高耐受性氧化葡糖杆菌的筛选及鉴定.pdf

D O I:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 0-9 9 7 3.2 0 2 3.0 9.0 0 2引文格式:张珂,赵群,李静,等.高耐受性氧化葡糖杆菌的筛选及鉴定J.中国调味品,2 0 2 3,4 8(9):6-1 0.Z HAN G K,Z HAO Q,L I J,e t a l.S c r e e n i n g a n d i d e n t i f i c a t i o n G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s w i t h h i g h t o l e r a n c eJ.C h i n a C o n d i m e n t,2 0 2 3,4 8(9):6-1 0.高耐受性氧化葡糖杆菌的筛选及鉴定张珂1,赵群2,李静1,殷志航1,谭海刚1*(1.青岛农业大学 食品科学与工程学院,山东 青岛 2 6 6 0 0 0;2.潍坊职业学院食品药品学院,山东 潍坊 2 6 1 0 0 0)摘要:醋酸菌是影响液态发酵食醋品质的重要因素之一,筛选高耐受性醋酸菌对食醋行业的发展具有重要影响。该研究在天然腐烂无花果中筛选出一株醋酸菌,经过生理生化和1 6 S r R NA鉴定,确定为氧化葡糖杆菌(G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s)W-1。对菌株W-1进行高温耐受性、乙醇耐受性、产乙酸能力、发酵特性和遗传稳定性研究,结果表明,菌株W-1能在3 9 或1 0%乙醇环境中较快生长;在含5%乙醇的发酵培养基中,菌株W-1发酵4 d和6 d的总酸含量分别达到(4.2 6 0.0 6)g/d L和(4.7 00.0 2)g/d L,产酸能力较强;遗传稳定性实验表明,菌株W-1的生长和产酸稳定性较好。关键词:氧化葡糖杆菌;筛选;耐高温;耐高醇 中图分类号:T S 2 0 1.3 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 0-9 9 7 3(2 0 2 3)0 9-0 0 0 6-0 5S c r e e n i n g a n d I d e n t i f i c a t i o n o f G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s w i t h H i g h T o l e r a n c eZ HANG K e1,Z HAO Q u n2,L I J i n g1,Y I N Z h i-h a n g1,T AN H a i-g a n g1*(1.C o l l e g e o f F o o d S c i e n c e a n d E n g i n e e r i n g,Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y,Q i n g d a o 2 6 6 0 0 0,C h i n a;2.S c h o o l o f F o o d a n d D r u g,W e i f a n g V o c a t i o n a l C o l l e g e,W e i f a n g 2 6 1 0 0 0,C h i n a)A b s t r a c t:A c e t i c a c i d b a c t e r i u m i s o n e o f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s t h a t a f f e c t t h e q u a l i t y o f l i q u i d-s t a t e f e r m e n t e d v i n e g a r.T h e s c r e e n i n g o f a c e t i c a c i d b a c t e r i a w i t h h i g h t o l e r a n c e h a s a n i m p o r t a n t e f f e c t o n t h e d e v e l o p m e n t o f v i n e g a r i n d u s t r y.I n t h i s s t u d y,a s t r a i n o f a c e t i c a c i d b a c t e r i u m i s s c r e e n e d f r o m n a t u r a l r o t t e n f i g s.I t i s i d e n t i f i e d a s G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s W-1 b y p h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n a n d 1 6 S r R NA i d e n t i f i c a t i o n.T h e h i g h t e m p e r a t u r e t o l e r a n c e,e t h a n o l t o l e r a n c e,a c e t i c a c i d p r o d u c t i o n a b i l i t y,f e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d g e n e t i c s t a b i l i t y o f s t r a i n W-1 a r e s t u d i e d.T h e r e s u l t s s h o w t h a t s t r a i n W-1 c o u l d g r o w r a p i d l y a t 3 9 o r i n 1 0%e t h a n o l e n v i r o n m e n t.I n t h e f e r m e n t a t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 5%e t h a n o l,t h e t o t a l a c i d c o n t e n t o f s t r a i n W-1 r e a c h e s(4.2 60.0 6)g/d L a n d(4.7 00.0 2)g/d L r e s p e c t i v e l y a f t e r f e r m e n t i n g f o r 4 d a n d 6 d.G e n e t i c s t a b i l i t y e x p e r i m e n t s h o w s t h a t t h e g r o w t h a n d a c i d p r o d u c t i o n s t a b i l i t y o f s t r a i n W-1 a r e b e t t e r.K e y w o r d s:G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s;s c r e e n i n g;h i g h t e m p e r a t u r e t o l e r a n c e;h i g h a l c o h o l t o l e r a n c e收稿日期:2 0 2 3-0 3-0 3基金项目:山东省科技特派员创新创业共同体(青岛市科技特派员梨产业服务团);预制菜工业化生产关键技术研究及产品开发作者简介:张珂(1 9 9 7-),男,硕士,研究方向:食品发酵。*通信作者:谭海刚(1 9 7 9-),男,副教授,博士,研究方向:食品发酵与酿酒科学。醋作为我国主要的酸性调味品之一,酿造历史悠久,食用人群广泛1。醋酸菌是醋酸发酵阶段的主要菌种,可将乙醇转化为乙酸,并在该过程中产生独特风味,影响成醋的品质2。目前,国内在工业上广泛应用的醋酸菌种是中科A S 1.4 1和沪酿1.0 1,但在生产过程中,普遍遇到了产酸能力不足、菌种衰退、发酵成醋口感不够柔和、风味较单一等问题3。因此,筛选发酵性能好且具有良好耐受性的醋酸菌菌株是解决行业痛点的重要手段之一。C h e n等4从醋醅中筛选得到一株对高温、高醇耐受性好的醋酸菌AA B 4,其在1 0%乙醇、3 7 条件下,产乙酸达到4 2.0 g/L。刘静等5从自然发酵的咖啡果醋中筛选出一株产酸能力较强的醋杆菌A 9,其产酸能力达到3.6 2 g/d L。本研究旨在从天然腐烂的无花果中筛选出一株产酸能力强、高温耐受性、乙醇耐受性等性能较好的醋酸菌菌株,以期能够为解决食醋工业生产中遇到的难题6基础研究 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t提供技术和理论参考。1 材料和方法1.1 实验材料腐烂无花果:山东威海的布兰瑞克熟果。1.2 实验试剂葡萄糖、无水乙醇:莱阳市康德化工有限公司;碳酸钙、酵母浸粉、琼脂粉、D NA M a r k e r:北京索莱宝生物科技有限公司;T A E缓冲液、溴化乙锭:生工生物工程(上海)股份有限公司;细菌D NA 基因组提取试剂盒:天根生化科技(北京)有限公司。1.3 实验仪器立式压力蒸汽灭菌锅 济南德强仪器有限公司;全温振荡培养箱 天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司;电热鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司;小型P C R 伯乐生命医学产品(上海)有限公司;凝胶成像系统 上海佳鹏科技发展有限公司;高效液相色谱仪 日本岛津公司。1.4 培养基普通固体培养基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖、1.5%碳酸钙、2%琼脂,灭菌后加入2%无水乙醇。乙醇胁迫固体培养基:以普通固体培养基为基础,按需要加入无水乙醇。液体基础培养基:1%酵母浸粉、2%葡萄糖,p H 6.0,使用2 5 0 m L三 角 瓶 分 装4 0 m L,1 2 1、1 5 m i n灭菌。液体种子培养基:液体基础培养基加入3%无水乙醇。液体发酵培养基:液体基础培养基加入5%无水乙醇。乙醇胁迫发酵培养基:液体基础培养基按需要加入无水乙醇。乙酸胁迫液体培养基:液体种子培养基按需要加入乙酸。1.5 实验方法1.5.1 醋酸菌分离与筛选1.5.1.1 菌种分离取腐烂无花果变酸部分1 g置于液体种子培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n富集培养2 d,然后稀释、涂布于普通固体培养基,3 0 培养3 d,选取产生透明圈的菌株分别编号。1.5.1.2 平板初筛将分离的菌株分别点接到6%乙醇胁迫固体培养基(3 0)和普通固体培养基(3 7)培养3 d,选择在两种培养基上菌落的透明圈圈径比均较大的菌株,利用F e C l3对选取的菌株进行乙酸定性分析6。1.5.1.3 平板复筛经平板初筛的菌株接入液体种子培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n培养2 0 h,得种子液。取3 L平板初筛的菌株种子液,点接到普通固体培养基3 0 培养3 d,计算菌落透明圈圈径比。1.5.1.4 发酵筛选取 5 m L平板复筛的菌株种子液接于液体发酵培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n发酵4 d,测定发酵液中总酸含量,确定目标菌株。产酸量测定方法参考G B 1 2 4 5 62 0 2 1 食品安全国家标准 食品中总酸的测定7。1.5.1.5 产乙酸能力分析取5 m L目标菌株的种子液接于液体发酵培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n发酵5 d,测定发酵液中乙酸含量。为确定所筛选目标菌株W-1产乙酸的能力,采用高效液相色谱法测定其在5%乙醇(3 0)条件下发酵5 d的发酵液中乙酸的含量,使用C1 8色谱柱(4.6 mm2 5 0 mm,5 m);于紫外波长2 1 0 n m处检测;柱温2 5;流动相为0.0 5 m o l/L的KH2P O4-H3P O4缓冲液(p H 2.8);流速0.7 m L/m i n;进样量1 0 L。乙酸标准曲线见图1。该曲线拟合公式为y=2 3 9 6.3 7+4 8 7 9.7 7x,R2为0.9 9 9 8。图1 H P L C法测定乙酸标准曲线F i g.1 S t a n d a r d c u r v e o f a c e t i c a c i d d e t e r m i n e d b y HP L C m e t h o d1.5.2 醋酸菌鉴定1.5.2.1 生理生化鉴定参照 伯杰氏系统细菌学手册8对菌株W-1进行生理生化鉴定。1.5.2.2 1 6 S r R NA鉴定使用细菌D NA基因组提取试剂盒提取菌株W-1的D NA,使用细菌通用引物进行P C R扩增(上游引物2 7 F:5 -AGAG T T T GAT C C T G G C T C AG-3;下游引物1 4 9 2 R:5 -A C G G C T A C C T T G T T A C GA C T T-3)。用1%(质量与体积比)琼脂糖凝胶电泳分离扩增D NA,溴化乙锭染色后检测。委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行1 6 S r R N A测序,通过B L A S T程序提交测序结果,在N C B I数据库中进行同源序列检索,并利用ME GA 6.0 6构建系统发育树。1.5.3 菌株W-1生理特性1.5.3.1 菌株W-1对温度的耐受能力取3 L菌株W-1的种子液点接到普通固体培养基,分别于3 0,3 5,3 7,3 9,4 1 培养3 d,观察醋酸菌生长及产酸情况。1.5.3.2 菌株W-1对乙醇的耐受能力取3 L菌株W-1的种子液分别点接到含有2%、6%、8%、1 0%、1 2%乙醇的乙醇胁迫固体培养基,于3 0 培养3 d,观察醋酸菌生长及产酸情况。7第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t基础研究 1.5.3.3 菌株W-1生长曲线测定取5 m L菌株W-1的种子液接于液体种子培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n 培养,每隔2 h测定细胞浓度(波长5 4 0 n m处的吸光值,用O D5 4 0 n m表示),绘制菌株W-1生长曲线。1.5.3.4 菌株W-1发酵曲线测定取5 m L菌株W-1的种子液接于液体发酵培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n发酵培养,每隔1 d测定细胞浓度和总酸含量,并计算产酸率,绘制菌株W-1发酵曲线。1.5.3.5 菌株W-1遗传稳定性菌株W-1于试管斜面传代1 0次,分别进行液体种子培养,各取5 m L种子液接于液体发酵培养基,于3 0、1 8 0 r/m i n发酵4 d,测定发酵液中细胞浓度和总酸含量。2 结果和分析2.1 醋酸菌分离与筛选2.1.1 平板初筛从腐烂无花果中分离出1 5 3株产生透明圈的菌株,分别以3 7(2%乙醇)和6%乙醇(3 0)作为胁迫条件进行平板初筛,挑选出在两种条件下透明圈圈径比均较大的8株菌株,分别为Z-3、Z-8、Z-1 1、Y-3、X-1、X-7、W-1、W-9。对这8株菌株发酵液进行乙酸定性分析,结果见图2。图2 乙酸定性分析F i g.2 Q u a l i t a t i v e a n a l y s i s o f a c e t i c a c i d由图2可知,菌株的发酵液可以与F e C l3反应产生红褐色沉淀,所以判断发酵产物中存在乙酸。2.1.2 平板复筛图3 普通固体培养基平板复筛菌落F i g.3 R e s c r e e n e d c o l o n i e s o n t h e c o mm o n s o l i d m e d i u m表1 普通固体培养基平板复筛菌落透明圈圈径比T a b l e 1 R a t i o s o f d i a m e t e r s o f t r a n s p a r e n t c i r c l e s o f p l a t e r e s c r e e n e d c o l o n i e s o n t h e c o mm o n s o l i d m e d i u m菌株圈径比菌株圈径比Z-32.8 30.0 8bX-12.8 60.0 8bZ-82.9 90.1 3a bX-72.4 50.0 4cZ-1 12.5 00.1 0cW-93.1 60.0 8aY-32.9 70.0 3bW-12.8 90.1 6b 注:不同小写字母表示结果之间有显著性差异(P 0.0 5),下图、表同。由图3和表1可知,菌落透明圈圈径比较大的菌株分别是W-1、Z-8、Y-3和W-9,其中菌株W-1的圈径比最大,为(3.1 60.0 8)。2.1.3 发酵筛选图4 菌株发酵筛选F i g.4 S c r e e n i n g a n d f e r m e n t a t i o n o f s t r a i n s 由图4可知,菌株W-1总酸含量最高,为(4.2 20.0 6)g/d L,比Z-8、Y-3和W-9分别提高了2.9%、1 7.3 5%、1 7 0.5 1%,最终确定菌株W-1为目标菌株。2.1.4 产乙酸能力分析图5 菌株W-1发酵液高效液相色谱图F i g.5 H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a m o f s t r a i n W-1 f e r m e n t a t i o n b r o t h通过图1乙酸标准曲线计算乙酸含量为(4.0 10.1 6)g/d L。2.2 醋酸菌鉴定2.2.1 生理生化鉴定图6 菌株W-1革兰氏染色结果(G-)F i g.6 G r a m s t a i n i n g r e s u l t s o f s t r a i n W-1(G-)8基础研究 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t表2 菌株W-1生理生化鉴定结果T a b l e 2 P h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n r e s u l t s o f s t r a i n W-1试验项目测定结果革兰氏染色 G-乙醇氧化+乙酸氧化-乳酸氧化-产葡萄糖酸试验+接触酶检测+氧化酶检测-注:“+”表示呈阳性;“-”表示呈阴性。由图6和表2可知,菌株W-1为革兰氏阴性菌株,菌体呈短杆状,大小为(0.6 30.7 6)m(1.1 91.5 1)m,可以氧化乙醇产生乙酸,不能氧化乙酸和乳酸,其他试验结果也均符合葡糖杆菌属的生理生化特征。2.2.2 1 6 S r R NA鉴定对菌株W-1进行1 6 S r R NA鉴定,其P C R产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图7。图7 琼脂糖凝胶电泳F i g.7 A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s由图7可知,在1 5 0 0 b p左右有一条清晰的条带,测得菌株W-1的1 6 S r R N A基因序列,其含有1 3 9 4 b p碱基。通过B L A S T程序提交序列,进行同源序列检索,并通过M E G A 6.0 6软件构建系统发育树,结果见图8。图8 菌株W-1系统发育树F i g.8 P h y l o g e n e t i c t r e e o f s t r a i n W-1菌株W-1与氧化葡糖杆菌G l u c o n o b a c t e r o x y d a n s D S M 3 5 0 3(N R 0 2 6 1 1 8.1)为同一种属,基因序列同源性为9 9.6 4%,确定菌株W-1为氧化葡糖杆菌(C GM C C N o.1 8 5 0 0)。2.3 菌株W-1生理特性2.3.1 菌株W-1的高温耐受能力温度过高导致菌体产酶能力下降,因此生长及产酸受到抑制9。将菌株W-1接种到普通固体培养基(2%乙醇),分别在不同温度下培养,其生长及产酸结果见图9。图9 菌株W-1的温度耐受性F i g.9 T e m p e r a t u r e t o l e r a n c e o f s t r a i n W-1由图9可知,菌株W-1在3 03 9 范围内生长没有明显差异,均能较快生长且没有明显的延滞期,这与P e r u m p u l i等在斯里兰卡椰子醋中筛选的醋酸菌G l u c o n o b a c t e r菌株S L 1 3 E-2和S L 1 3 E-3的耐高温特性相近,但这两株菌株延滞期长达2 d和3 d且乙酸产量较低,只有3.1 5 g/d L和3.0 2 g/d L9。2.3.2 菌株W-1的乙醇耐受能力将菌株W-1分别接种到含有不同乙醇浓度的固体培养基,3 0 条件下培养,其生长及产酸结果见图1 0。图1 0 菌株W-1的乙醇耐受性F i g.1 0 E t h a n o l t o l e r a n c e o f s t r a i n W-1由图1 0可知,菌株W-1在1 0%乙醇中可以生长并产酸,说明其乙醇耐受能力较热带醋杆菌J M 2和巴氏醋杆菌B 1 0 3强。同时可以看出,菌株W-1的生长和产酸能力随着乙醇浓度的升高而逐渐变弱。在含2%8%乙醇的固体培养基,菌株W-1生长1 d便形成了明显的菌落,而在1 0%乙醇的培养基上2 d才形成菌落,说明乙醇对菌株W-1的生长及产酸产生抑制作用1 0。2.3.3 菌株W-1生长曲线由图1 1可知,菌株W-1的延滞期为0 2 h,对数期为2 2 8 h,稳定期为2 8 3 6 h,处于对数期的细菌对外界因素敏感、形态典型、活性好,因此选择菌株W-1的种子培养时间为2 0 h。9第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t基础研究 图1 1 菌株W-1生长曲线F i g.1 1 G r o w t h c u r v e o f s t r a i n W-12.3.4 菌株W-1发酵曲线菌株W-1生长和产酸受到高浓度乙醇的抑制,因此菌株W-1在 3%乙醇(3 0)种子培养后,再将其种子液接于发酵培养基(5%乙醇、3 0)进行发酵,发酵曲线见图1 2。图1 2 菌株W-1发酵曲线F i g.1 2 F e r m e n t a t i o n c u r v e s o f s t r a i n W-1由图1 2可知,菌株W-1发酵过程中,细胞浓度和总酸含量呈现逐渐增长的趋势,而产酸率则先上升后下降。4 d时产酸率为(1 1.9 40.6 9)g/d,此时总酸含量达到(4.2 60.0 6)g/d L;4 d之后产酸率迅速降低,总酸含量增长缓慢,发酵6 d后总酸含量达到(4.7 0 0.0 2)g/d L。其总酸含量均高于已筛选的氧化葡糖杆菌E 3 1 1和葡糖杆菌G r a 9 0 41 2,二者的总酸产量分别为3.3 5 g/d L和3.5 7 g/d L。2.3.5 菌株W-1传代稳定性将菌株W-1传代1 0次后分别在5%乙醇条件下发酵4 d,其生长和发酵情况见表3。表3 菌株W-1传代稳定性T a b l e 3 P a s s a g e s t a b i l i t y o f s t r a i n W-1传代次数OD5 4 0 n m总酸含量/(g/d L)11.1 8 80.0 0 4a b4.2 10.0 6a b c d21.2 0 60.0 1 0a b4.1 50.0 3d31.1 9 30.0 1 7a b4.2 20.0 6a b c d41.1 9 10.0 1 7a b4.1 70.0 2c d51.2 1 30.0 2 5a4.3 20.0 8a61.1 7 80.0 2 0b4.2 50.0 1a b c d71.1 8 30.0 1 2b4.2 90.0 4a b81.1 9 10.0 0 9a b4.3 10.0 5a b91.1 9 70.0 1 7a b4.2 00.0 4b c d1 01.1 8 60.0 1 2a b4.2 80.0 5a b c 由表3可知,菌株 W-1传代1 0次后在波长5 4 0 n m处的吸光值维持在1.1 7 81.2 1 3之间,发酵液总酸含量维持在4.1 5 4.3 2 g/d L之间,生长和产酸情况均无明显变化,说明菌株W-1稳定性较好。3 结论本研究以腐烂无花果为来源,采用平板分离法经过初筛、复筛及发酵筛选,最终筛选出一株高温耐受性好、乙醇耐受能力强的醋酸菌菌株W-1,并经过生理生化鉴定、1 6 S r R N A测序分析,确定该菌株为氧化葡糖杆菌。研究菌株W-1的生理特性发现,菌株W-1可以耐受3 9 高温或1 0%乙醇;在含5%乙醇的发酵培养基中,菌株W-1发酵4 d和6 d,总酸含量分别达到(4.2 6 0.0 6)g/d L和(4.7 0 0.0 2)g/d L,产酸能力较强;传代稳定性实验表明,菌株W-1的生长和产酸稳定性较好。参考文献:1 阳飞,张华山.食醋及其营养保健功能研究进展J.中国调味品,2 0 1 7,4 2(5):1 7 1-1 7 5.2TAOU F I K E,ME R I EM Y,YOUN E S S S,e t a l.S c r e e n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f n e w A c e t o b a c t e r f a b a r u m a n d A c e t o b a c t e r p a s t e u r i a n u s s t r a i n s w i t h h i g h e t h a n o l-t h e r m o t o l e r a n c e a n d t h e o p t i m i z a t i o n o f a c e t i c a c i d p r o d u c t i o nJ.M i c r o o r g a n i s m s,2 0 2 2,1 0(9):1 7 4 1.3 周滟晴,刘婷,周婉婷,等.高产酸果醋醋酸菌的筛选鉴定及其耐醇和耐温性探究J.食品与发酵工业,2 0 2 1,4 7(1 0):7 2-7 8.4C H E N Y,B A I Y,L I D S,e t a l.S c r e e n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f e t h a n o l-t o l e r a n t a n d t h e r m o t o l e r a n t a c e t i c a c i d b a c t e r i a f r o m C h i n e s e v i n e g a r P e iJ.W o r l d J o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y a n d B i o t e c h n o l o g y,2 0 1 6,3 2(1):1 9 6 1-1 9 6 8.5 刘静,叶鹏飞,刘继华,等.自然发酵咖啡果醋中醋酸菌的分离鉴定J.中国酿造,2 0 2 2,4 1(9):1 3 0-1 3 3.6 钟彩霞,田佳雪,王晓琪,等.一株番茄表面着生醋酸菌的分离鉴定及产酸条件优化J.生物技术进展,2 0 2 0,1 0(5):5 6 4-5 6 9.7 国家卫生健康委员会,国家市场监督管理总局.食品安全国家标准 食品中总酸的测定:G B 1 2 4 5 62 0 2 1S.北京:中国标准出版社,2 0 2 1.8RE布坎南,NE吉本斯.伯杰氏系统细菌学手册M.北京:科学出版社,2 0 0 4.9P E R UM P U L I P A,W A T A N A B E T,T O Y A M A H.I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e r m o t o l e r a n t a c e t i c a c i d b a c t e r i a s t r a i n s i s o l a t e d f r o m c o c o n u t w a t e r v i n e g a r i n S r i L a n k aJ.B i o s c i e n c e,B i o t e c h n o l o g y,a n d B i o c h e m i s t r y,2 0 1 4,7 8(3):5 3 3-5 4 1.1 0N I T T A Y A P,P A T T A R A P O R N Y,W I L A W A N S,e t a l.I d e n t i f i c a t i o n o f a c e t i c a c i d b a c t e r i a i s o l a t e d i n T h a i l a n d a n d a s s i g n e d t o t h e g e n u s A c e t o b a c t e r b y g r o E L g e n e s e q u e n c e a n a l y s i sJ.A n n a l s o f M i c r o b i o l o g y,2 0 1 5,6 5(3):1 5 5 7-1 5 6 4.1 1 李云,刘玉德,苏树友,等.一株果醋发酵氧化葡糖杆菌的鉴定及发酵特性J.中国酿造,2 0 1 2,3 1(5):9 2-9 6.1 2 廖延智,黄丹莹,司徒满泉,等.紫外诱变选育葡糖杆菌及高产醋酸发酵条件优化J.食品科技,2 0 1 4,3 9(6):2 1-2 5.01基础研究 第4 8卷 第9期2 0 2 3年9月 中 国 调 味 品C h i n a C o n d i m e n t