阪崎肠杆菌研究进展.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,赵贵明,2009,年,8,月,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,内容提要,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化,第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的重视程度,CODE OF HYGIENIC PRACTICE FOR POWDERED FORMULAE FOR INFANTS AND YOUNG CHILDREN,CAC/RCP 66-2008,替代,CAC/RCP 21-1979,由争论到定论,给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南,脑膜炎,小肠结肠炎,菌血症,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定,关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知,(,国质检食函,2005690,号,),；,关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知,国质检食函,2007298,号）；,婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则,(2006,、,2008,版,),中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路,监控时间：,2005.42006.3,分离出阪崎肠杆菌：,80,株,中间产品和终产品的阳性检出率：,2.5%,阳性样品检出点占全部取样点的比例：,31%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史,阪崎肠杆菌的发现及其命名历史,阪崎肠杆菌为新种的分类依据,克罗诺杆菌分类学、词源学及其属和种生物学特性,克罗诺杆菌（,Cronobacter spp.,）属名、种名词源学,属及其各个种的生物学特性、代表性种,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史,阪崎肠杆菌的发现及其命名历史,1929,年,Pangalos,报道的一种引起婴儿败血症的产黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆菌”1961,年,Urmenyi,和,Franklin,根据,1958,年发生在英国奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆菌菌群，并取日本细菌学家,Riichi Sakazaki,的名字作为该菌的名称,;,有人称之为：“,Urmenyi,和,Franklin,杆菌”；,1965,年,Joker,等分析了发生在丹麦的一个相同病例，并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”,.,直到,1980,年，,Farmer,等发表了题为“,Enterobacter sakazakii,new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens.”,的文章，该菌才被统一命名并定义，该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。,阴沟肠杆菌,阪崎肠杆菌,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌为新种的分类依据,统一了该菌的名称；,确证了“产黄色素的阴沟肠杆菌”,是一个新种,，而,不是阴沟肠杆菌的一个生物群,。,依据什么？,DNA,相关性,产黄色素,生化试验,抗生素易感性,细菌不同株属于同一种水平,DNA,的相关性通常应在,70%,或更高,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA,相关性实验,ATCC29544,阴沟肠杆菌,差异柠檬酸杆菌,51%,51%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生化试验,不利用山梨醇,36,C,下培养,7d,，,DNA,酶为阳性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,Farmer,实验结论,阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种；,阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更为相近；,阪崎肠杆菌应作为一个独立种，归属于肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌之间也有差异，被分成,15,个生物型或群。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,细菌分类方面的问题,种是生物分类中基本分类单位，是具有高度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别；,细菌学家和分类学家存在一定分歧；,DNA,杂交同源性在,60-70%,以上，或,16SrRNA,序列同源性达到,97%,以上的菌株，被认为是同一种。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的分类学变化,16SrRNA,序列同源性在细菌分类学上的重要作用,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果,重新分类的依据：,的扩增片段长度多态性分析（,Amplified fragment length polymorphismas,AFLP,）,16S rRNA,全序列比较,DNA-DNA,杂交实验结果。,2008,年,Iversen,等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（,International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSB,）”上发表文章。,建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科,1,个新属，即克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）包括,5,个新种（其中,Cronobacter sakazakii,称为新组合）、,1,个克罗诺杆菌基因种（,genomospeciese,）和三个新亚种，在该杂志通知清单上（,2008,年，,58,卷，第,6,部分）,1,个新属、,5,个新种和三个新亚种已公布。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,“,系统与进化微生物学国际期刊（,International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,IJSB,）”,记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,包括,5,个新种,（其中,Cronobacter sakazakii,称为新组合）、,1,个克罗诺杆菌基因种（,genomospeciese,）和三个新亚种,.,克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA,相关性：同种,70%,；其它,70%,；支持克罗诺杆菌应由不同种组成的说法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌及相近种细菌的,16SrRNA,基因进化树,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属（,Cronobacter spp.,）,Cronobacter sakazakii,，仍以日本细菌学家名字命名，中文应为,阪崎克罗诺杆菌,；,Cronobacter malonaticus,，“,malonaticus,”,意为可利用丙二酸盐，中文应为,丙二酸盐阳性克罗诺杆菌,；,Cronobacter turicensis,，“,turicensis”,是瑞士苏黎世的拉丁文名字，中文应为,苏黎世克罗诺杆菌,；,Cronobacter muytjensii,，“,muytjensii”,即,Muytjens,，是荷兰著名微生物学家，早期从事过大量阪崎肠杆菌方面的研究工作，中文,穆汀斯克罗诺杆菌,；,Cronobacter dublinensis,，,都柏林克罗诺杆菌,，菌株的分离地点，,Cronobacter dublinensis,subsp.,dublinensis,，,都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种；,Cronobacter dublinensis,subsp.,lausannensis,，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种；,Cronobacter dublinensis,subsp.,lactaridi,，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种，“,lactaridi”,意为乳粉或奶粉。,一个,克罗诺杆菌基因种,1,，,Cronobacter genomospecies,1,。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌词源学,名字起源于希腊神话中“,Cronos”,，克罗诺斯是十二个泰坦巨神之一，传说中的天空间神，当他每个孩子一出生就被他一口吃掉，行为表现形式和该菌的致病特性很吻合，因此，笔者建议将,Cronobacter spp.,中文翻译成“克罗诺杆菌属”。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属生物学特性,革兰氏阴性杆菌,氧化酶阴性,触酶反应阳性,兼性厌氧,通常有动力,3,m,1,m,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生长条件范围,6,C,-45,C,下可以在,BHI,中生长；,pH5-10,可以生长，低于,4.5,不生长；,0-7%,的,NaCI,中生长；超过,10%,不生长；,100mM,硫酸铵，硝酸钠、亚硝酸钠中仍可生长；,200mM,磷酸钠，,5%,硫酸钠和,20%,乙二醇中也可生长；,20mM,苯甲酸钠中不生长。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,糖醇利用,还原硝酸盐,利用柠檬酸盐,水解七叶苷,水解精氨酸,鸟氨酸 脱羧酶阳性,产酸,葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖、纤维二塘、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、海藻糖半乳糖醛酸酯,(,盐,),、麦芽糖。,VP,阳性,甲基红阴性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌主要生化特征,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应,吲哚,卫矛醇,果糖,丙二酸盐,麦芽糖,帕拉金糖,丁二胺,松三糖,松二糖,肌醇,乌头酸盐,甲基,-,-,葡萄糖苷,氨基丁酸,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,简单区分各种的生化反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的检测方法,FDA,，,Isolation and Enumeration of,Enterobacter sakazakii,from Dehydrated Powdered Infant Formula,2002,SN/T 16322005,奶粉中阪崎肠杆菌检验方法,SN/T 1632.12005,分离与计数方法,SN/T 1632.22005 PCR,检验方法,SN/T 1632.32005,荧光,PCR,检验方法,ISO/TS 22964 IDF/RM210 Milk and milk products Detection of,Enterobacter sakazakii 2006,GB/T 4789.40,2008,食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验,第一法 定性方法,第二法,MPN,方法,Keith Lampel,基思,.,蓝佩尔,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所阪崎肠杆菌检测方法的实验设计,传统方法,前增菌,蒸馏水,BPW,选择性增菌,mLST,EE,选择性分离,显色培养基（,DFI,、,ESIA,，其他）,VRBGA,主要生化特征的鉴别,产黄色素,DNA,酶,生化鉴定,API,VITEK,其他,分子生物学方法,前增菌,选择性增菌,目标片段扩增,dnaG.,基因，大分子合成操纵子；,gluA,.,基因，,-,葡萄糖苷酶；,rpob,基因，编码,RNA,聚合酶,亚单位的基因,分离,鉴定,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,增菌过程发现的问题,EE,肉汤抑制了部分肠杆菌属细菌生长，包括阪崎肠杆菌；,当含量低的目标菌被有效回收时，竞争性的革兰氏阳性菌也能检测的到；,提出在前增菌的,BPW,中增补：,40,M8-,羟基喹啉、,0.5g,柠檬酸鉄铵、,0.1g,去氧胆酸钠、,0.1g,丙酮酸钠,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,分离克罗诺杆菌新筛选方法,FDA,方法：,ISO/TS 22964:,CSB,增菌肉汤结合,DFI,琼脂：,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,CSB,克罗诺杆菌筛选肉汤（,g/L,）,蛋白胨,10,；,肉浸粉,3,；,氯化钠,5,；,溴甲酚紫,0.04,；,蔗糖,10,；,万古霉素,10mg,；,pH7.4,0.1,最佳培养温度：,42,C,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,两种显色培养基的成分差别,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,底物的种类和特点,荧光类,水溶性；受,pH,值影响；强烈扩散；需紫外灯,吲哚类（吲哚衍生物）（新型酶底物）,稳定性好；,5-Br-4-Cl-3-,吲哚（,X,）：蓝绿色,5-Br-6-Cl-3-,吲哚（,Y,）：洋红色,6-Cl-3-,吲哚：鲜肉色,6-F-3-,吲哚：胭脂红,酚类 如：儿茶酚，苯磷二酚,其他 间接反应,直接反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别,X-,-Glu,，,0.1g/L,3.8%,克罗诺杆菌在显色培养基为阴性，当增加到,0.15g/L,时，又可以变成蓝绿色菌落；,肠杆菌科其他菌,32%-46也是阳性。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,表型和遗传试验鉴定克罗诺杆菌的结果差异评价,底物反应比商品化显色培养基灵敏度更高，尤其是,Cronobacter sakazakii,和,Cronobacter dublinensis,；,-,葡萄糖苷酶并非,100%,都能表达，传统反分离方法存在漏检可能,0.5-4.3%,；,通过遗传特征的鉴定效率更高一些；,API20E,鉴定克罗诺杆菌属的符合率（从好的鉴定到最好的鉴定）仅,70%,；,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,根据,rpoB,基因设计的引物可以将克罗诺杆菌属各种区分开,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,建议重新修订阪崎肠杆菌行业标准,阪崎肠杆菌的命名及分类学方面已产生变化,国标没有快速筛选方法,附录中增加阪崎肠杆菌可以鉴定到种的方法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,影响乳粉安全的食源性致病菌研究,背景：,乳粉作为一种特殊食品，近年来连续引发了与安全相关的事件而受到国际相关组织、各国政府的高度重视及国民的广泛关注，但现行的乳粉卫生标准已不能够满足乳粉安全的要求，开展影响乳粉安全的食源性致病菌方面的研究急需而紧迫。,获得的资助：,科技部社会社会公益研究专项“乳粉中新出现的致病菌研究及其风险评估”,(2004DIA2J004),；,国家质检总局“乳品中阪崎肠杆菌检测方法研究”（,2004IK097,）的资助中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,研究成果,应用分子生物学手段和对传统方法进行创新性改进技术，形成了对肺炎克雷伯氏菌等,16,种潜在致病菌的检测方法体系；,制订了,乳粉卫生微生物学检测方法,13,项行业标准、,10,项,进出口婴幼儿配方粉柠檬酸杆菌等计数与检测方法,国家标准；,对乳粉中,16,种潜在致病菌进行了风险评估；,首次对我国进口及进口原料生产的,487,份奶粉样品中阪崎肠杆菌污染状况进行了调查。,发表文章,47,篇；申请专利,1,项。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,对阪崎肠杆菌的分离鉴别方法、表型特征分类进行了系列研究,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,小结,1980,年，该菌被正式定名为阪崎肠杆菌，属于肠杆菌属的一个种，分为,15,个生物群；,2008,年，分类学方面发生变化，根据,系统与进化微生物学国际期刊,官方杂志公布，,1,个新组合，,4,个新种，三个新亚种，克罗诺杆菌属为新属。目前阪崎肠杆菌已分为,6,个种。,克罗诺杆菌属各代表种：,C.sakazakii,，,ATCC 29544,（相当于,NCTC 11467,）；,C.malonaticus,，,CDC 1058-77,，相当于,LMG 23826,和,DSM 18702,；,C.turicensis,，,z3032,，（相当于,LMG 23827,和,DSM 18703,）；,C.,genomospecies,1,，,NCTC 9529,；,C.muytjensii,，,ATCC 51329,（相当于,CIP 103581,）；,C.dublinensis,，,DES 187,（相当于,LMG 23823,和,DSM 18705,）。,C.dublinensis,subsp.,dublinensis,，,DES 187,（相当于,LMG 23823,和,DSM 18705,）；,C.dublinensis,subsp.,lausannensis,，,E515,（相当于,LMG 23824,和,DSM 18706,）；,C.dublinensis,subsp.,lactaridi,，,E464,（相当于,LMG23825,和,DSM 18707,）。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,Thanks!,