氟尿嘧啶联合低剂量雷公藤内酯对胃癌细胞增殖和迁移及侵袭的影响及机制研究.pdf

论著【引用本文】杜艳明崔丽伟檀靖宇等.氟尿嘧啶联合低剂量雷公藤内酯对胃癌细胞增殖和迁移及侵袭的影响及机制研究.中国医药():.:./.氟尿嘧啶联合低剂量雷公藤内酯对胃癌细胞增殖和迁移及侵袭的影响及机制研究杜艳明 崔丽伟 檀靖宇 马召雨 马丽丽河北省唐山市人民医院消化科唐山 通信作者:马丽丽:.【摘要】目的 探讨氟尿嘧啶联合雷公藤内酯是否可协同抑制胃癌细胞增殖和迁移及侵袭并进一步分析可能的作用机制 方法 将体外培养的胃癌 细胞依据添加药物的不同分为对照组(不加药处理)、氟尿嘧啶组(加 /的氟尿嘧啶)、雷公藤内酯组(加 /的雷公藤内酯)、联合组(加/的氟尿嘧啶和 /的雷公藤内酯)观察噻唑蓝实验检测氟尿嘧啶(、和 /)、雷公藤内酯(、和 /)对胃癌 细胞增殖的抑制作用并计算细胞生存率和联合作用指数 采用细胞划痕实验、实验、凋亡实验和蛋白质印迹法分别检测氟尿嘧啶、雷公藤内酯单独或联合对 细胞迁移率、细胞侵袭率、细胞凋亡率、磷酸酶 的癌性抑制因子()、蛋白磷酸酶()、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶标复合物()、哺乳动物雷帕霉素靶标复合物()蛋白表达的影响 结果 氟尿嘧啶和雷公藤内酯均呈剂量依赖性抑制 细胞增殖半数抑制浓度分别为 /、/二者不同浓度联用联合作用指数值均小于 联合组细胞迁移率、细胞侵袭率低于氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组()比()、()()比()、()差异均有统计学意义(均 )联合组细胞凋亡率高于氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组(均 )联合组细胞、蛋白相对表达水平低于对照组、氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组差异均有统计学意义(均 )结论氟尿嘧啶联合雷公藤内酯可协同抑制 细胞增殖、迁移和侵袭可能与抑制/信号通路传导有关【关键词】胃癌 氟尿嘧啶 雷公藤内酯 增殖 迁移 侵袭【基金项目】河北省医学科学研究课题计划()【】./.【中图分类号】.【文献标识码】:.【】.()(/)(/)(/).(/)(/).()()()()./.()()()()()()().中国医药 年 月第 卷第 期 .().()./.【】【】()胃癌是引起癌症相关死亡的常见原因在中国胃癌的发病率和患病率均呈不同程度的增长趋势 铂类和蒽环类化合物为广泛应用多年的抗癌药物表柔比星、顺铂和氟尿嘧啶的联合用药是目前胃癌的标准化疗方案之一 然而化疗药物的耐药性及严重的不良反应限制了其临床应用其中氟尿嘧啶的耐药较为常见 雷公藤内酯是一种二萜三环氧化物已被发现具有有效的免疫抑制和抗炎特性 研究显示雷公藤内酯在体外可抑制多种类型癌细胞的增殖并抑制体内肿瘤的生长和转移 体内研究结果表明雷公藤内酯可明显降低裸鼠乳腺癌肿块的质量和体积 雷公藤内酯不仅可以在体外和体内直接抑制肿瘤生长而且还可以作为辅助剂有效增强化疗或其他细胞毒性药物的抗肿瘤作用据报道雷公藤内酯和其他抗癌药物联用对肿瘤细胞生长的抑制作用优于这些药物单独使用本研究经河北省唐山市人民医院伦理委员会批准()旨在探讨氟尿嘧啶联合雷公藤内酯在胃癌中的抗肿瘤活性并分析可能的作用机制 材料与方法.细胞与仪器 胃癌 细胞(中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)酶标仪(山东博科仪器公司)流式细胞仪(美国 公司)噻唑蓝粉末、结晶紫粉末(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)小室(美国康宁有限公司)细胞凋亡检测试剂盒、二喹啉甲酸蛋白定量试剂盒(江苏碧云天技术有限公司)抗磷酸酶 的癌性抑制因子()、抗蛋白磷酸酶()、抗磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶标复合物()、抗哺乳动物雷帕霉素靶标复合物()、抗 肌动蛋白抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗(美国 公司).方法.细胞培养 胃癌 细胞培养于含有胎牛血清的 培养基中放置于含有二氧化碳、恒温箱中孵育当细胞密度占培养皿的 左右时用 胰蛋白酶消化细胞按照 的比例进行传代处理.噻唑蓝检测细胞增殖活力收集对数生长期的 细胞按照 /孔的密度接种至 孔板中放置恒温箱中孵育 之后加入氟尿嘧啶使其终浓度为、/同时设置对照组(含有二甲基亚砜)和空白对照组(仅含有培养基不含细胞)放置恒温箱中培养 后在 孔板中加入 噻唑蓝溶液继续孵育 弃去 孔板中的溶液然后滴加 二甲基亚砜溶液在 处检测细胞的吸光度值 细胞存活率()(处理组吸光度值 空白对照组吸光度值)/(对照组吸光度值 空白对照组吸光度值)雷公藤内酯(、/)对 细胞增殖的抑制作用检测方法同上 并采用中位药效法计算 种药物的联合作用指数当联合作用指数 时提示 种药物的联合使用起到协同效应.细胞划痕实验检测细胞迁移能力收集对数生长期的 细胞按照 /孔的密度接种至 孔板中放置恒温箱中孵育 用 的枪头自上至下划出一道划痕显微镜下拍照测量划痕宽度 分别设置对照组(不加药处理)氟尿嘧啶组(加 /的氟尿嘧啶)、雷公藤内酯组(加 /的雷公藤内酯)和联合组(加 /的氟尿嘧啶组和 /的雷公藤内酯)放置恒温箱孵育 然后显微镜下拍照测量划痕宽度 细胞迁移率()(划痕宽度 划痕宽度)/划痕宽度 .实验检测细胞侵袭能力收集对数生长期的 细胞分为对照组(不加药处理)氟尿嘧啶组(加 /的氟尿嘧啶)、雷公藤内酯组(加 /的雷公藤内酯)和联合组(加/的氟尿嘧啶和 /的雷公藤内酯)按照/孔的密度接种至小室上部恒温箱中孵育 后弃去小室上部培养液用棉签擦掉未穿膜的细胞将小室放置含有 多聚甲醛的 孔板中室温固定 再放入含有 结晶紫染色 然后用磷酸盐缓冲液清洗放置显微镜下观察每组选择 个视野拍照判定细胞侵袭率.流式细胞术检测细胞凋亡情况细胞以/孔的密度接种至 孔板中在恒温箱中孵育 后弃旧培养液分别加入含有氟尿嘧啶中国医药 年 月第 卷第 期 ./或雷公藤内酯 /或氟尿嘧啶 /雷公藤内酯 /的新鲜培养液 对照组加入新鲜培养液 继续培养 将细胞收集在 的 管中用磷酸盐缓冲液洗涤加入预冷的乙醇固定 再用磷酸盐缓冲液洗涤按照凋亡试剂盒说明向 管中加入 的蛋白异硫氰酸荧光素结合液重悬细胞再加入 蛋白 异硫氰酸荧光素和 的碘化丙啶室温下避光孵育 用流式细胞仪检测细胞凋亡率.蛋白质印迹法检测、和 蛋白相对表达水平 胃癌 细胞以 /孔的密度接种至 孔板中放置恒温箱中孵育 更换含有氟尿嘧啶/或雷公藤内酯 /或氟尿嘧啶/雷公藤内酯 /的新鲜培养液 对照组加入新鲜培养液 继续培养 提取细胞中的总蛋白 用二喹啉甲酸蛋白定量取 的蛋白行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白湿转至聚偏氟乙烯膜上用 牛血清白蛋白室温封闭 、之后滴加抗、抗、抗、抗、抗 肌动蛋白一抗孵育(稀释 孵育过夜)、洗涤 次、二抗孵育(稀释室温孵育)、洗涤 次后滴加适量化学发光显色液并置于凝胶成像系统中拍照观测蛋白相对表达水平.统计学方法采用 统计软件进行数据分析 计量资料以 表示多组间比较采用单因素方差分析两两比较采用 检验 为差异有统计学意义 结果.氟尿嘧啶、雷公藤内酯对胃癌 细胞增殖抑制作用 氟尿嘧啶和雷公藤内酯均呈剂量依赖性抑制 细胞增殖半数抑制浓度()分别为 /、/氟尿嘧啶 雷公藤内酯(/、/、/、/)作用于 细胞的联合作用指数分别为 、说明二者可协同抑制 细胞增殖 雷公藤内酯(/)分别与氟尿嘧啶、/联合作用于 细胞氟尿嘧啶 为 /与氟尿嘧啶单独作用于 细胞的 相比显著降低差异有统计学意义().氟尿嘧啶联合雷公藤内酯对 细胞迁移的影响 对照组、氟尿嘧啶组、雷公藤内酯组和联合组的细胞迁移率分别为()、()、()、()氟尿嘧啶组和联合组细胞迁移率低于对照组(、均 )联合组细胞迁移率低于氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组(、均 )见图 注:对照组不加药处理氟尿嘧啶组加 /的氟尿嘧啶雷公藤内酯组加 /的雷公藤内酯联合组加 /的氟尿嘧啶和 /的雷公藤内酯图 氟尿嘧啶和雷公藤内酯对胃癌 细胞迁移的影响 为对照组 分别为对照组、氟尿嘧啶组、雷公藤内酯组和联合组放置恒温箱孵育 .氟尿嘧啶联合雷公藤内酯对 细胞侵袭的影响 对照组、氟尿嘧啶组、雷公藤内酯组和联合组的细胞侵袭率分别为()、()、()、()氟尿嘧啶组和联合组细胞侵袭率低于对照组(、均 )联合组细胞侵袭率低于氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组(、均 )见图.氟尿嘧啶联合雷公藤内酯对 细胞凋亡的影响 对照组、氟尿嘧啶组、雷公藤内酯组和联合组的细胞凋亡率分别为()、()、()、()氟尿嘧啶组和联合组细胞凋亡率高于对照组(、均 )联合组细胞凋亡率高于氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组(、均 ).氟尿嘧啶联合雷公藤内酯对/信号通路的影响联合组细胞、蛋白相对表达水平低于对照组、氟尿嘧啶组和雷公藤内酯组差异均有统计学意义(均 )见图、表 中国医药 年 月第 卷第 期 .注:对照组不加药处理氟尿嘧啶组加 /的氟尿嘧啶雷公藤内酯组加 /的雷公藤内酯联合组加 /的氟尿嘧啶和 /的雷公藤内酯图 氟尿嘧啶和雷公藤内酯对胃癌 细胞侵袭的影响 为对照组 为氟尿嘧啶组 为雷公藤内酯组 为联合组 注:为对照组加入新鲜培养液 为氟尿嘧啶组加/的氟尿嘧啶 为雷公藤内酯组加 /的雷公藤内酯 为联合组加/的氟尿嘧啶和/的雷公藤内酯 为磷酸酶 的癌性抑制因子 为蛋白磷酸酶 为 磷 酸 化哺 乳 动 物 雷 帕 霉 素 靶 标 复 合 物 为哺乳动物雷帕霉素靶标复合物 为 肌动蛋白图 蛋 白质印 迹法检 测胃癌 细胞、和 表达的电泳图表 对照组、氟尿嘧啶组、雷公藤内酯组及联合组胃癌 细胞相关蛋白相对表达水平比较()组别 孔数.值.值.注:为对照组加入新鲜培养液 为氟尿嘧啶组加/的氟尿嘧啶 为雷公藤内酯组加 /的雷公藤内酯 为联合组加 /的氟尿嘧啶和 /的雷公藤内酯 为磷酸酶 的癌性抑制因子 为蛋白磷酸酶 为磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶标复合物 为哺乳动物雷帕霉素靶标复合物 与对照组比较 与氟尿嘧啶组比较 与雷公藤内酯组比较 讨论胃癌是中国常见的癌症种类年龄标准化 年生存率为 此前一项根据区域临床数据的流行病学研究表明中国胃癌患者的中位生存期从 年的 个月增加到 年的 个月表明胃癌死亡率相对呈下降趋势 然而中国胃癌死亡人数占全球胃癌死亡人数的 左右 化疗引起的全身毒性和耐药性的增加是胃癌化疗成功的主要障碍 因此开发低毒或无毒的化学增敏剂以增强常规化学治疗剂的抗癌作用和逆转化学抗性是一个重要的领域 氟尿嘧啶是胃癌化疗的基础药物在晚期胃癌患者中与其他药物的联合使用表现出良好的耐受性和高反应率 雷公藤内酯是一种从雷公藤中分离出来的天然活性化合物目前研究显示在多种癌症中发挥抗肿瘤活性在胃癌中氟尿嘧啶联合低浓度雷公藤内酯是否可发挥协同抗肿瘤活性其可能的作用机制还不太明确 因此本研究通过检测氟尿嘧啶、雷公藤内酯单独和联合干预对 细胞增殖、迁移和侵袭的影响并分析对/信号通路的影响为胃癌治疗提供理论基础癌症的发展涉及细胞复杂的相互作用过程并且用单一药物治疗的效果有限联合治疗现在被认为是化疗的有效方法 联合治疗有许多优点包括靶向多个关键分子过程、递送毒性较低的低剂量药物以及提高患者耐受性 在本研究中氟尿嘧啶和雷公藤内酯均以剂量依赖性方式抑制 细胞增殖且二者联合发挥协同作用另外低剂量雷公藤内酯可显著增加 细胞对氟尿嘧啶的敏感性 在三阴性乳腺癌中研究显示雷公藤内酯可诱导 断裂并将细胞周期阻滞于 期增加三阴性乳腺癌对顺铂的敏感性 本研究结果显示雷公藤内酯(/)联合氟尿嘧啶(/)与单用氟尿嘧啶相比可显著抑制 细胞增殖、迁移和侵袭并诱导细胞凋亡说明雷公藤内酯(/)可增强 细胞对氟尿嘧啶(/)的敏感性 提示低剂量雷公藤内酯与氟尿嘧啶联合可能被开发为治疗胃癌的化疗组合方案并降低氟尿嘧啶引起的化疗毒性 可控制蛋白质翻译、细胞生长和代谢 在胃癌和许多其他癌症中检测到 过度激活此外 还是自噬的主要负调节因子 因此靶向 可能是耐药性癌症治疗中一种有吸引力的策略 可以直接与 结合作为 相关 的变构抑制剂发挥相应作用 研究显示、和中国医药 年 月第 卷第 期 .均与药物抗性有关 因此抑制/信号通路的传导将有效抑制细胞活性并增强药物的敏感性 本研究结果亦显示氟尿嘧啶联合雷公藤内酯可显著抑制/信号通路的传导综上所述氟尿嘧啶联合低剂量雷公藤内酯可协同抑制 细胞增殖、迁移和侵袭并增强 细胞对氟尿嘧啶的敏感性可能与抑制/信号通路传导有关利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突参考文献 .:.():.:./.:.():.:./.:.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.():.:././.():.:./.():.:./.():.:././.():.:./.:.()():.:./.():.:./.:.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.():.:./.:.():.:././?.():.:./.():.:./.().():.:./.():.:./.(收稿:)(本文编辑:董帅)中国医药 年 月第 卷第 期 .