第3章-污染物的生物效应检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 污染物的生物效应检测,内容提要：,本章介绍了生物测试和测试方法的基本概念以及表示污染物毒性的基本参数。系统地介绍了毒性试验、致突变试验、致癌试验、致畸试验和微宇宙试验的基本概念、基本原理和基本方法。,第一节 生物测试及方式,一、生物测试的定义,生物测试指系统地利用生物的反应测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时，所导致的影响或危害。,可利用,包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落生态系统各级水平上的反应。,可作为,化学和物理的检测的补充。,能全面,地评定污染物对生态系统的影响。,生物测试的意义,监测环境质量的变化,确定单一污染物的安全浓度,研究多种污染物的联合作用的生物效应,制定污染物的排放标准和环境质量标准,污染物的生态风险评价,水污染的生物测试,毒性试验,对大气污染的生物测,植物人工熏气,静止式：,大多数情况下采用,流动式：,在以下特殊情况下采用,易挥发或不稳定污染物,因为在试验过程中污染物浓度会降低，受试生物对污染物的暴露程度会逐渐减少。,代谢速率快的受试生物,因为排出代谢废物较多，代谢废物的累积和分解会产生不适当的高浓度二氧化碳和氨，从而影响试验结果。,BOD较高的废水,因为溶解氧的耗尽会对受试生物造成压迫。,2.中期生物测试,中期生物测试 是介于短期和长期之间的一类生物测试方法。,在短期与中期或在中期与长期之间，没有严格的区分。,一般的划分：,8d之内算做短期,8,90d的算做中期,中期的试验可以是,静止式,，但在大多数情况下采用,流动式,。,3.长期生物测试,指在低浓度污染物作用下，暴露时间要尽可能长达受试生物的整个生活史的一类生物测试，又称全生活史生物测试。,动物：,要从一个卵期到下一代的卵期或更,长时间内连续进行。,如浮游生物：,可持续好几代。,部分生活史的生物测试：,有些生物的生活史很长，甚至长达数年，因此，人们选用在整个生活史中的最敏感几个阶段来进行。,(二)受试生物的选择,受试生物必须符合的条件：,对试验毒物或因子要具有敏感性。,应具有广泛的地理分布和足够的数量，并在全年中在某区域范围内可获得。,应是生态系统的重要组成，具有重大的生态学价值。,在实验室内易于培养和繁殖。,三、生物测试的标准化,（一）影响生物测试结果的因素,1.试验条件,试验的温度、水质和盐分、水流速度、溶解氧、受试生物的总量、试验溶液的pH值和构成试验装置材料等不仅影响生物对毒物的反应，而且影响作用于生物的毒物浓度、性质和形态。,（二）测试方法标准化的优点,在同一类型的不同实验室中进行许多有用的测试并把结果选择出来。,增加数据的精确度,测试可以被其他实验室重复,各种人员容易进行该试验,可方便地将数据进行比较,可为环境管理、环境立法(环境标准建立)提供可靠的数据或结果。,毒物与非毒物之间并不存在绝对的界限，而只能以引起中毒的剂量大小相对地加以区别。,讨论一种化学物质的毒性时，必须考虑到它进入机体的数量(剂量)、方式(经口食人、经呼吸道吸入、经皮肤或粘膜接触)和时间分布(一次或反复多次给予)。,最基本的因素是,剂量,。,2.中毒,生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态称中毒。中毒是各种毒性作用的综合表现(包括局部的和全身的)。,根据病变发生发展的快慢，可区分为：,急性中毒,亚急性中毒,慢性中毒,3.毒性,有毒物质接触或进入机体后，引起生物体的易感部位产生有害作用的能力。,(1)毒性作用或毒效应,化学物引起生物体损害的总称为毒性作用。毒性作用可通过观测的方法来判断。,例如：,有机磷农药对胆碱酯酶有抑制作用；,苯可抑制造血功能导致贫血；,强酸、强碱可引起局部的皮肤灼伤等等,(2)无损害作用,无损害作用的特点：,不引起机体形态、生长发育和寿命的改变；不 引起机体功能容量的降低和对额外应激状态代偿能力的损害；,所引起的生物学变化一般是可逆的，当停止接触化学物后，不能检出机体维持体内稳态能力的降低；,不能使机体对其他环境因素不利影响的易感性增强。,(3)损害作用,生物体接触外来化学物期间或停止接触后可导致的损害作用包括：,机体维持体内的稳态能力产生不可逆的下降；,对某些环境因素不利影响的易感性增高；,代谢速度降低；,酶系的相对活力发生异常改变。,(5)剂量效应关系和剂量反应关系,剂量效应关系：,表示不同剂量在个体或群体中表现出来的量效应大小之间的关系，,剂量反应关系：,表示不同剂量与其效应发生率之间的关系。,剂量反应关系是评价化学物质的毒性和确定安全接触水平的基本依据。,测定这种关系是毒性试验和化学物质安全评价的基本内容之一。,(6)危害性,有毒物质在与机体接触或使用过程中引起中毒的可能性。,在评价毒物的毒性及危害性时，单凭绝对毒性是不够的，应考虑到这种物质的挥发性和在水或血液中的溶解性。,挥发性小、易溶于水或血液中并能迅速达到中毒浓度的化学物质其危害性就大，反之则小。,(二)表示毒性的常用参数,1.毒性试验常用参数,(1)致死剂量或致死浓度,Lethal Dose，LD,Lethal Concentration，LC,表示一次染毒后引起受试动物死亡的剂量或浓度。,绝对致死剂量或浓度(LD,l00,；LC,100,)：,表示一群动物全部死亡的最低剂量或浓度,。,半数致死剂量或浓度(LD,50,；LC,50,)：,能引起一群动物的50死亡的最低剂量或浓度。,最小致死剂量或浓度(MLD，MLC)：,能使一群动物中仅有个别死亡的最高剂量或浓度。,最大耐受剂量或浓度(LD,0,，LC,0,)：,能使一群动物虽然发生严重中毒，但全部存活无一死亡的最高剂量或浓度。,最大无作用剂量：,是评定外来化合物毒性作用的主要依据，并可以其为基础，制订人体每日容许摄入量和最高容许浓度。,每日容许摄入量(ADI)：,指人类终生每日摄入该外来化学物对人体不致引起任何损害作用的剂量。,最高容许浓度：,指某一环境污染物可以在环境中存在而不致对人体造成任何损害作用的浓度。,(3)最小有作用剂量,指能使机体发生某种异常变化所需的最小剂量，即能使机体开始出现毒性反应的最低剂量。因为最小有作用剂量一般都是略高于最大无作用剂量，故亦称为中毒阈剂量(Threshold Level)。,具有类似意义的是最小有作用浓度，表示环境中存在某些环境污染物能引起机体开始出现毒性反应所必需的最低浓度。,(4)毒作用带,一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外来化合物危险性的指标。,常用的有：,急性毒性作用带,比值愈大，外来化合物引起死亡的危险性就愈小；比值愈小，引起死亡的危险性就愈大。,(5)半数效应浓度,Median Effect Concentration，EC,50,指能引起50受试生物的某种效应变化的浓度。通常指非死亡效应。,(6)半数抑制浓度,Median Inhibition Concentration，IC,50,是指能引起受试生物的某种效应50抑制的浓度。,2.毒物单位与分级,(1)毒物单位,吸入毒物:,以在空气中的浓度以mgm,3,、mgL表示;,哺乳动物:,以mgkg,或 mlkg体重表示;,水环境中毒物:,以mgL、ug/L 表示,每单位体表面给药量(mgm,2,)表示,(2)毒性分级,目前使用的分级方法、标准和毒性级的名称在毒理学文献中很不统一，因而往往造成混乱和判断的错误;,目前要统一也比较困难;,国内较为通用的毒性分级系统列于表3-13-6。,二、急性毒性试验,Acute Toxicity Test,研究化学物质大剂量一次染毒或24h内多次染毒动物所引起的毒性试验。,目的：,在短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。,（一）哺乳动物急性毒性试验,实验动物：,小鼠、大鼠、豚鼠、兔,染毒方式：,毒物饲喂、经皮接触,常规方法：,（1）先查阅文献中与受试物类似的动物的LD,50,；,（2）以3倍之差的3个剂量组进行预试验，每组3只动物，求出动物全活、全死剂量；,（3）在全活全死剂量之间设56个剂量组，各组间距按1.2-1.5等比级数设计；,（4）选用适宜的染毒方式染毒，观察2周内的死亡情况；,（5）剖检死亡和濒死动物及部分存活动物，做大体病理解剖检查；,（6）计算LD,50,或LC,50,。,(二)水生生物急性毒性试验,1.鱼类毒性试验,(1)实验用鱼的选择,必须具有一定区域代表性；便于在实验条件下饲养；对化学物质较为敏感；一般体长在7 cm以下为宜。采用金鱼时，一般在3cm以下，最长体长不应超过最小体长的1.5倍。,选择行动活泼、体色光泽、鱼鳍完整舒展、逆水性强和食欲好的健康鱼，在实验室内观察一周后使用。,(2)实验条件,实验容器采用玻璃缸或白搪瓷桶，其盛水量以每条鱼23L水为宜，水的pH值为6.7,8.5，冷水温度为12,18，温水温度为2028，水温变化为2。水中溶解氧不能低于4 mgL，可用清洁的河水、湖水或放置3天以上的自来水。,（3）半数致死浓度(LC,50,)的测定,预试验：,确定100致死浓度和不引起死亡的最大浓度。,在此浓度范围，按,等对数间距,确定57个浓度组（包括对照），1020尾/组，染毒4896 h。,染毒刚开始8 h内经常观察，以后可作24h、48 h、72 h、96h的定期观察，记录中毒反应及死亡时间。死亡鱼立即取出剖检。,试验期间：,保持溶解氧、pH值、水温等的稳定；,记录24 h、48h、96h各组鱼的死亡数；,按LC,50,计算方法，求出相应时间的LC,50,。,采用的计算方法：,直线内插法,对数概率模式法,2.水蚤类急性毒性试验,水蚤类是淡水生物，对许多毒物很敏感。,水蚤类的世代周期短，实验室易培养，产仔量多，是一类很好的试验生物，且试验项目使用的参数在个体间相对恒定，为试验结果统计学处理提供方便。,试验装置简单，省人力，在水毒理学研究上广泛应用。,大型水蚤是水蚤类毒性试验的标准生物，试验用水蚤一般为孤雌生殖新生蚤(24h)。,3.藻类急性毒性试验,通过测定藻类的生物量，可评价有害物质对藻类生长的作用，反映对水体中初级生产营养级的影响以及对整个水生生态系统的可能的综合环境效应。,在藻类毒性试验中，应定时取样测定藻类的生长情况，一般为24 h或48 h取样一次。在72h和96h取样测定毒物对藻类影响的IC,50,值，即与对照相比，生长率抑制50的毒性浓度。,(三)蚯蚓急性毒性试验,蚯蚓急性毒性试验的目标：,评价环境中化学物质，如农药对土壤中动物的急性伤害。,常用的蚯蚓品种：,赤子爱胜蚓，其生活周期短，繁殖能力强，易于饲养。,赤子爱胜蚓不是典型的土壤种类，但它存在于富含有机质的土壤中，对化学物质的敏感性与栖息在一般土壤中的蚯蚓类似。,方法：,滤纸接触毒性试验：,滤纸接触毒性试验简单易行，可对受试物毒性进行初筛。将蚯蚓与湿润滤纸上的受试物接触，测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。,人工土壤试验：,将蚯蚓置于含不同浓度受试物的人工配制土壤中，饲养7d和14d，评价其死亡率。应包括使生物无死亡发生和全部死亡的两组浓度。整个试验期为14d，每一处理组和对照组应有4个平行样。,三、亚慢性和慢性毒性试验,（一）亚慢性毒性试验,在相当于动物生命周期的130 120时间内，使动物每日或反复多次接触受试物的毒性试验。其目的是为进一步对受试物的主要毒作用、靶器官和最大无作用剂量或中毒阈剂量作出估计。,1.实验动物及分组,（1）亚慢性试验中试验动物的种属和品系，应当是急性毒性试验证明的对受试物敏感的动物种属和品系，同时还应考虑与慢性毒作用试验中预计使用的动物种属和品系相同。,（2）一般要求选择两种试验动物，啮齿类和非啮齿类各一种，以便于更全面地了解受试物的毒效应。,（3）实验时选用健康、年幼的动物，小鼠体重为14,17 g，大鼠体重50,80 g，家兔和猫体重1,2 kg，狗体重5,8 kg。各试验组动物体重均值应相近，各动物体重不应超过组平均体重的20。,（4）大鼠各组不少于20只；家兔、猫、狗等较大动物，每组不应少于4,6只，雌雄各半。至少设3个剂量组和一个对照组。,2.染毒剂量及实验期限,适宜的剂量为高剂量组能引起明显中毒反应，但不引起很多动物死亡；低剂量组不引起任何中毒反应；介于二者之间的为中间剂量组。另设一组对照组。,一般用LD,50,(LC,50,)的 180,150 作为亚慢性试验剂量。试验期限随目的和要求或动物不同而异，大鼠可90d，较大的动物可4,6月。,3.染毒途径,亚慢性毒性试验中接触外来化合物的途径，应尽量模拟人类在环境中实际接触的方式或途径，此外还应与预期进行慢性毒作用试验的接触途径相一致。亚慢性试验中动物接触外来化合物的途径，主要是经胃肠道(经口)、呼吸道及皮肤接触。,4.观察指标,(1)一般综合指标,观察动物的一般活动、症状和死亡情况，每周称重一次，记录饲料或饮水量，计算生长率(各组每周摄入食量与体重增加量之比)，并计算脏器湿重与单位体重的比值(脏器系数)。,(2)血液及生化检验,主要指血清和肝、肾功能的检验。常规项目包括血红蛋白、红细胞数、白细胞数、血小板数、谷草转氨酶、血清尿素氮等。,(3)病理组织学检查,在外来化合物的亚慢性毒作用试验中应重视病理组织学检查，必要时还可进行组织化学和电镜检查。实验过程中解剖死亡或濒死动物。实验结束时，处死所有动物进行尸检。如未见明显病变，可将高剂量组和对照组的主要脏器进行病理学检查，发现病变后再对较低剂量相应器官组织进行检查。,5.试验评价,由试验结果可对受试物的主要作用、靶器官和最大无作用水平及中毒阈剂 量作出初步估计，并为进一步开展慢性毒性试验提供依据。,(二)慢性毒性试验,慢性毒性试验是指以低剂量外来化合物，长期与试验动物接触，观察其对试 验动物所产生的生物学效应的试验。,通过慢性毒性实验，可确定最大无作用剂量，为制订人体每日允许摄人量(,Allowable Daily Intake，ADI,)和最高容许浓度(,Maximam Allowable Concentration，MAC,)提供毒理学依据。,1哺乳动物的慢性毒性试验,(1)试验动物及分组,试验动物的年龄应低于亚慢性试验，选用断乳的动物，如小鼠出生后三周之内，体重1012g；大鼠出生后3-4周，体重5070日为宜。试验动物的性别一般要求雌雄各半。设置3-4剂量组和1对照组，其他要求同亚慢性实验。,(2)染毒剂量和实验期限,高剂量组应引起明显的毒性反应，低剂量组应不引起毒性作用，在此两组中间再设1-2个剂量组，可根据亚慢性实验资料，取其最低中毒剂量的110、120、及150(或LD,50,的1100120中取34个剂量)作为慢性试验剂量。试验期限为112个月，如包括致痛实验应1824个月。,(3)染毒途径,同亚慢性毒性试验。,(4)观察指标,基本同亚慢性实验，另作如下要求：,在试验的第一个月，每周称体重一次；46个月期间，每两周称体重一次；以后每4周称重一次。,每两个月进行一次血液学及其他生长指标的测定。一般可从各组每种性别中任取610只进行测定。,对病理检查作半定量的评定，即除对剖检及组织学检查加以详细描述外，还需根据病变程度加以分级评分(表3-7)。,(5)试验评价,通过慢性毒性试验所获得的结果，对受试物在低剂量长时间接触机体时所引起的毒性作用有更深入了解，可依据敏感观察指标出现异常的,最小阈剂量,，找出该受试物慢性毒作用的,最大无作用剂量,，为受试物能否应用或为制订其在环境中卫生标准，提供重要的参考依据。,2.水生生物的慢性毒性试验,将试验种群连续暴露在不同浓度的化学物质中（足够长的时间），每个种群在规定的时间内观察其死亡率、产卵率、孵化率、幼体成活率、体长及体重的变化，与对照进行比较。,四、蓄积毒性试验,(一)基本概念,低于中毒阀剂量的外来化合物，反复多次地与机体持续接触，经一定时间后使机体出现明显的中毒表现，即为蓄积毒性作用。,蓄积毒性作用是由于外来化合物进入机体的速度大于有机体消除的速度，而使外来化合物在体内的量不断累积，达到了使机体引起毒性作用的阈剂量所致。,1.物质蓄积,环境污染物不断进入机体内，其吸收量大于排出量，使其在体内的量逐渐积累增多。,2.功能蓄积,不断进入机体内的环境污染物，引起机体一定结构或功能的变化，并逐渐累积加重，最后导致出现损害作用。,3.相互关系,在物质蓄积的情况下，肯定存在机体一定结构和功能的改变，而功能改变的累积也必须以物质累积为基础，两者同时存在，互为基础，无法严格加以区别。,(二)蓄积试验的研究方法,1.蓄积系数法,蓄积系数(K)：,分次给受试物后，引起50受试动物出现某种毒效应的总剂量(LD,50(n),)与一次给受试物后引起50受试动物出现同一毒效应的剂量(LD,50(1),)的比值。,（1）蓄积系数的强度级,（2）测定蓄积系数的实验方法,固定剂量每天连续染毒法,对受试动物以1/10,1/20 LD,50,的固定剂量，每天染毒一次，观察记录动物死亡情况。当染毒剂量累计达到5个LD,50（1）,以上时，若受试动物死亡数未超过半数，此时的蓄积系数已大于5，表明该受试物的蓄积作用不明显。如果染毒过程动物相继陆续死亡，记下受试物出现50死亡时累计的染毒总剂量，按上述算式计算蓄积系数。,剂量定期递增染毒法,取一组受试动物，每天染毒一次，以4天为一期，开始的第一期每天染毒的剂量为1/10 LD,50(1),，随后染毒的剂量每隔4天按15倍递增一次，计算得定期给予的剂量数(表3-9)。,在实验过程中，逐日记录动物的死亡情况，若连续染毒已达20天，此时每天的染毒剂量达0.5 LD,50,，累计总剂量达5.30 LD,50,，如果受试动物死亡未达50%，则表示该受试物的蓄积作用不明显，试验可终止。如果受试动物出现死亡达50%时，此时的累计染毒总剂量就是所求的蓄积系数。,2.20天蓄积试验法,按LD,50,的1/20、1/10、1/5、1/2及对照随机分成5组，每天对动物进行染毒，连续20d。各组总剂量分别为1、2、4、10 LD,50,。观察停药后7d内的死亡情况。如1/2 LD,50,组有死亡，且各剂量组呈剂量反应关系，则可认为受试物有较强的蓄积作用；若1/20 LD,50,组有死亡但以上各剂量组有剂量反应关系，则认为有中等蓄积作用；如1/20 LD,50,组无死亡，而以上各剂量组又无剂量应关系，则认为无明显的蓄积作用。,3.受试物生物半减期测定法,生物半减期(T,1/2,)是指外来化合物在体内消除到原有浓度(量)的一半所需要的时间。,生物半减期越长的物质，越不易由体内消除，其蓄积作用的可能性就越大。,因测定外来化合物在体内的生物半减期过程较为复杂，所以在实际观测中常常仅以间接测定其在血液、尿液或器官组织中原有浓度(或量)降低一半所需的时间，以代表该物质的生物半减期。,式中：Y,l,和Y,2,分别为给受试物后于t,1,和t,2,时间测得该物质的浓度或量。,根据测得的生物半减期的长短，可以判定受试物的蓄积作用。,生物半减期越长蓄积作用越大，反之则越小。,第三节 生物的分子和细胞水平检测,一、加和物测定,（一）DNA加合物的测定,化学物质经生物转化，与DNA链的特异位点结合，形成共价结合物。,作用位点：,鸟嘌呤的N-7位，O-6位；,腺嘌呤的N-1位或N-3位,测定方法：,免疫法、荧光法和,32,P-后标记法,1.免疫法,（1）基本原理,用荧光素、酶、放射性同位素等对抗体或抗原进行标记。,标记过程即保持抗原或抗体的免疫活性，又不影响标记物本身的特性（如酶活性）。,将它作为一种检测试剂，与相应的抗原或抗体作用。,通过检测标记物来观察抗原抗体反应。,（2）酶联免疫吸附法（ELISA）步骤,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附结合到固体载体表面，使抗原或抗体固相化；,抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定，经洗涤除去游离的酶结合物。,酶促反应：在反应体系中，加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色。,酶促反应,二 抗,一 抗,抗 原,（3）放射免疫分析（RIA）,radioimmuno assay,原理,以放射性同位素标记抗原（Ag），采用饱和分析法检测抗原。,将求抗体（Ab）的化学量转为求其放射性强度。,灵敏度大为提高，可测至ng至pg水平。,放射免疫测定原理示意图,2.荧光法,原理,通过某些化合物的DNA-加合物具荧光特性而进行定量。,技术,同步荧光法、低温激光法、激光-发射荧光法。,优点,不破坏DNA链，并可区分出加合物的不同立体异构体及DNA链不同位点上的加合物。,荧光抗体技术,3.,32,P-后标记法,32,P-后标记法原理,将分离出的DNA用一定的酶水解成正常的,单核苷酸,和,形成了加合物的单核苷酸,，将二者分离，再用,32,P标记的ATP将带有加合物的单核苷酸标记，然后用双相层析、放射自显影、液闪计数等方法定量。,优点,检测能力强，应用范围广，可检测任何化学物与DNA的连接，高灵敏性。,（二）蛋白加合物的测定,各种蛋白质亦可作为大分子形成化学物质加合物。,血红蛋白（Hb）可与50多种化学物质反应。,血红蛋白的生存期120d，Hb-加合物可作为中长期暴露的指标。,二、一般代谢酶的活性测定,生物受到亚致死剂量毒物的暴露时，不仅可借助于酶指标来对毒物进行生化水平上的评价，还可用来探讨毒物的作用机制。,1.乙酰胆碱酯酶(Ache)活性测定,Ache活性作为有机磷农药污染的指标,测定方法,Ellman比色法（p.113）,放射测量法等,2.ATPase活性测定,腺苷三磷酸酶（ATPase）可水解ATP，,释放出供生命活动所用的能量。,测定方法,Matsumura等的方法，用钼蓝法测定经酶水解的无机磷。,三、解毒系统酶类诱导作用的检测,混合功能氧化酶的诱导作用,直接法,直接测定MFO的各组成成分,如：细胞色素P,450,含量,代谢法,测定MFO催化反应中的底物消耗量或产物生成量,使用单一方法进行MFO的评价不够全面和可靠，在毒理学中常采用多种检测分析方法，从不同角度进行MFO作用的评定。,四、抗氧化防御系统检测,1.过氧化氢酶(CAT)活性测定,CAT能催化分解细胞代谢产生的H,2,O,2,，在调节细胞免于死亡的过程中起着重要作用。,CAT测定,测量由H,2,O,2,分解所释放出的氧，在240nm波长测定H,2,O,2,的吸光度变化、电化学测定H,2,O,2,或容量法滴定剩余的H,2,O,2,等方法。,2.谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性测定,生物学作用：,清除脂类过氧化物和H,2,O,2,测定方法,直接法：,直接测定GSH减少量，GSH在255nm处呈最大吸收，故从255nm吸光值减少量可计算GSH的消耗量。,间接法：,利用H,2,O,2,或有机过氧化物氧化GSH，同时加入NADPH及谷胱甘肽还原酶，使氧化的GSH重新转变为GSH，而NADPH转变为NADP+，测定NADP+在340nm的吸光值可确定酶活性。,第四节 致突变、致畸和致癌效应检测,一、致突变效应,(一)基本概念,狭义的突变仅指基因突变，而广义的突变包括染色体畸变和基因突变。,致突变作用:,某些物质引起生物体的遗传物质发生基因结构改变的作用。,致突变物:,具有引起生物体基因突变的物质。,致突变物作用于生殖细胞可导致2种结果：,显性致死突变、非致死性突变,(二)试验方法,1.体外基因突变试验,(1)Ames试验,Ames试验也称鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法。利用一种突变型微生物菌株与被检化学物质接触，如该化学物具有致突变性，则可使突变性微生物发生回复突变，重新成为野生型微生物。,正向突变,野生型微生物 突变型微生物（营养缺陷型微生物）,回复突变,(2)哺乳动物体细胞株突变试验,利用哺乳动物突变细胞株发生回复突变，确定受试物是否具有致突变性。,常用的细胞株：V,79,、CHO、L,5178,Y,V79和CHO特点：,缺乏利用嘌呤碱的酶HGPRT(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)。,如果在培养基中加入具有毒性的嘌呤类似物6-硫代鸟嘌呤TG或8-氮杂鸟嘌呤AG等，由于细胞缺乏利用嘌呤的酶，在这种培养基上生长良好。,对于正常细胞，由于存在HGPRT，在上述培养基上，可利用TG或AG，致使细胞得不到所需的真正嘌呤碱，以致不能生长。,如果突变型细胞接触了致突变物，即可发生回复突变成为正常细胞，此时又具有了利用嘌呤碱的酶，因此像正常细胞一样具有利用毒性的嘌呤碱类似物，以致中毒细胞不能在培养基上生长。借此可能确定突变细胞株是否发生了回复突变，可确定受试物是否具有致突变性。,2.染色体畸变试验,利用光学显微镜直接观察生物体细胞在受到致突变物作用后，染色体发生数目和结构改变的情况。,检测细胞,CHO细胞,外周血淋巴细胞,细胞周期,核小体和染色质,染 色 体,有丝分裂,人的体细胞染色体,试验方法,将CHO细胞或人类外周血淋巴细胞于37度培养24或72h，同时加入受试物。收获细胞前2h，加入秋水仙碱，使大量分裂细胞同步于分裂中期。经离心得到细胞沉淀，经固定、制片和染色，镜检有无染色体畸变。观察计数各种类型畸变，如断裂、缺失、易位及多处断裂等。,3.细胞遗传学试验微核试验,微核:,是染色单体或染色体的无着丝点断片或因纺锤体受伤而失去的整个染色体，在分裂后期，仍留在细胞质中，或因核膜受损后，核物质向外突出延伸形成的一个或几个有规则的圆形或椭圆形小体，其嗜染性与细胞核相似，比主核小，故称微核。,一切发生分裂的细胞，在染色体断裂剂作用下，均能产生微核，因此可用微核率的变化来检测诱变物。,4.体内基因突变试验,(1)显性致死突变试验,（Dominant Lethal Mutation Test）,检测外来化合物对动物生殖细胞染色体的致突变作用。,系统观察胎鼠的成活情况,因为哺乳动物生殖细胞染色体发生突变时（染色体断裂或重组），往往不能与异性生殖细胞结合，或使受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。,(2)果蝇伴性隐性致死试验,遗传学原理,致突变物可能在雄性果蝇配子X染色体上诱导隐性致死突变。,将经处理的雄蝇与未处理的雌蝇交配，F1代雌蝇带有来自父本的具致死突变的X染色体。由于致死突变为隐性，所以F1蝇仍能够正常生长、发育和生殖。,将F1雌蝇与子一代雄蝇交配，则将有半数雄合子是含有经受试物处理的雄蝇的X染色体，此时X染色体上隐性致死基因得以表现，引起此雄蝇死亡。,(3)姐妹染色单体交换试验,（Sister Chromatide Exchange Test，SCE）,SCE可能与DNA的断裂和重联相关。,很多化学致突变物或致癌物可以大幅度地 增加SCE频率。,实验方法,以5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）代替胸腺嘧啶核苷，DNA复制后，用荧光染料染色，可观察到SCE。,5.染色体损伤试验 DNA修复合成试验,（Unscheduled DNA Synthesis，UDS）,细胞对其损伤DNA具有修复能力。,细胞与化学物质接触后，若能诱导DNA修复合成，即可据此推断该化学物质具有损伤DNA的潜力。,实验方法,用羟基脲抑制细胞周期中S期的DNA半保留复制，用标记的脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法测定非S期DNA合成的3H-TdR 量。,二、致畸效应,1.基本概念,致畸作用（Teratogenesis）,胚胎在发育过程中，由于受到某种因素的影 响，使胚胎的细胞分化和器官形成不能正常 进行，而造成器官组织上的缺陷，并出现肉 眼可见的形态结构异常者成为畸形。,凡能引起胚胎发育障碍而导致胎儿发生畸形 的物质称为致畸物或致畸原（Teratogen）。,1000多种环境因素可引起动物和人的畸胎。,致畸作用的毒理学特点,胚胎与致畸物接触时，可因胚胎所处 的发育阶段不同而呈现不同的敏感性。,如器官形成期。,不同种属在致畸作用中呈现不同的敏 感性。,化学致畸作用机理,突变引起胚胎发育异常。,对细胞的生长分化较为重要的酶类受到 抑制。,母体正常代谢过程被破坏。,细胞分裂过程的障碍：引起生殖细胞减 数分裂中的不分离或细胞有丝分裂过程 的障碍等，均可使某些细胞死亡。,2.试验方法,动物选择,动物对受试物的代谢过程应基 本上与人类相似（大鼠、小鼠和家兔）。,剂量分组,采用鼠类为实验动物，每组不 少于15-20只，一般剂量为LD50的1/3-1/2 为高剂量组，LD,50,的1/30-1/100为低剂量组。,受试动物处理：受孕，灌胃方法染毒,受试动物解剖：胎仔外部检查、骨骼检查 内脏检查等。,三、致癌效应,1.基本概念,化学致癌作用,化学物质引起肿瘤的过程,化学致癌物,能诱发肿瘤的化学物质,细胞癌变学说,（1）体细胞突变学说,认为致癌因素包括化学、物理、生物因素等，作用于体细胞的遗传物质DNA，使其发生了突变，其结果使细胞的功能发生异常改变而致癌，即癌变形成的基础是体细胞发生了突变。,（2）分化障碍学说,认为细胞癌变不一定需要体细胞遗传物质发生突变，而只是分化过程中有关基因调控过程受到致癌因素的干扰，使细胞分化和增殖发生紊乱而出现癌变。,（3）癌基因学说,认为所有细胞DNA分子中都存在有癌基因的遗传信息，正常情况下它们处于阻遏状态，只有细胞内有关的调节机制遭到破坏后，癌基因才能表达，从而导致细胞发生癌变，形成肿瘤。,癌变过程及其机理癌的形成3阶段,引发阶段,通过致癌物的作用，使正常细胞转化为癌细胞的过程。,促长阶段,经过引发的癌细胞不断增殖直至形成一个临床上可被检出之肿块的过程。,浸润和转移阶段,已形成的肿块不断发展，逐渐侵害周围的正常组织，并扩散到较远的部位。,2.试验方法,致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌作用或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验方法。,方法,短期筛选方法,长期动物诱癌试验,（1）短期筛选方法,利用哺乳动物细胞体外转化，观察培养细胞与各种化学或物理致癌剂接触后发生一系列表型改变，在通过增殖，这些表型变异的细胞形成与正常细胞不同的集落，即转化集落。通过转化集落的存在和转化集落形成率以及转化细胞接种裸鼠中发生肿瘤来评价化学物的致癌活性。,（2）长期动物诱癌试验,试验动物及饲料要求,选用抗病力强、容易饲养、肿瘤自发率 低、对受试物敏感的动物。,剂量分组及染毒途径和期限,设对照组、最大耐受剂量组和2个中间剂 量组。,观察指标,一般检查、肿瘤发生、病理学检查、潜 伏期、平均肿瘤数等,结果判断,第五节 微宇宙法,一、微宇宙法简介,微宇宙(Microcosm)法是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又被称为模型生态系统法(Model Ecosystem)。,微宇宙法的特点,（1）微宇宙是自然生态系统的一部分，包含有生物和非生物的组成及其过程，能提供自然生态系统的群落结构和功能。,（2）不完全等同于自然生态系统，没有自然生态系统庞大和复杂，不能包含自然生态系统的所有组成，例如大树，大的食草动物、食肉动物和鸟类，也不能包括自然生态系统的所有过程，例如岩石的风化作用、土壤的侵蚀过程等。,微宇宙应用于污染生态系统,研究污染物对生物和非生物组成的影响；,污染物在生物和非生物组成中的分布；研究污染物对生物生物和生物非生物之间相互关系的作用；,研究生物和非生物组成及其过程对污染物的生物效应的影响等。,研究对象包括：有毒化学污染物(如杀虫剂、重金属)、营养元素(如氮、磷)等。,微宇宙法的类型,自然微宇宙,直接来自自然生态系统的一部分,是自然生态系统的断面。例如土壤核心区，河流和湖泊底部土壤等。,人工微宇宙,是根据所研究的生态系统的特征在实验室组建的人工生态系统，可根据生态系统的组成进行取舍，系统可以从简单到复杂，既可是开放式，也可以是封闭式的系统。不仅可以在实验室组建，也可以在野外组建。,根据生态系统的类别分类,水生微宇宙和陆生微宇宙,烧杯水生微宇宙、河流微宇宙和池塘微宇宙等。,二、标准化水生微宇宙,标准化水生微宇宙(,SAM,)可用于在实验室测定有毒物质在多物种水平时对淡水生态系统的影响。,试验时间为64d,试验设计的条件列于表314,三、烧杯水生微宇宙,烧杯水生微宇宙又称混合烧杯培养(Mixed Flask Culture，MFC)，是、种较小的淡水水生微宇宙，体积大约为1L。经过6周的建立稳定期后，进行12-14 周的试验期。与标准化的水生微宇宙(SAM)相比，烧杯水生微宇宙通过加入来自生态系统浸出液提供给微宇宙中生物群落所必需的基质。,四、室外水生微宇宙,标准化微宇宙和烧杯水生微宇宙仅仅是建立在实验室的小型微宇宙，其生物群落中没有包括大型的捕食者如鱼类。,80年代末和90年代初建立了比标准化微宇宙和烧杯水生微宇宙更大的一种室外微宇宙系统，称之为室外水生微宇宙，又被称之为中宇宙(Mesocosm)。,由于该宇宙系统最初建立是为农药登记制度服务，评价农药对非靶生物的影响，因此又被称为Fifra微宇宙。,五、土壤微宇宙,土壤微宇宙是用于研究外源性化合物对农业生态系统及其生长的植物、土壤无脊椎动物和微生物影响的一种陆生微宇宙。,基本实验设计条件列入表317,土壤微宇宙是采自野外环境的土壤，将其设置在环境条件控制的实验室中。,土壤微宇宙用于研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。,六、模拟农田生态系统,这类生态系统是模拟农田条件，而没有陆生动物。,应用最广泛的是纳什(NaSh)等发展的农业生态系统，它是为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计的。,系统由容积为0.75 m,3,的矩形玻璃室组成，内装厚为15 cm以上的土壤层。设有收集土壤沥滤液和地表水的小孔、水管口和空气出口，以及一些用喷水装置和测试探讨的小孔。,系统的主要特点,通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药,系统用于测量下列变化,（1）测定农药从植株上或土壤中的挥发性；,（2）模拟降雨对农药迁移的影响,（3）农药在土壤中的残留,（4）农药被植株摄入和在植物体内的滞留,该系统缺少预定空气流速、温度和湿度的功能，况且代谢产物也没有空气中回收。,