阪崎肠杆菌研究进展.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,赵贵明,2009,年,8,月,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,内容提要,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化,第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的重视程度,CODE OF HYGIENIC PRACTICE FOR POWDERED FORMULAE FOR INFANTS AND YOUNG CHILDREN,CAC/RCP 66-2008,替代,CAC/RCP 21-1979,由争论到定论,给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南,脑膜炎,小肠结肠炎,菌血症,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定,关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知,(,国质检食函,2005690,号,),；,关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知,国质检食函,2007298,号）；,婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则,(2006,、,2008,版,),中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路,监控时间：,2005.42006.3,分离出阪崎肠杆菌：,80,株,中间产品和终产品的阳性检出率：,2.5%,阳性样品检出点占全部取样点的比例：,31%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史,阪崎肠杆菌的发现及其命名历史,阪崎肠杆菌为新种的分类依据,克罗诺杆菌分类学、词源学及其属和种生物学特性,克罗诺杆菌（,Cronobacter spp.,）属名、种名词源学,属及其各个种的生物学特性、代表性种,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史,阪崎肠杆菌的发现及其命名历史,1929,年,Pangalos,报道的一种引起婴儿败血症的产黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆菌”,;,1961,年,Urmenyi,和,Franklin,根据,1958,年发生在英国奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆菌菌群，并取日本细菌学家,Riichi Sakazaki,的名字作为该菌的名称,;,有人称之为：“,Urmenyi,和,Franklin,杆菌”；,1965,年,Joker,等分析了发生在丹麦的一个相同病例，并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”,.,直到,1980,年，,Farmer,等发表了题为“,Enterobacter sakazakii,new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens.”,的文章，该菌才被统一命名并定义，该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。,阴沟肠杆菌,阪崎肠杆菌,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌为新种的分类依据,统一了该菌的名称；,确证了“产黄色素的阴沟肠杆菌”,是一个新种,，而,不是阴沟肠杆菌的一个生物群,。,依据什么？,DNA,相关性,产黄色素,生化试验,抗生素易感性,细菌不同株属于同一种水平,DNA,的相关性通常应在,70%,或更高,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA,相关性实验,ATCC29544,阴沟肠杆菌,差异柠檬酸杆菌,51%,51%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生化试验,不利用山梨醇,36,C,下培养,7d,，,DNA,酶为阳性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,Farmer,实验结论,阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种；,阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更为相近；,阪崎肠杆菌应作为一个独立种，归属于肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌之间也有差异，被分成,15,个生物型或群。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,细菌分类方面的问题,种是生物分类中基本分类单位，是具有高度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别；,细菌学家和分类学家存在一定分歧；,DNA,杂交同源性在,60-70%,以上，或,16SrRNA,序列同源性达到,97%,以上的菌株，被认为是同一种。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的分类学变化,16SrRNA,序列同源性在细菌分类学上的重要作用,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果,重新分类的依据：,的扩增片段长度多态性分析（,Amplified fragment length polymorphismas,AFLP,）,16S rRNA,全序列比较,DNA-DNA,杂交实验结果。,2008,年,Iversen,等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（,International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSB,）”上发表文章。,建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科,1,个新属，即克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）包括,5,个新种（其中,Cronobacter sakazakii,称为新组合）、,1,个克罗诺杆菌基因种（,genomospeciese,）和三个新亚种，在该杂志通知清单上（,2008,年，,58,卷，第,6,部分）,1,个新属、,5,个新种和三个新亚种已公布。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,“,系统与进化微生物学国际期刊（,International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSB,）”,记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,包括,5,个新种,（其中,Cronobacter sakazakii,称为新组合）、,1,个克罗诺杆菌基因种（,genomospeciese,）和三个新亚种,.,克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA,相关性：同种,70%,；其它,70%,；支持克罗诺杆菌应由不同种组成的说法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌及相近种细菌的,16SrRNA,基因进化树,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）,Cronobacter sakazakii,，仍以日本细菌学家名字命名，中文应为,阪崎克罗诺杆菌,；,Cronobacter malonaticus,，“,malonaticus,”,意为可利用丙二酸盐，中文应为,丙二酸盐阳性克罗诺杆菌,；,Cronobacter turicensis,，“,turicensis”,是瑞士苏黎世的拉丁文名字，中文应为,苏黎世克罗诺杆菌,；,Cronobacter muytjensii,，“,muytjensii”,即,Muytjens,，是荷兰著名微生物学家，早期从事过大量阪崎肠杆菌方面的研究工作，中文,穆汀斯克罗诺杆菌,；,Cronobacter dublinensis,，,都柏林克罗诺杆菌,，菌株的分离地点，,Cronobacter dublinensis,subsp.,dublinensis,，,都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；,Cronobacter dublinensis,subsp.,lausannensis,，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；,Cronobacter dublinensis,subsp.,lactaridi,，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种，“,lactaridi”,意为乳粉或奶粉。,一个,克罗诺杆菌基因种,1,，,Cronobacter genomospecies,1,。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌词源学,名字起源于希腊神话中“,Cronos”,，克罗诺斯是十二个泰坦巨神之一，传说中的天空间神，当他每个孩子一出生就被他一口吃掉，行为表现形式和该菌的致病特性很吻合，因此，笔者建议将,Cronobacter spp.,中文翻译成“克罗诺杆菌属”。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属生物学特性,革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性,触酶反应阳性,兼性厌氧,通常有动力,3,m,1,m,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生长条件范围,6,C,-45,C,下可以在,BHI,中生长；,pH5-10,可以生长，低于,4.5,不生长；,0-7%,的,NaCI,中生长；超过,10%,不生长；,100mM,硫酸铵，硝酸钠、亚硝酸钠中仍可生长；,200mM,磷酸钠，,5%,硫酸钠和,20%,乙二醇中也可生长；,20mM,苯甲酸钠中不生长。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,糖醇利用,还原硝酸盐,利用柠檬酸盐,水解七叶苷,水解精氨酸,鸟氨酸 脱羧酶阳性,产酸,葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二塘、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、海藻糖半乳糖醛酸酯,(,盐,),、麦芽糖。,VP,阳性,甲基红阴性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌主要生化特征,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应,吲哚,卫矛醇,果糖,丙二酸盐,麦芽糖,帕拉金糖,丁二胺,松三糖,松二糖,肌醇,乌头酸盐,甲基,-,-,葡萄糖苷,氨基丁酸,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,简单区分各种的生化反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的检测方法,FDA,，,Isolation and Enumeration of,Enterobacter sakazakii,from Dehydrated Powdered Infant Formula,2002,SN/T 16322005,奶粉中阪崎肠杆菌检验方法,SN/T 1632.12005,分离与计数方法,SN/T 1632.22005 PCR,检验方法,SN/T 1632.32005,荧光,PCR,检验方法,ISO/TS 22964 IDF/RM210 Milk and milk products Detection of,Enterobacter sakazakii 2006,GB/T 4789.40,2008,食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验,第一法 定性方法,第二法,MPN,方法,Keith Lampel,基思,.,蓝佩尔,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌检测方法的实验设计,传统方法,前增菌,蒸馏水,BPW,选择性增菌,mLST,EE,选择性分离,显色培养基（,DFI,、,ESIA,，其他）,VRBGA,主要生化特征的鉴别,产黄色素,DNA,酶,生化鉴定,API,VITEK,其他,分子生物学方法,前增菌,选择性增菌,目标片段扩增,dnaG.,基因，大分子合成操纵子；,gluA,.,基因，,-,葡萄糖苷酶；,rpob,基因，编码,RNA,聚合酶,亚单位的基因,分离,鉴定,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,增菌过程发现的问题,EE,肉汤抑制了部分肠杆菌属细菌生长，包括阪崎肠杆菌；,当含量低的目标菌被有效回收时，竞争性的革兰氏阳性菌也能检测的到；,提出在前增菌的,BPW,中增补：,40,M8-,羟基喹啉、,0.5g,柠檬酸鉄铵、,0.1g,去氧胆酸钠、,0.1g,丙酮酸钠,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,分离克罗诺杆菌新筛选方法,FDA,方法：,ISO/TS 22964:,CSB,增菌肉汤结合,DFI,琼脂：,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,CSB,克罗诺杆菌筛选肉汤（,g/L,）,蛋白胨,10,；,肉浸粉,3,；,氯化钠,5,；,溴甲酚紫,0.04,；,蔗糖,10,；,万古霉素,10mg,；,pH7.4,0.1,最佳培养温度：,42,C,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,两种显色培养基的成分差别,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,底物的种类和特点,荧光类,水溶性；受,pH,值影响；强烈扩散；需紫外灯,吲哚类（吲哚衍生物）（新型酶底物）,稳定性好；,5-Br-4-Cl-3-,吲哚（,X,）：蓝绿色,5-Br-6-Cl-3-,吲哚（,Y,）：洋红色,6-Cl-3-,吲哚：鲜肉色,6-F-3-,吲哚：胭脂红,酚类 如：儿茶酚，苯磷二酚,其他 间接反应,直接反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别,X-,-Glu,，,0.1g/L,3.8%,克罗诺杆菌在显色培养基为阴性，当增加到,0.15g/L,时，又可以变成蓝绿色菌落；,肠杆菌科其他菌,32%-46%,也是阳性。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,表型和遗传试验鉴定克罗诺杆菌的结果差异评价,底物反应比商品化显色培养基灵敏度更高，尤其是,Cronobacter sakazakii,和,Cronobacter dublinensis,；,-,葡萄糖苷酶并非,100%,都能表达，传统反分离方法存在漏检可能,0.5-4.3%,；,通过遗传特征的鉴定效率更高一些；,API20E,鉴定克罗诺杆菌属的符合率（从好的鉴定到最好的鉴定）仅,70%,；,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,根据,rpoB,基因设计的引物可以将克罗诺杆菌属各种区分开,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,建议重新修订阪崎肠杆菌行业标准,阪崎肠杆菌的命名及分类学方面已产生变化,国标没有快速筛选方法,附录中增加阪崎肠杆菌可以鉴定到种的方法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,影响乳粉安全的食源性致病菌研究,背景：,乳粉作为一种特殊食品，近年来连续引发了与安全相关的事件而受到国际相关组织、各国政府的高度重视及国民的广泛关注，但现行的乳粉卫生标准已不能够满足乳粉安全的要求，开展影响乳粉安全的食源性致病菌方面的研究急需而紧迫。,获得的资助：,科技部社会社会公益研究专项“乳粉中新出现的致病菌研究及其风险评估”,(2004DIA2J004),；,国家质检总局“乳品中阪崎肠杆菌检测方法研究”（,2004IK097,）的资助。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,研究成果,应用分子生物学手段和对传统方法进行创新性改进技术，形成了对肺炎克雷伯氏菌等,16,种潜在致病菌的检测方法体系；,制订了,乳粉卫生微生物学检测方法,13,项行业标准、,10,项,进出口婴幼儿配方粉柠檬酸杆菌等计数与检测方法,国家标准；,对乳粉中,16,种潜在致病菌进行了风险评估；,首次对我国进口及进口原料生产的,487,份奶粉样品中阪崎肠杆菌污染状况进行了调查。,发表文章,47,篇；申请专利,1,项。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,对阪崎肠杆菌的分离鉴别方法、表型特征分类进行了系列研究,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,小结,1980,年，该菌被正式定名为阪崎肠杆菌，属于肠杆菌属的一个种，分为,15,个生物群；,2008,年，分类学方面发生变化，根据,系统与进化微生物学国际期刊,官方杂志公布，,1,个新组合，,4,个新种，三个新亚种，克罗诺杆菌属为新属。目前阪崎肠杆菌已分为,6,个种。,克罗诺杆菌属各代表种：,C.sakazakii,，,ATCC 29544,（相当于,NCTC 11467,）；,C.malonaticus,，,CDC 1058-77,，相当于,LMG 23826,和,DSM 18702,；,C.turicensis,，,z3032,，（相当于,LMG 23827,和,DSM 18703,）；,C.,genomospecies,1,，,NCTC 9529,；,C.muytjensii,，,ATCC 51329,（相当于,CIP 103581,）；,C.dublinensis,，,DES 187,（相当于,LMG 23823,和,DSM 18705,）。,C.dublinensis,subsp.,dublinensis,，,DES 187,（相当于,LMG 23823,和,DSM 18705,）；,C.dublinensis,subsp.,lausannensis,，,E515,（相当于,LMG 23824,和,DSM 18706,）；,C.dublinensis,subsp.,lactaridi,，,E464,（相当于,LMG23825,和,DSM 18707,）。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,Thanks!,