基因诊断专业知识讲座.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,#,基因诊断专业知识讲座,基因诊断专业知识讲座,第1页,概述,几乎全部疾病均在一定程度上与基因有某种联络，基因改变，或是疾病发生原因，或是疾病发生结果，或是疾病发生时伴随现象，而这些现象出现是有规律。所以，能够经过检测基因改变来反应疾病发生和发展，疗效和预后,基因诊疗：是以,DNA,或,RNA,为诊疗材料，经过检验基因存在、缺点或表示异常，对人体状态和疾病作出诊疗方法和过程。,基因诊断专业知识讲座,第2页,基因诊疗经历了三个基础发展阶段,第一阶段：世纪年代，以,DNA,分子杂交为基础，经过限制性片段长度多态性性（,RFLP),分析进行,第二阶段：应用,PCR,技术,第三阶段：应用基因芯片技术,基因诊断专业知识讲座,第3页,第一节 基因诊疗基础技术,一,.,基因诊疗中常见几个技术,（一）核酸杂交,（二）,PCR,（,三）,DNA,序列测定,（四）,DNA,芯片技术,基因诊断专业知识讲座,第4页,(,一,),核酸分子杂交技术,(1),方法,:,以已知次序核酸片段作为探针,经放射性或非放射性物质标识后,再与未知目标核酸片段进行杂交反应,分离已杂交和未杂交标识核酸链,经过标识信号检测就能够对未知目标核酸链进行定性、定量分析,.,(,2),几个不一样形式核酸分子杂交,a.Southern,印迹,(southern blot),杂交,:,用于,DNA,检测，可用于基因限制性内切酶谱分析，基因突变分析等,b.Northern,印迹,(Northern blot),杂交,:,用于,RNA,检测，能对组织细胞中总,RNA,或,mRNA,进行定性和定量分析,c.,斑点杂交（,dot blot):,既能够检测,DNA,也能够检测,RNA,用于特定基因及其表示定性和定量分析方法简单、灵敏；但特异性低,基因诊断专业知识讲座,第5页,原位杂交（,in situ hybridization):,是细胞学技术与核酸杂交技术结合一个核酸分析检测技术可分为,DNA,原位杂交和,RNA,原位杂交,用于检测染色体中特定基因位置，用于染色体疾病诊疗,分类,:,玻片原位杂交,:,如中期染色体和组,织切片,.,膜上原位杂交,:,将菌落或噬菌斑影印在尼,龙膜,(,如硝酸纤维膜,),基因诊断专业知识讲座,第6页,原位杂交镜像图,基因诊断专业知识讲座,第7页,(,二,)PCR,技术在基因诊疗中应用,（）等位基因特异性寡聚核苷酸（,allele specific oligonnucleotide,ASO),探针斑点杂交：,PCR-ASO,该方法是,诊疗已知点突变：,需分别合成野生型和突变型探针在基因诊疗时，只需用,PCR,扩增受检者目标,DNA,片段，再分别与上述探针杂交杂交结果有以下几个情况：,PCR,扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交-不,存在这种突变；,只与突变探针杂交-突变基因为纯合子；,与正常探针和突变探针都可杂交-突变基因为杂合子；,与正常探针和突变探针都不能杂交-突变基因不属于已发,现类型,基因诊断专业知识讲座,第8页,（）单链构象多态性（,single strand,conformation ploymorphism,SSCP),分析,是一个基于单链,DNA,构象差异来检测点突变方 法,DNA,变性形成单链，在中性条件下长度相同单 链指,DNA,假如碱基组成和,(,或,),排列次序不一样,形成 构象就不一样,这么就形成了单链构象多态性,.,这些分子在非变性,PAGE,中电泳中表现出不一样迁移率,.,SSCP,尤其适于分析小于400,bp,PCR,产物。据认为,SSCP,能够区分1,bp,差异,PCR-SSCP,分析不能确定基因变异内容，所以电泳后结果有差异后还需进行测序分析，确定变异性质,基因诊断专业知识讲座,第9页,(3),限制性片段长度多态性（,restriction fragment length polymorphisms,RFLP）,分析,基因突变造成基因碱基组成或,(,和,),次序发生改变,会在基因结构中产生新限制性内切酶位点或使原有位点消失,.,用限制酶对不一样个体基因组进行消化时，其电泳条带数目和大小就会产生改变，依据这些改变能够判断出突变是否存在,.,基因诊断专业知识讲座,第10页,限制性片段长度多态性,RFLPs(restriction fragment length polymorphisms),样品一,样品二,1987,年,H.Donis-Keller,等人以,RFLP,为遗传标识绘制了第一张人类遗传图谱,基因诊断专业知识讲座,第11页,(4)PCR+,变性梯度凝胶电泳分析技术,双链,DNA,在一定浓度变性剂,(,尿素,甲酰胺,),作用下,会变性而解链,造成,DNA,分子电泳迁移率改变,.,当在不一样梯度浓度变性胶中电泳时,DNA,泳动到变性剂浓度能使,DNA,发生变性，,DNA,开始解链，从而不一样,DNA,片段会形成不一样迁移率条带,优点,：可靠，检出单碱基突变率可达,缺点,：富含高熔点,GC,区时，则难以检测出突,变,基因诊断专业知识讲座,第12页,（）用甲基化特异性,PCR,（,methylation-specific PCR),进行分析,在,PCR,扩增前，先用化学试剂（,NaHSO3),处理模板,DNA,将全部未甲基化胞嘧啶（,C),转变成尿嘧啶,(U),，在,PCR,扩增时，,U,与引物中,A,配对；而,CpG,岛上甲基化,C,不受影响，在扩增时仍与,G,配对,基于这种差异能够进行甲基化特异性,PCR,设计一对,甲基化特异性引物（引物中,G,结合模板中,C);,和非甲基化特异性引物（引物中,A,结合模板中,U),经过,PCR,扩增就可检测出甲基化等位基因化学修饰,DNA,序列和非甲基化等位基因序列,用于一些疾病和肿瘤基因诊疗,基因诊断专业知识讲座,第13页,(6),采取,PCR,技术对靶核酸进行定量分析,定量,PCR(quantiative PCR,Q-PCR):,就是对靶核酸分子进行定量分析技术,.,依据,PCR,扩增指数增加期原理，理论上扩增产物累积分子数,N=No(1+E),其中,E,是指每次循环中参加复制模板数与总模板数比率,.,经过,N,值可求出,No.,但,PCR,扩增时平台期,(15-25),出现会影响测量准确度,.,定量,PCR,策略和方法较多,.,n,基因诊断专业知识讲座,第14页,a.,经过测定,PCR,产物量,方法,:,对已知量靶,DNA,进行系列稀释,比较待测样品和已知系列稀释样品,PCR,产量,还可对未知量靶,DNA,进行绝对定量,.,b.,采取极限稀释法对靶核酸进行定量分析,:,方法,:,将待测,DNA,标本进行倍数稀释,直至扩增不到靶基因稀释度,用稀释程度表示启始靶基因分子数相对量,是一个半定量方法,.,基因诊断专业知识讲座,第15页,c.,采取非竞争性对照法对靶核酸进行定量分析,方法,:,该方法是在一个试管内同时扩增来自同一,DNA,一段靶序列和另一段内标序列,用内标序列控制,DNA,用量、可扩增性和管间扩增效率改变,经过比较两段序列,PCR,扩增产物电泳带荧光强度,对靶序列进行定量分析,d.,采取竞争抑制法对靶核酸进行定量分析,:,方法,:,参考标准不是同一核酸分子上另一段序列,通常是人工模板,与待测序列含有相同引物结合位点,能与待测序列竞争聚合酶,底物,引物分子,.,方法,:,将竞争模板作系列稀释后加入恒量样品,DNA,进行,PCR,扩增,经过分离和分析竞争模板和样品,DNA,PCR,产量,对样品,DNA,进行定量分析,基因诊断专业知识讲座,第16页,e.,荧光定量,PCR(FQ-PCR),技术,是一个当前我国外应用较为广泛定量,PCR,技术,是经过始点定量和荧光检测系统实时监测累计荧光强度而实现,含有灵敏度高,特异性强等优点,.,FQ-PCR,技术两种定量形式,:,绝对定量,:,普通采取外标准品定量制备来实现绝对定量,.,如合成目标基因,;,将,PCR,产物直接梯度稀释,;,或将,PCR,产物克隆到载体上,抽取质粒,经过测量浓度和拷贝数可准确定量,.,优点,:,稳定,准确,.,.,相对定量,:,指在测定目标基因同时测定一内源性管家基因,(,如,-actin,rRNA,等,),该管家基因主要是用于核苷酸拷贝数比较,反应反应体系内是否存在,PCR,扩增影响原因,.,基因诊断专业知识讲座,第17页,(,三）,DNA,序列测序,1977年,Sanger,创建链终止反应序列测序法,用放射性同位素标识引物，用,双脱氧核苷酸,随机终止,DNA,链延伸，产生长度不一样,DNA,片段，再用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离这些片段，放射自显影读出结果。,自动测序法,采取四色荧光标识代替了放射性同位素标识。,DNA,测序测定是基因突变检测最直接，最准确方法，它不但可确定突变部位，还可确定突变性质,基因诊断专业知识讲座,第18页,（四）,DNA,芯片技术,DNA,芯片（,DNA chip),又称为基因芯片，,DNA,微阵列（,DNA microarray),该技术基础依然是利用核酸分子杂交原理：首先将一系列预先设计好核酸探针（,oligos or cDNA),有序地，高密度地排列在玻璃，硅片或尼龙膜等固体支持物上，制成,DNA,微阵列。,用荧光标识待测样品,（,DNA,cDNA,RNA),与位于芯片上核酸探针杂交后，经过激光共聚焦荧光扫描系统检测杂交信号强度，再用特定软件对荧光信号进行综合分析，就能取得待测样品大量基因序列信息或表示信息。,基因芯片按照用途分为：表示芯片，诊疗芯片，指纹图谱芯片，测序芯片，毒理芯片等。,该技术可用于新基因判定，突变检测，表示监控和遗传制图等。,基因诊断专业知识讲座,第19页,第二节 对不一样疾病需要采取不一样基因诊疗策略,一.经过致病基因检测诊疗疾病,已经基础清楚基因突变与疾病发生之间分子机制，相关基因已被克隆，测序，并被定位在染色体上。,如：一些与疾病相关内源基因-癌基因，抑癌基因和血红蛋白基因突变型。,诊疗方法：依据突变基因序列设计探针,.,基因诊断专业知识讲座,第20页,二,.,经过连锁遗传标志检测诊疗疾病,许多基因病，即使它们基因结构还没有说明，但经过染色体分析已被定位在染色体特定位置上，这些基因是经过检测与特定染色体位点连锁遗传标识来发觉。,原理：同一染色体上位置十分靠近相邻基因或其它遗传标识，在遗传过程中分离几率很低，经常一起遗传，形成连锁。能够经过一个或几个基因或遗传标识分析，了解另一个或几个基因。,基因诊断专业知识讲座,第21页,三.经过与疾病相关克隆建立疾病基因诊疗指标,40-60,年代,:,功效克隆,即基于显著可见或直接与生化功效相关线索确定与疾病相关基因,:,如苯丙酮尿症与镰刀型贫血病等,.,70-80,年代,:,定位克隆,即基于疾病,-,染色体,-,基因反向遗传学策略对没有显著表型或生化功效异常疾病,.,90-,今,:,表型克隆,不考虑基因在染色体上位置信息,而是直接在疾病与正常样本之间寻找分子水平上差异,.,基因诊断专业知识讲座,第22页,利用表型克隆诊疗疾病,表型克隆：对疾病相关一组基因进行克隆,一些多基因，多原因疾病，如：肥胖，哮喘，高血压，冠心病，肿瘤，精神病，自体免疫性疾病等，因为疾病发生原因复杂，不但包括多基因互作，还包括基因与环境互作。不可能经过前面方法来诊疗，必须利用差异显示等技术找出正常人和疾病患者之间差异序列，判定与疾病相关多个基因，确定造成疾病分子缺点。,方法：依据克隆到一组基因制作对应一组探针，用这组探针检测一组与疾病相关基因来诊疗多基因病,基因诊断专业知识讲座,第23页,第三节 遗传病基因诊疗,一,.,遗传病基因诊疗策略,1.,直接策略：采取基因突变诊疗方法，直,接检测致病基因。该策略前提是基因已被克隆,.,2.间接策略：即经过检测与致病基因连锁,遗传标识,进行基因诊疗,.,基因诊断专业知识讲座,第24页,人类基因组上,DNA,遗传标识,限制性片段长度多态性,(,RFLPs,),1985,短串联重复序列,(short tendem repeats,STRs,mini-satellites),1990s,单核苷酸多态性,(single-nucleotide polymor-phisms,SNPs,),基因诊断专业知识讲座,第25页,短串联重复序列,STRs,(short tendem repeats,Microsatellites),STR,广泛存在于人基因组，占约,5%,，,基础单位是,1bp-8bp,串联重复，,重复次数,n=15-60,，已知,8000,多个，,主要形式为：,(CA),n,，,(GA),n,，,(AA),n,，,(GG),n,，,(CAA),n,，,(CGG),n,，,其中以,(CA),n,，,(GT),n,为多见。,1992,年，,Welssenbanch,等以,STR,为标识第二代连锁图取代了,RFLP,连锁图,。,基因诊断专业知识讲座,第26页,定义,:,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸变异所引发,DNA,序列多态性。,与,RFLP,与,STR,不一样,它是直接以序列变异作为标识,而不是以片段长度差异作为标识,.,人类基因组图谱初步分析表明，共有,3,万至,3.5,万个基因。有,300,多万个单核苷酸多态性,SNP,在人类基因组中广泛存在，平均每,500,1000,个碱基对中就有,1,个，,3-4,个相邻标识组成单倍型（,haplotype,）就可有,8-16,种。,1996,年，,Lander,报道了用单核苷酸多态性,标识制备第三代遗传连锁图遗传标识。,单核苷酸多态性,（,single nucleotid polymorphism,，,SNP,）,基因诊断专业知识讲座,第27页,SNP,用作遗传标识含有以下优点：,SNP,在人群中是二等位基因性，在任何人群中其等位基因频率都可预计出来。,它在基因组中分布较微卫星标识广泛得多。,与串联重复微卫星位点,(STR),相比，,SNP,是高度稳定,.,尤其是处于编码区,SNP(cSNP),而前者高突变率轻易引发对人群遗传分析出现困难。,个别位于基因内部,SNP,可能会直接影响产物蛋白质结构或基因表示水平，所以，它们本身可能就是疾病遗传机制候选改变位点。,易于进行自动化分析，缩短了研究时间,.,基因诊断专业知识讲座,第28页,一.血红蛋白病基因诊疗,分为异常血红蛋白病和地中海贫血,前者是因为珠蛋白基因突变；后者是因为珠蛋白合成速率降低，,a,链和,b,链合成不平衡。,（一）异常血红蛋白病基因诊疗：,如镰状红细胞贫血病,:,链第六位氨基酸,:GAA(,谷,)GUA(,颉,),代替,.,对该病基因诊疗应采取,:,1)PCR+,限制酶切,即用,PCR,从患者基因组扩增含突变位点珠蛋白基因片段,再选适当内切酶消化,PCR,产物,依据电泳图谱上片段数量和大小做出判断,2)Southern,印迹杂交分析,基因诊断专业知识讲座,第29页,血红蛋白病基因诊疗2,（二）,地贫基因诊疗：,1,.,定性分析：,PCR,法直接扩增,1,和,2,基因3端有差异，针对此可设计,引物进行,PCR，,如有缺失，则不能扩,增出产物,2,.,定量分析,:,地贫共同特点是,珠蛋白,mRNA,量降低，所以可用,RT-PCR,定量分析,mRNA,量以助诊疗,基因诊断专业知识讲座,第30页,（三）,-,地贫基因诊疗,1,.DN,检测与分析：,PCR+ASO,探针法,为主要方法 依据,-,珠蛋,白主要突变位点，设计2对引物，扩增可能发生,突变,2,个片段,再分别与对应野生型探针和突,变探针进行斑点杂交。,PCR+RFLP,连锁分析法,检测与,-,珠蛋白基因连,锁遗传标识进行基因诊疗,如,-,珠蛋白,5,端,有一限制内切酶,HgiAI,多态性位点,在中国人,群频率为,0.5,DNA,芯片技术,2,.RNA,检测与分析：,RT-PCR,定量分析,mRNA,量以助诊,断,基因诊断专业知识讲座,第31页,二,.,杜氏肌营养不良症,(Duchenne muscular dystrophy,DMD),DMD：,是性连锁隐性遗传病,是由,抗肌萎缩蛋白,(dystrophin),基因突变,(,突变或缺失,).,其突出特点为横纹肌进行性萎缩，引发无力和挛缩。,DMD,相对更为常见。,DMD,患儿在5岁前发病，20岁左右因为心力衰竭和呼吸衰竭而死亡，发病率在男性活婴中约1/3500。,基因诊断专业知识讲座,第32页,杜氏肌营养不良症基因诊疗,RFLP,连锁分析,:,经过家系连锁分析,找出与突变基因相连锁,DNA,多态性,并将其作为遗传标识追踪多态性在家族组员中传递,.,基因组,DNA,探针法,:,用突变高发区常见序列作为探针,检测抗肌萎缩蛋白基因对应变异,.,cDNA,探针法,:,用较短抗肌萎缩蛋白基因,cDNA,作为探针,.,比,2,方便、检出率高,.,多重,PCR,法,:,对基因突变较集中区域,设计多对引物,扩增基因对应突变高发区,检测对应基因突变,.,基因诊断专业知识讲座,第33页,第四节 用基因诊疗技术检测肿瘤,肿瘤发生包括多个基因,、各种原因、发生过程呈多阶段性、发生分子机制十分复杂,所以对不一样肿瘤要采取不一样基因诊疗策略,.,一,.,经过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊疗肿瘤,淋巴造血系统肿瘤,:,染色体易位及基因融合,是较普遍现象,.,如,:,淋巴瘤和淋巴结反应性,增生,.,它是因为,T,细胞受体,(TCR),基因和,IgH,基,因重排,使原来相隔数百个碱基,IgH,和,TCR,基因,V,区和,J,区靠近在一起,.,用,PCR,扩增该区,域片段,经过长度分析就能判断是否发生了,基因重排,.,基因诊断专业知识讲座,第34页,二,.,经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤,癌基因激活及抑癌基因失活与肿瘤发生亲密相关,.,大多人类肿瘤组织或细胞中都能检测到癌基因和,(,或,),抑癌基因突变,1.,癌基因,-ras,与肿瘤,:,ras,是肿瘤中最常被激活癌基因,.,激活分子机制主要是点突变,高发区是第,12,、,13,和,61,位密码子,.,如,90%,胰腺癌,50%,结直肠癌和,1/3,肺腺癌都在是,K-ras,基因第,12,位密码子突变,.,ras,癌基因点突变检测方法,:,a.PCR-ASO,法,:,检测速度快，灵敏度高，检测样品量大等优点；,但点突变检出仅限于寡核苷酸探针探测位点和突变类,型。,b.PCR-SSCP,法：,依据,PCR,扩增目标,DNA,片段在非变性凝胶电泳中迁移率，将突变基因检测出来。该法检测点突变更方便；,缺点：不能检测出突变详细位点和详细类型。,基因诊断专业知识讲座,第35页,经过检测癌基因和抑癌基因诊疗肿瘤（续）,2.,P53,基因与肿瘤,：,p53,基因是最常被失活抑癌基,因，失活分子机制主要是基因突变，也有因为基,因表示异常而使,p53,失活，约50%以上恶性肿瘤有,p53,基因突变。,突变类型：130290密码子间常发生点突变，也有少许插入或缺失突变。,基因检测方法：,PCR-SSCP:,可检出有没有突变,PCR-RFLP:,经过内切酶位点消,失或增加检测,p53,基因突变。,基因诊断专业知识讲座,第36页,三.经过检测肿瘤相关病毒诊疗肿瘤,已经发觉各种病毒与肿瘤发生相关，它们有,DNA,病毒，也有,RNA,病毒,其中逆转录病毒,(retro-virus),对动物细胞致瘤作用已得到公认,.,还发觉一些与人肿瘤发生相关病毒如,:,Burkitt,淋巴瘤,人类乳头瘤病毒,(HPV),宫颈癌,经过检测这些病毒基因就能够帮助诊疗对应肿瘤,.,EB,病毒,基因诊断专业知识讲座,第37页,四.经过检测肿瘤标识物基因或,mRNA,诊疗肿瘤,肿瘤标志物,（,tumor marker),是由肿瘤组织细胞产生，与肿瘤形成和发展相关物质，包含：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。仅存在肿瘤细胞中。,类型,：,基因标志,：是指基因本身突变和异常表示，能反应癌前开启阶段改变。,基因表型标志,：基因产物表示和调控异常，表现为所编码表示产物合成紊乱，产生胚胎性抗原，普通出现较晚。,基因诊疗方法,：,基因变异造成肿瘤标识物产生或含量改变，可选择：,PCR-RFLP,PCR-ASO,PCR-,测序，,PCR-SSCP,等技术。造成肿瘤标识物产生或含量改变分子机制不清楚，可用,RT-PCR,技术检测肿瘤标识物,mRNA,存在或含量改变。如：端粒活性酶活性被用来作为肿瘤标识物，在肿瘤细胞中该酶活性增高。,基因诊断专业知识讲座,第38页,第五节 感染性疾病基因诊疗,每种病原体都有各自特异遗传物质,能够是,DNA,也能够是,RNA.,每种病原生物都有各自种属特异基因,.,一,.,病毒感染性疾病诊疗,a.,乙型肝炎病毒,:,当前采取免疫法检测血清中病毒抗原,.,HBV,基因组包含,4,个开放阅读框,S,、,C,、,P,和,X,区,C,区变异性小,是基因诊疗采取目标部位,.,在用,PCR,检测时可扩增,HBV,特异核苷酸序列,经过,PCR,产物直接电泳分析,、或内切酶谱分析、或点杂交、或,Southern,印迹等结果作出判断,.,也可采取基因芯片技术,.,基因诊断专业知识讲座,第39页,b.,传染性非经典肺炎,(SARS):,是由新型变异冠状病毒,(SARS-CoV),感染引发,.SARS-CoV,基因组为正链单股,RNA,有,11,个开放阅读框,基因组特异保守序列为编码,RNA,聚合酶序列,.,基因诊疗方法,:,采取,RT-PCR,技术扩增保守序列,DNA,芯片,二,.,诊疗细菌感染性疾病,用,PCR,技术经过对致病细菌所含质粒特异序列,设计引物,检测引发疾病细菌类型,.,基因诊断专业知识讲座,第40页,第五节 基因诊疗存在问题与发展前景,一,.,基因诊疗技术应用存在问题,1.,理论问题,当前找到致病基因不多,由多基因及基因,与环境互作所引发各种疾病分子机制还不,清楚,2.,技术问题,设备条件,;,操做人员,;,污染造成假阳性,.,3.,伦理问题,二,.,发展前景,基因诊断专业知识讲座,第41页,