（T EM),n i t r o g e n g a s a d s o r p t i o nanalyzer,Fourier transform infrared(FTIR)and contact angle goniometer were employed to characterize the carriers and immobilized enzyme.The results showed that OMS has ordered mesoporous morphology with a specific surface area of 149.9 m/g and corresponding average porediameter of 15 nm.The hydrophobicity of the material was greatly improved after hydrophobic modification with the contact angle increasedfrom 20 to 120.The optimal reaction conditions were obtained by optimizing the reaction conditions of enzymatic transesterification:reactiontemperature was 50,m o l a r r a t i o o f c i n n a m y l a l c o h o l t o v i n y l a c e t a t e w a s 1:5,c a t a l y s t a d d i t i o n w a s 2 g/L,r e a c t i o n t i m e w a s 2 h,a n d t h econversion rate reached 96.6%.Besides,the CSLOMS-Cg maintained 80%conversion for cinnamyl alcohol after five-cycle reuse.Key words:immobilized lipase;solvent-free;flavor ester,cinnamyl acetate;transesterification乙酸肉桂酯是一种存在于肉桂、荔枝、甜瓜等植物中的天然风味物质，具有果香、花香和茉莉香，ZHANGYi?ZHANGJun-taoWEI Ben-meiWANG Hong-xunZHENG Ming-ming是我国食品安全国家标准允许使用的香精香料 ,被广泛应用于食品和化妆品中。乙酸肉桂酯主要通收稿日期：2 0 2 3-0 1-13基金项目：国家重点研发项目（2 0 2 1YFD2100303），湖州市南太湖精英计划领军型创新团队项目，国家自然科学基金项目（32 2 7 2 2 7 1，31972038），湖北省自然科学基金（2 0 2 1CFB209），中央公益类科研机构基础研究基金（16 10 17 2 0 2 2 0 14）作者简介：陈金行，男，硕士研究生，研究方向：酶法高效绿色合成风味酯；E-mail:；张逸同为本文第一作者通讯作者：王宏勋，男，博士，教授，研究方向：食品科学；E-mail:；郑明明，男，博士，研究员，研究方向：油料脂质加工；E-mail:98过天然提取【2】、化学法合成【3】和酶法合成【4 等手段制备。然而，植物中天然存在的乙酸肉桂酯含量低，提取工艺复杂，生产成本高；化学法合成通常需要在高温、高压等条件下进行，导致高能耗、高污染，副产物难分离等问题。酶法合成具有反应条件温和、专一性强、反应效率高、绿色无污染等优势5-6 。另外，酶法合成的产物被认为是天然的，价格优势明显，市场前景广阔【7-8 。因此，利用酶法合成以乙酸肉桂酯为代表的风味酯比植物提取和化学合成更具有技术优势和产业化前景。目前，酶法合成主要以游离酶为主，但游离酶在外界刺激下易失活，难回收和重复利用9。已报道的固定化手段包括物理吸附、包埋法、共价连接等方法，可以一定程度上提高游离酶的稳定性和重复使用性10-12 。其中，物理吸附法因其操作步骤简单、对酶活性影响小、成本低等优势被广泛使用。如刘昱杉等13 通过物理吸附成功将荧光假单胞菌脂肪酶固定在玻璃上，有效提高了脂肪酶的催化活性和稳定性，并可使乙酸肉桂酯的酶法产率在18 h内达99%。周美娟等14 通过物理吸附将脂肪酶固定在脱脂棉上用于合成乙酸肉桂酯，在最佳条件下，肉桂醇与乙酸乙烯酯摩尔比为1：2.16，反应温度为37，固定化酶添加量为15mg，反应12 h肉桂醇的转化率可以达到92.0%。然而，物理吸附仍存在固定化酶易脱落、酶活性不稳定的缺点，是呕待解决的瓶颈难题【15。选择合适的载体是脂肪酶物理吸附效果和活性稳定性的关键，其中，有序介孔材料OMS（o r d e r e d m e s o p o r o u s s i l i c o n）具有适当的孔径和优异的比表面积，近年来受到广泛报道和应用16 。已经报道的乙酸肉桂酯酶法制备相关文献中存在使用有机溶剂、催化效率低、耗时长、酶重复使用效果差等问题【13-14。使用有机溶剂虽然可以保持脂肪酶的催化稳定性，但是在实际生产中不利于产物分离，增加生产成本。催化效率和酶的重复使用性与生产效益直接相关，良好的催化效率和重复使用性不仅可以缩短反应的时长还可以有效节省生产投入。目前，关于OMS介孔材料用于乙酸肉桂酯的研究鲜有报道。本研究通过将假丝酵母脂肪酶（Candida sp.lipase，CSL）固定在经过疏水改性的OMS上，成功生物技术通报BiotechnologyBulletin1材料与方法1.1材料南极假丝酵母脂肪酶B（C a n d id a a n t a r c t ic alipaseB,CALB）购自诺维信公司。皱褶假丝酵母脂肪酶（Candida rugosalipase,AYS）、洋葱假单胞菌脂肪酶（Pseudomomas cepacian lipase,PS）、皱褶假丝酵母脂肪酶（Candidarugosalipase，CRL）和猪胰腺脂肪酶（Porcine pancreas lipase,PPL）购自AmanoEnzyme公司。假丝酵母脂肪酶（Candida sp.lipaseCSL）购自开泰新世纪生物技术有限公司（北京）肉桂醇、乙酸乙烯酯、正已烷、硅酸四乙酯（TEOS，98%）1,3,5-三甲苯（TMB）和三甲氧基（辛基）硅烷（Cg，97%）购自阿拉丁试剂有限公司（上海）。三嵌段共聚物（聚（环氧乙烷）10 6-聚（环氧丙烷）70-聚（氧化乙烯）10 6）（PluronicF127）购自于上海元叶生物技术有限公司（上海）。三乙胺购自国药集团化学试剂（上海）。1.2方法1.2.1奉载体OMS和OMS-C。的制备参考Li等17 方法制备载体OMS和OMS-Cg。有序介孔硅（OMS）的制备：在2 0 条件下，将1.0 g三嵌段共聚物Pluronic F127和2.5gKCl溶解于10 0 mL1.0mol/LHCl溶液。随后,加入1.2 g1,3,5-三甲基苯（TMB），并搅拌1h，再加人4.0 g硅酸四乙酯（TEOS），剧烈搅拌15min后，将溶液静置陈化48 h，然后转移至反应釜中，2 0 0 保持2 4h，用乙醇洗涤，6 0 过夜烘干。将上述干燥物进行熳烧，熳烧程序为：以5/min的速率从环境温度升高至550，保持该温度6 h，然后以10/min的速度降低至环境温度。收集最终产物，即为有序介孔硅（O M S），储存以备后续使用。通过硅烷偶联剂（Cg）与OMS表面羟基接枝改性制备0 MS-Cg：首先，将1.0 gOMS样品、50 mmCg和15L三乙胺置于10 mL甲苯中，进行超声均2023,Vol.39,No.9制备固定化脂肪酶（CSLOMS-C。），用于无溶剂体系中催化乙酸乙烯酯与肉桂醇酯交换制备乙酸肉桂酯。对反应温度、底物摩尔比、脂肪酶添加量等关键反应参数进行系统优化，为乙酸肉桂酯的绿色高效合成和工业化生产提供思路。2023,39(9)匀分散。随后，将混合物置于130 高压釜中2 0 h。最后，用乙醇洗涤3次，过滤，6 0 干燥12 h，即可获得OMS-C81.2.2脂肪酶的固定化4条件下，将脂肪酶CSL充分溶解在磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，p H 9）中，离心除去杂质获得脂肪酶溶液上清液。随后，取0.1gOMS-Cg和10 mL脂肪酶溶液上清液混合，220r/min摇动40 min，离心收集残留物，并用磷酸盐缓冲液洗涤3次。最后，-7 0 冷冻干燥2 4h，即可获得固定化酶CSLOMS-Cg。1.2.3OMS、O M S-Cg 和CSLOMS-Cg的表征通过扫描电子显微镜（SU8010）观察样品的表面形貌，使用透射电子显微镜（TG220S-TWIN）观察样品的内部结构。通过氮气吸附分析仪（ASAP2010）分析样品的比表面积和孔径分布。利用傅里叶变换红外（FT-I R）光谱仪分析样品所含基团变化以及固定化结果。使用接触角测试仪（SDC-200S）测量材料亲疏水性。1.2.4乙酸肉桂酯的酶法制备在10 mL反应瓶中,固定反应体积为5mL，调节加人乙酸乙烯酯和肉桂醇的量改变底物的摩尔比，加入催化剂浓度为1-10g/L，在不同温度下研究肉桂醇的转化率。反应过程中，每隔一定时间取样2 0 L溶于正已烷，通过0.2 2mPDVF过滤器过滤后进行气相色谱检测。1.2.5产物分析检测气相色谱柱为DB-5HT，氮气为载气（分流比为50：1）。升温程序：50 保持2min，以15/min升温至150，再以10/min升温至2 40 并保持1min。进样器温度和检测器温度为2 7 0。通过比较肉桂醇和乙酸肉桂酯的峰面积得到肉桂醇的转化率。1.2.6数据分析使用Origin2019进行数据处理和绘图，数据以均值标准差（SD）形式表示。用SPSS软件进行数据分析，用单因素方差分析确定数据组之间的统计学差异，不同字母表示P0.05水平下差异显著。2结果2.1脂肪酶的筛选脂肪酶作为酯交换反应的催化剂，在反应中起至关重要的作用，同一反应条件下，对不同种类脂陈金行等：固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用bC100Different letters indicate significant differences among treatments（P 0.0 5).T h esamebelow2.2载体表征运用扫描电子显微镜和透射电子显微镜对载体材料和固定化酶进行表征。结果显示，负载材料OMS呈六角形结构，直径约为6 微米（图2-a）。可以清楚地观察到材料表面有序、密集的孔结构（图2-b)。O M S材料的吸附等温线是典型的介孔材料特征【2 1-2 ，介孔孔径为15nm（图2-c），这保证了脂肪酶能够顺利进入材料孔道内。另外，与未修饰的99肪酶进行筛选是酶促反应的常用手段18-19。固定反应体积为5mL，加入肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比为1：5，反应温度为50，脂肪酶添加量为2 g/L的反应条件下反应3h，比较6 种不同的脂肪酶（包括CSL、PS、PPL、A YS、C A LB和 CRL）在无溶剂体系中催化制备乙酸肉桂酯的效果（图1）。可以看出，反应3h后，6 种脂肪酶在乙酸肉桂酯的制备中催化效果存在显著性差异。脂肪酶CSL催化肉桂醇的转化率达6 3.8%，远高于脂肪酶CALB（17%）和脂肪酶PS、PPL、A YS、C RL（不超过10%）。表明在此反应中脂肪酶CSL具有更好的催化效果，这与脂肪酶的选择性催化有关2 0 。因此，选择脂肪酶CSL作为乙酸肉桂酯酶法制备的催化剂进行下一步研究。70-6050820CSL不同字母表示各处理间差异显著（P0.05）。下同图1脂肪酶的筛选Fig.1 Lipase screeningadPSPPL脂肪酶LipaseeAYSeCALBCRL100材料OMS相比，经过疏水修饰的材料OMS-C.在孔径和孔容上稍有下降（图2-d），说明C。修饰成功，但并未改变载体材料的原有形貌结构。经过固定化以后，材料CSLOMS-C。的孔容急剧下降，这是因为脂肪酶成功进人材料的孔道并占据孔道2 3。生物技术通报BiotechnologyBulletin2023,Vol.39,No.9利用傅里叶变换红外（FT-IR）光谱仪分析样品所含基团变化以及固定化（图3），与OMS相比，材料OMS-Cg在2 92 3和2 8 52 cm处有明显的特征峰，这是由于C-H的对称和不对称拉伸振动所导致，表明C。被成功接枝到OMS材料上。在16 53和aO.K.XOMSCOMS-CsCSLOMS-C:0.00.2相对压力Relativepressure/(P-Pa)a：SEM 结果；b：T EM 结果；c：O M S、O M S-C，和CSLOMS-Cs的氮气吸脱附；d：O M S、O M S-C.和CSLOMS-C的孔径分布a:SEM results.b:TEM results.c:N2 adsorption-desorption of OMS,OMS-Cs and CSLOMS-Cs.d:Pore size distribution curves of OMS,OMS-Cg and CSLOMS-Cs1539cm-处的特征峰与N-H弯曲振动相关，在CSL和CSLOMS-C。的光谱中能找到相对应的特征峰，表明脂肪酶CSL成功固定在OMS-Cg上。通过使用接触角测试仪（SDC-200S）测量材料亲疏水性（图4），发现经过C疏水修饰，OMS材料的接触角从2 0 增加到12 0，表明C。修饰可有效改善OMS的疏水性，这与红外结果相吻合。经过疏水改性的材料更有利于打开脂肪酶的“盖子”结构，暴露出催化活性位点，提高脂肪酶催化活性2 4-2 5。2.3底物摩尔比对酯化反应的影响固定反应体积为5mL，C SL O M S-C 的浓度为2g/L，反应温度为50 条件下，反应3h，考察不-OMS2.5-d2.0-1.5-1.00.5-0.00.40.6图2 材料OMS的显微镜观察结果Fig.2 Microscopic observation results of material OMS同肉桂醇和乙酸乙烯酯摩尔比对乙酸肉桂酯产率的影响（图5-a）。结果表明，当肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比由1：1逐渐增大至1：5时，肉桂醇的转化率由2 3.5%上升至9 9.5%；继续增大底物摩尔比至1：10 后，肉桂醇的转化率没有继续增加，反应平衡时间缩短。这可能是由于其他条件保持不变，增加反应底物导致反应平衡向正反应方向移动2 6 。为了获得较多的产物且同时保持高效性，选择肉桂醇与乙酸乙烯酯的摩尔比为1：5进行后续的研究。2.4温度对酯化反应的影响反应温度不仅对反应速率和反应平衡时间有影响，还会对酶活性产生影响，因此，在30-7 0 范一OMS-Cs-CSLOMS-C0.81.0T01020孔径Aperture/nm304050602023,39(9)2923cm140003500图3游离脂肪酶CSL、O M S、O M S-Cs、CSL O M S-Cs的傅里叶红外结果Fig.3FT-IR spectra of the free lipase CSL,OMS,OMS-Cgand CSL OMS-CsA20B120图4OMS（A）和OMS-C：（B）的疏水测定Fig.4Hydrophobic measurement for OMS(A)andOMS-Cs(B)围内研究温度对反应的影响。保持其他反应条件不变，在不同温度下（30-7 0）反应3h，考察温度对肉桂醇转化率的影响（图5-b），结果表明，不断升高温度，反应3h，肉桂醇的最终转化率呈先上升再下降的趋势。当温度由30 升高至50，乙酸肉桂酯的产率从91.9%升高至99.5%。继续升高温度至7 0，肉桂醇的转化率随着温度的升高而降低至72.9%。说明适当提高温度有助于提高脂肪酶活性，持续升高温度，高温下脂肪酶活性会部分丧失【2 7 。综合考虑50 为最佳反应温度。2.5脂肪酶添加量对酯化反应的影响保持其他条件不变，改变固定化脂肪酶添加量陈金行等：固定化脂肪酶的创制及其在乙酸肉桂酯无溶剂制备中的应用CSL-OMSOMS-CgCSLOMS-C1653cm11539cml2852cm-130002500200015001000波数Wavenumber/cml101为1-10 g/L反应3h，研究固定化脂肪酶添加量对肉桂醇转化率的影响（图5-c），结果表明，当催化剂添加量从1 g/L增加至2 g/L,反应3h肉桂醇的最终转化率由原来的8 4.8%升高至9 9.5%。继续增加催化剂添加量为3、5、7 和10 g/L，反应达到平衡的时间不断提前，当添加剂的量为10 g/L时，0.5h反应就能达到平衡。说明增加催化剂的添加量，脂肪酶催化活性位点也随之增加，活性位点与底物之间的接触增加导致转化率上升和平衡时间缩短2 8 。综合考虑，以2 g/L作为固定化脂肪酶实际添加量，反应时间为 2 h。在最优条件下游离酶与固定化酶3h内催化效果如图5-d所示。可以很明显看到，脂肪酶经过固定化处理以后，催化效果得到很大程度提高。固定化脂肪酶在2 h反应达到平衡，转化率为96.6%，而游离酶3h的转化率仅为8 1.7%，并且固定化酶催化效率达到1159.2 mmol/（g h），是游离酶（6 53.6mmol/（g h）的1.7 倍。可能是因为固定化材料OMS为脂肪酶提供了一个相对稳定催化环境有关。并且，经过C。疏水修饰可以促进脂肪酶稳定催化环境有关。并且，经过化效果得到很大程度提高2 9。结果表明，固定化酶催化活性较游离酶大幅提升。2.6固定化酶重复使用性评价重复使用性是评价固定化酶稳定性的重要指标，也是判断其产业应用前景的依据。图6 为最优条件下固定化脂肪酶循环使用结果，尽管CRLOMS-Cs在重复使用时催化活性出现下降趋势，但5次循环使用后CRLOMS-C：仍能保持8 0%以上的催化活性，表明基于疏水改性修饰的OMS材料可以有效提高脂肪酶的活性稳定性和重复使用性，因此，大幅降低酶法制备乙酸肉桂酯的成本，表明CRLOMS-Cg在风味酯酶法制备的产业化潜力。3讨论本文提出一种基于有序介孔材料制备固定化酶用于绿色高效制备乙酸肉桂酯的新方法，肉桂醇转化率在2 h达到9 6.6%，催化效率达到1159.2mmol/（g h），是游离酶的1.7 倍。结果表明，经过固定化后脂肪酶催化活性有显著提升，这归因于疏水载体材料有利于打开脂肪酶“盖子”结构，暴露102生物技术通报BiotechnologyBulletin2023,Vol.39,No.9-30100a80604020-00.510090807060504030-20a：底物摩尔比对乙酸肉桂酯合成的影响；b：温度对乙酸肉桂酯合成的影响；c：固定化脂肪酶添加量对乙酸肉桂酯合成的影响；d：游离酶和固定化脂肪酶在最优条件下对比结果a:Effects of substrate molar ratio on the synthesis of cinnamyl acetate;b:effects of temperature on the synthesis of cinnamyl acetate;c:effects of enzyme loading on thesynthesis of cinnamyl acetate;d:comparison of free enzyme and immobilized lipase under the optimal conditionsFig.5 Effects of different reaction conditions on the synthesis of cinnamyl acetate and comparison of immobilized and freeenzymes under optimal conditions100a806040200图6固定化脂肪酶CSLOMS-C循环使用结果Fig.6Reusability of CSLOMS-Cs100b90-80708501:1401:31:51:71:101.01.5时间Time/h0.51.0时间Time/h图5不同反应条件对乙酸肉桂酯合成的影响以及最优条件下固定化酶和游离酶对比6C23循环次数Cyclenumber40一50 30一6 0 一7 0 2.02.5-1g/L2g/L一3g/L一5g/L7g/L10g/L1.52.0d43.02.53.0e520100d90-80-70604030200.5出活性位点。姚侠等4 使用Novozym435商品化脂肪酶作为催化剂合成乙酸肉桂酯，反应3h肉桂醇转化率达到99%；刘昱杉等【13 将脂肪酶PFL固定在玻璃上催化乙酸乙烯酯与肉桂醇进行转酯化反应，反应18h肉桂醇的转化率可以达到99%；周美娟等14 使用脱脂棉成功固定脂肪酶PCL用于乙酸肉桂酯的合成，反应12 h最高转化率达到92.0%。本研究使用自制CSLOMS-C：在更短的时间达到同一水平转化率（2h，96.6%）。此外，OMS硅载体具有良好的重复使用性和更高的热稳定性，特别是在恶劣条件下（即高温、强酸性/碱性反应）。最后，硅是经中华人民0.51.01.01.5时间Time/h1.52.0时间Time/h2.02.5一游离酶一州定化酶2.53.03.02023,39(9)共和国国家卫生健康委员会批准允许用于食品加工的材料，这意味着疏水有序介孔SiO2载体固定化脂肪酶有望用于食品领域的工业加工。为进一步提高固定化酶的重复使用次数，拟采用“场酶结合”的方式进行改进，即将超声、微波等技术与固定化脂肪酶相结合，旨在通过不同的处理方式降低反应过程中对脂肪酶的伤害，提升固定化酶的可重复使用能力并获得更高效的制备方法30-31。另外，也可将固定化酶与连续流反应器相结合，构建新型高效的连续流酶反应体系32 。固定化脂肪酶与连续流反应器相结合可以有效解决脂肪酶回收困难的问题，推动固定化酶制备乙酸肉桂酯工业化制备的产业化。4结论使用辛基（C）疏水改性的有序介孔二氧化硅（O M S）固定化脂肪酶。固定化脂肪酶CSLOMS-Cs在无溶剂生产乙酸肉桂酯中催化效果显著，是极具工业化应用潜力的催化剂。参考文献【1中华人民共和国卫生部.食品安全国家标准食品添加剂乙酸肉桂酯：GB283452012S.北京：中国标准出版社，2 0 12.Ministry of 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