第3章-基因工程的酶学基础(植物基因工程).ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,一、限制性核酸内切酶,第一节,限制性核酸内切酶,是一类能够识别,双链,DNA,分子中的某种,特定核苷酸序列，,并由此处或附近,切割,DNA,双链,的核酸,内切酶,。,（,Restriction endonuclease,）,相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二脂键,2.,性质,内切酶。,原核生物，少数霉菌和蓝藻。,即在核酸分子链的,内部,制造切口的酶。,自我保护作用。,3.,功能,细菌的限制和修饰系统（,R/M,体系）,1.,来源,限制性内切酶将侵入细菌体内的,外源,DNA,切成小片断。,（,1,）限制（,Restriction,）,首先由,M.Meselson,和,R.Yuan,在,1968,年从大肠杆菌,B,株,和,K,株,分离的。,（,1,）识别位点序列,EcoB,：,TGA(N),8,TGCT,EcoK,：,AAC(N),6,GTGC,1.I,型限制性内切酶,如,EcoB,和,EcoK,。,未甲基化修饰的特异序列。,N,：表示任何一种核苷酸,需,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,（,S-,腺苷蛋氨酸）,（,3,）作用条件,在距离特异性识别位点约,10001500 bp,处,随机,切开一条,单链,。,Recognize site,cut,1-1.5kb,（,2,）切割位点,首先由,H.O.Smith,和,K.W.Wilcox,在,1970,年从流感嗜血菌中分离出来。,（,1,）识别位点序列,未甲基化修饰,的,双链,DNA,上的特殊靶序列（多数是回文序列）。,与,DNA,的来源无关,2.II,类限制性内切酶,分离的第一个酶是,Hind,回文结构：,指的是反向重复的一段,DNA,序列，其特点有二：,1,、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。,2,、这两股,DNA,链若按同方向阅读（如,5,/,3,/,），其核苷酸顺序相同,EcoR I,5-,G,AATTC,-3,3-,CTTAA,G,-5,产生粘性末端,EcoR V,5-,GAT,ATC,-3,3-,CTA,TAG,-5,产生平齐末端,（,2,）切割位点,切开,双链,DNA,。形成,粘性末端,（,sticky end,）或,平齐末端,（,blunt end,）。如：,识别位点处。,（,3,）粘性末端（,sticky ends,，,cohensive ends,）,含有几个核苷酸,单链,的末端。,分两种类型：,5,端凸出（如,EcoR I,切点）,G,AATTC,CTTAA,G,G,AATTC,CTTAA,G,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA,G,3,端凸出（如,Pst I,切点）,G,ACGTC,5-,-3,3-,-5,5-,-3,3-,-5,CTGCA,G,G,ACGTC,1,、同裂酶,（,Isoschizomers),：来源不同，,识别位点的,序列相同,的限制性内切酶。,（,4,）,II,型限制酶的一些特殊性质,完全同裂酶：,识别位点和切点完全相同,。,如,Hind,和,Hsu I,。,Hind,5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,Hsu I 5-A,AGCTT-3,3-TTCGA,A-5,Xma I 5-C,CCGGG-3,3-GGGCC,C-5,Sma I 5-CCC,GGG-3,3-GGG,CCC-5,识别位点相同，但切点不同。,如,Xma I,和,Sma I,。,不完全同裂酶：,EcoR I 5-G,AATTC-3,3-CTTAA,G-5,Apo I 5-R,AATTY-3,3-YTTAA,R-5,一种识别简并序列的限制酶具有另一种限制酶的功能，,如,EcoR I,和,Apo I,。,“同功多位”,识别的,序列不同,，但能切出,相同,的粘性末端。如,BamH I,、,Bgl,、,Bcl I,、,Xho,等,5-G,GATC,C-3,3-,CCTAG,G-5,BamH I,Bcl I,5-T,GATC,A-3,3-,ACTAG,T-5,5-,A,GATC,T-3,3-,TCTAG,A-5,Bgl,5-,U,GATC,Y-3,3-Y,CTAG,U-5,Xho,U,代表嘌呤；,Y,代表嘧啶。,2,、同尾酶,(Isocaudarners,）,5-,GATC,-3,3-,CTAG,-5,Sau 3A,同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点，,不能,再被原来的酶识别。,？,5-G,3-C,CTAG,GATC,T,-3,A,-5,BamH I,Bgl,5-G,GATC,T,-3,3-C,CTAG,A,-5,BamH I,Bgl,Sau 3A,3.III,类限制性内切酶,切割,DNA,位点 与识别位点不同。,反应需要,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,（,S-,腺苷蛋氨酸）。,在基因工程操作中用途不大。,EcoP1:AGACC,EcoP15:CAGCAG,核酸限制性内切酶的类型及主要特性,特性,I,类内切酶,II,类内切酶,III,类内切酶,限制和修饰活性,单亚基多功能酶,内切酶和甲基化酶分开,共同亚基的双功能酶,内切酶的蛋白结构,3,种不同的亚基,单一成分,2,种不同的亚基,限制作用所需要的辅助因子,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,Mg,2+,ATP,、,Mg,2+,和,SAM,寄主特异性位点识别序列,EcoB,：,TGA(N),8,TGCT EcoK,：,AAC(N),6,GTGC,回文序列,（,IIs,型除外）,EcoP1:,AGACC,EcoP15:,CAGCAG,切割位点,在距离识别位点至少,1000,bp,处随机切开一条单链。,位于寄主特异性位点或其附近,距寄主特异性位点,3,端,2426bp,处,DNA,易位作用,能,不能,不能,甲基化作用的位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,寄主特异性位点,识别未甲基化的序列进行切割,能,能,能,序列特异的切割,不是,是,是,基因工程中的用途,无用,十分有用,无用,前,3,个字母。属种名。,大写字母。菌株类型。,罗马字。第几种酶。,同属不同种，前,2,个字母相同时，取第三个字母。,E,co,R,I,E,scherichia,co,li,菌株类型,发现顺序序号,H,in,d,III,H,aemophilus,in,fluenzae,三、限制性内切酶的命名,4,碱基识别的限制酶为：,4,4,=,256,5,碱基识别的限制酶为：,4,5,=,1024,6,碱基识别的限制酶为：,4,6,=,4096,7,碱基识别的限制酶为：,4,7,=,16384,8,碱基识别的限制酶为：,4,8,=,65536,四、限制性内切酶的切割频率,DNA,中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、,SDS,、,EDTA,等都会影响酶的活性。,1.DNA,的纯度,五、影响限制性内切酶活性的因素,纯化,DNA,加大酶的用量,延长反应时间,扩大反应体积，使潜在的抑制因素被相应的稀释（,20,l,）,一般采取,大肠杆菌一般有,两种甲基化酶,修饰质粒：,2.DNA,的甲基化程度,dam,甲基化酶（修饰,G,A,TC,中的,A,）,dcm,甲基化酶（修饰,C,C,AGG/C,C,TGG,的,C,）,基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。,大多数是,37,o,C,，少数要求,40-65,o,C,。,酶,最适温度,o,C,酶,最适温度,o,C,酶,最适温度,o,C,Apa I,Bcl I,Mae II,Taq I,30,50,50,65,Apy I,BstE II,Mae III,30,60,55,Ban I,Mae I,Sma I,50,45,25,3.,温度,是影响限制酶活性的重要因素。,4.,缓冲液,(Buffer),缓冲液的化学组成,MgCl,2,、,NaCl/KCl,：,提供,Mg,2,+,和离子强度；,Tris-HCl,：,维持,pH,；,二硫苏糖醇（,DTT,）：保持酶稳定性；,牛血清白蛋白,BSA,等：有助于酶的稳定；,商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、,pH,等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。,限制酶的活性,如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（,*,）活性。,所以一般使用专一的反应缓冲液。,星号,（,*,）活性,Eco,R I,和,Bam,H I,等都有,*,活性。,在低盐、高,pH,（,8,）时可识别和切割,GAATTA,、,AAATTC,、,GAGTTC,等,GAATTC,Eco,R I,：,使用的时候要特别注意！,概括起来，诱发星活性的因素有如下几种,：,(1),高甘油含量,(5,v,v),；,(2),限制性内切核酸酶用量过高,(100U,ugDNA),；,(3),低离子强度,(25 mmol,L),；,(4),高,pH(8,0,以上,),；,(5),含有有机溶剂，如,DMSO(,二甲基亚砜,),，乙醇等；,(6),有非,Mg2+,的二价阳离子存在,(,如,Mn2+,，,Cu2+,，,Co2+,，,Zn2+,等,),。,5.,酶对消化效率的影响,但在实际应用中，一般要用稍过量的酶（,1g,加,25U,酶）反应较长的时间，才能达到完全酶解。但是不能过分加大酶的用量,？,酶过量对酶切反应的影响：,1,）、酶过量（一般为,100U/gDNA,）会影响识别序列的正确性，如：,BamHI,的正常识别序列,:,GGATTC,;,酶过量识别序列,NGATCN,2),、酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。,六、限制性内切酶对,DNA,的消化,1.,内切酶与识别序列的结合模式,1986,年,J.A.McClarin,等通过,X,射线晶体衍射发现,II,类限制酶是以,同型二聚体,的形式与靶序列结合。,GAATTC,CTTAAG,内切酶在,DNA,上的,所有,识别位点都被切开。,2.,完全消化,1,2,3,4,1,2,3,4,只有有限数量的酶切位点被切开。,通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。,3.,局部消化,1,2,3,4,1,4,大多数酶可用,65,o,C,温育,5,分钟失活。,或用,上样缓冲液失活,。,4.,限制酶酶切反应的终止,5.,几种常用限制酶识别位点,酶切反应体系,酶切反应举例,20,L,10,X buffer 2,10 X BSA 2,ddH,2,O 11,DNA 2,EcoR I(20u/L)1,Kpn I(10 u/L)2,20,L,37,C,2,hr,各种不正常的酶切和电泳结果,高质量,DNA,电泳,1,、电泳孔清晰可见，孔内无杂质。,2,、条带明亮、均匀、平直，宽度适中。,3,、背景低，但不可过黑。,4,、无杂点。,5,、泳道无漂移。,6,、,DNA Ladder,范围合适，亮度适中。,从细菌,DNA,环化现象推测，必定存在一种能把两条,DNA,双链连接到一起的酶。,第二节,DNA,连接酶,一、,DNA,连接酶（,ligase),的发现,1967,几个实验室同时发现能够在,2,条,DNA,链之间形成磷酸二酯键的酶,（,1,）大肠杆菌连接酶（,E.,coli,DNA),1.,几,种,DNA,连接酶,该酶由大肠杆菌基因组中的,lig,基因编码，只能连接,粘性末端,。,二、,DNA ligase,的特点,（,2,）,T4,噬菌体的连接酶,该酶是从,T4,噬菌体感染的大肠杆菌中分离的，由,DNA30,编码的产物。不但能连接粘性末端，还能连接,齐平末端,。,（,3,）,Taq DNA,连接酶,该酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一,DNA,链形成杂交体，相当于连接双链,DNA,中的缺口。,（,4,）,T4,RNA,连接酶,该酶可催化单链,DNA,或,RNA,与另一单链,DNA,或,RNA,之间的连接。,（,1,）,DNA3,端有游离的,-OH,，,5,端有一个磷酸基团（,P,）。,（,2,）需要,能量,动物或噬菌体中：,ATP,大肠杆菌中：,NAD,+,2.,连接条件,1.ATP,（,NAD,+,),提供激活的,AMP,。,三、连接反应的机理,2.ATP,与连接酶形成共价,“,连接酶,-AMP,（,AMP,与连接酶的,赖氨酸,-,氨基,相连,）,”,复合物，并释放出焦磷酸,PP,i,。,3.,连接酶,-AMP,复合物同,3,OH,和,5,P,基团的缺口结合，,AMP,同磷酸基团反应，并使其同,3,OH,基团接触，产生一个新的磷酸二酯键，从而使缺口封闭。,OC-C-CH,2,-CH,2,-CH,2,-CH,2,-NH,2,+,+,H,3,N,AMP,ATP,PP,i,3.1,AMP,随后从连接酶的赖氨酸,-,氨基转移到,DNA,一条链的,5,端,P,上，形成,“,DNA-,腺苷酸,”,复合物。,-OH,HO-P-,AMP,-OH,O-P-,AMP,3.2.,3-OH,对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出,AMP,。,连接酶反应的最佳温度是,37,C,。,四、连接反应的温度,1.,最佳温度,但在,37,下,粘性末端,的结合很不稳定。,2.,实用温度,所以一般采用,416,C,。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,1.,插入片段与载体的浓度比例,2.,反应温度,五、影响连接反应的因素,1020,倍。,一般,1416,3.,连接酶的浓度,在平末端,DNA,的连接反应中,最适的反应酶用量为,12U,而黏性末端仅为,0.1U,便能达到连接的最佳效果,.,4.,连接反应的时间,当连接温度在,1216,之间时,连接反应时间在,116,小时之间,.,如果温度更低,则延长反应时间,.,?,由限制性内切酶创造的黏性末端的连接属于,分子内部的连接,而平齐末端的连接则属于,分子之间的连接,因此后者反应速度相对慢得很多,如何提高其连接效率呢,?,1,、加大连接酶用量（,10,倍于黏性末端的连接）,2,、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会,3,、加入,10%PEG8000,，促进大分子之间的有效作用,4,、加入单价阳离子（,Nacl ),，最终浓度,150200 mM,5,、将平齐末端变成黏性末端,第三节,DNA,聚合酶,一、基因工程中常用的,DNA,聚合酶,大肠杆菌,DNA,聚合酶,2.Klenow fragment,3.T7 DNA,聚合酶,4.T4 DNA,聚合酶,5.,修饰过的,T7 DNA,聚合酶,6.,逆转录酶,1.,共同特点,把,dNTPs,连续地加到引物的,3OH,端,。,2.,主要区别,T7 DNA,聚合酶可以,连续添加数千个,dNTPs,而不从模板上掉下来。,其它几种,DNA,聚合酶只能连续,添加,10,多个,dNTPs,就会从模板上解离下来。,二、常用的,DNA,聚合酶的特点,持续合成能力和外切酶活性不同。,DNA,聚合酶,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,聚合速率,持续能力,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,低,有,中,低,Klenow fragment,低,无,中,低,T4DNA,聚合酶,高,无,中,低,T7DNA,聚合酶,高,无,快,高,化学修饰,T7DNA,聚合酶,低,无,快,高,遗传修饰,T7DNA,聚合酶,无,无,快,高,逆转录酶,无,无,低,中,Taq DNA,聚合酶,无,有,快,高,3.,常用,DNA,聚合酶的特性比较,三、,DNA,聚合酶在基因工程中的用途,1.,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,主要用来制备带放射性标记的,DNA,探针。,（,1,）大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,的性质,一条,单链多肽,具有,5,3,外切酶活性,3,5,外切酶活性,5,3,聚合酶活性,用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉,N,端的,5,3,外切酶活性,部分。就成为,Klenow fragment,。,底物：,dNTPs,（,dATP,、,dGTP,、,dCTP,、,dTTP,）,Mg,2,+,带有,3OH,游离端的引物,DNA,模板,（,2,）,DNA,聚合酶,I,（,Pol I,）的反应条件,-OH,5,3,dNTPs,可以是单链的，也可以是双链的,标记,标记,核酸探针（,probe,）,核酸探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性互补结合的，带有标记的核酸分子。,（,3,）,DNA,聚合酶,I,的用途,已知序列的核酸片断,显示位置,与互补的待测序列杂交,cDNA,第二链的合成,标记,已知序列的核酸片断,探针的标记方式,标记,已知序列的核酸片断,带有放射性的已知序列的核酸片断,5,3,切口平移法：,5,3,外切酶活性从,DNA,切口的,下一段,DNA5,端除去一个核苷酸后，聚合酶活性就会在切口的,上一段,DNA,的,3,一侧补上一个新的核苷酸。,切口,切口,5,5,3,3,5,3,5,3,随机引物法,2.Klenow fragment,具有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性。（,失去了,5,3,外切酶活性,）。,（,1,）,Klenow fragment,的性质,DNA Pol I,Klenow fragment(76KD,）,枯草杆菌蛋白酶,3,端补平,5,5,klenow,DNA 3,末端标记,补平限制性内切酶切后形成的,3,隐蔽端,。,在,3,隐蔽端,加上放射性标记的,dNTP,。,klenow,（,2,）主要用途,3,隐蔽末端的,DNA,片断,Klenow fragment,补平,根据末端的顺序选择一种,-,32,P-dNTPs,末端标记的,DNA,限制性内切酶切,5-G3,3-CTTAA5,5-G,AA,3,3-CTTAA5,5-G,AA,TT3,3-CTTAA5,5-G3,3-CCTAG5,5-G,G,3,3-CCTAG5,5-G,G,ATC3,3-CCTAG5,EcoR I,BamH I,-,32,P-dATP,-,32,P-dGTP,25,o,C 1h,cDNA,第二链的合成,mRNA,cDNA,第一链,逆转录,cDNA,第二链,klenow,5,3,3,5,5,3,引物,切口平移标记,随机引物标记,（,1,）,T4 DNA,聚合酶的性质,3.T4 DNA,聚合酶,从,T4,噬菌体感染后的大肠杆菌培养物中分离纯化。由,噬菌体基因,43,编码。,有,5,3,聚合酶活性和,3,5,外切酶活性（降解单链更快）。,来源,酶活性,特点,当没有,dNTP,时，,T4DNA,聚合酶行使,3,5,外切酶功能，制造出,3,隐蔽端。,如果只有一种,dNTP,，则降解到该,dNTP,的位置。,5,5,3,3,5,5,3,3,T4 DNA,聚合酶,无,dNTPs,T4 DNA,聚合酶,有,dNTPs,5,5,（,2,）,T4 DNA,聚合酶的用途,标记末端（取代合成法）,用,3,5,外切酶活性作用于,所有末端形式的,3,端,（平端、,3,隐蔽端、,5,隐蔽端）制造出,3,隐蔽端。,再利用它的,5,3,聚合酶活性补平，并加入放射性标记的,dNTP,。,补平隐蔽末端,DNA 3,末端标记,酶切中间产生两个末端标记,加入某种,32,P-dNTP,和,dNTPs,T4 DNA,聚合酶,（,3,5,外切）,DNA,酶切片断,T4 DNA,聚合酶,（,5,3,聚合）,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,5,5,3,3,内切酶切,无,dNTPs,a.,放射性标记的,优缺点,：,制作简单、,高比放射性、,放射自显影效果好。,优点：,缺点：,半衰期短（,32,P,只有,14.3,天）、,不易保存、,对人体有害。,要求在专门实验室操作。,b.,非放射性标记,i,）生物素标记：,生物素（,biotin,），又称维生素,H,、辅酶,R,可以与,dNTP,酰化结合成为生物素,-1,6-dUTP,、生物素,-1,4-dATP,、生物素,-1,1-dUTP,等。,CH,2,-CH-NH-CO-NH-CH-(CH,2,),4,-COOH,也可以被生物素连接酶（,biotin ligase,）催化与蛋白质共价结合。,纯化的,DNA,片断,DNase I,制造单链缺口,DNA Pol I,进行缺口转移,生物素,-dTTP,和,dNTPs,5,5,5,5,5,5,5,5,3,3,3,3,3,3,3,3,生物素,-dTTP,生物素,-dTTP,利用缺口转移法将生物素掺入,DNA,探针中,抗生物素蛋白（,avidin,）：,链霉抗生物素蛋白（,streptavidin,）：,生物素的识别,亲和素,：,是一种,鸡,卵清蛋白。,细菌,中,avidin,的类似物。,能与生物素特异结合的蛋白或抗体，常用：,ii,）地高辛标记：,可以与,dNTP,连接成地高辛,-dUTP,等，参入,DNA,合成过程。形成地高辛标记的,DNA,探针。,生物素和地高辛标记的探针都有商品化的试剂盒,(kit),。,地高辛的结合物是,抗地高辛抗体,。,地高辛是一种从毛地黄属植物中提取的强心苷，被广泛用于治疗心脏病。,4.T7 DNA,聚合酶,（,1,）来源,从,T7,噬菌体感染的大肠杆菌细胞中纯化出来的，由两个亚基组成：,T7,基因,5,编码的大亚基：,有,5,3,聚合酶和,3,5,外切酶活性。,大肠杆菌编码的小亚基：,硫氧还蛋白。,增加大亚基对,模板的亲和性,。,（,2,）,T7 DNA,聚合酶的特点,持续合成能力强,一旦与模板结合就会不间断地合成互补链。,3,5,外切酶活性高,单链和双链都能降解。,不受,DNA,二级结构的影响,其它,DNA,聚合酶受,DNA,二级结构的阻碍,进行末端标记,以大分子量,DNA,为模板的合成,如,M13,补平隐蔽末端,（,3,）,T7 DNA,聚合酶的用途,取代合成法标记,3,末端。,与,T4 DNA,聚合酶相同。,合成,补平,3,隐蔽末端；,水解,修平,3,突出末端。,5.,修饰后的,T7 DNA,聚合酶,（,1,）,T7DNA,聚合酶的化学修饰,去除,3,5,外切酶活性，使,DNA,聚合能力和聚合速率提高了,3,倍。,（,2,）修饰后的,T7 DNA,聚合酶的用途,DNA,测序,双脱氧法。,标记,DNA 3,隐蔽末端,更有效地补平末端,6.,逆转录酶,最普遍使用的是来源于,鸟类骨髓母细胞瘤病毒,（,a,vian,m,yeloblastosis,v,irus,AMV,）：,依赖,RNA,的,DNA,聚合酶（,RNA,指导的,DNA,聚合酶）。,（,1,）来源,RNA,肿瘤病毒。,（,2,）,AMV,的性质,由,和,两条多肽链组成。,链,有反转录活性和,RNaseH,活性。,RNaseH,：,链经过蛋白酶水解后产生的一条多肽。,以,5,3,或,3,5,方向特异地水解,RNA-DNA,杂交双链中的,RNA,链,。,RNaseH,RNA,DNA,RNA,DNA,（,3,）逆转录酶的用途,链,RNA-DNA,杂交双链中,5,3,DNA,外切酶活性。,合成,cDNA,以,oligo dT,为引物（与,mRNA,的,polyA,尾巴互补结合）。,AAAAA,TTTTT,5,3,mRNA 5,cDNA,合成,DNA,探针,用随机引物（,random primer,）或,oligo dT,做引物。,随机引物：,随机顺序形成的寡聚,DNA,片断。,（理论上它能与各种序列的模板结合）,RT-PCR,用的模板,克隆某个基因时，用其,mRNA,反转录出,cDNA,第一链。,DNA,聚合酶,3,5,外切酶活性,5,3,外切酶活性,聚合速率,持续能力,大肠杆菌,DNA,聚合酶,低,有,中,低,Klenow fragment,低,无,中,低,T4DNA,聚合酶,高,无,中,低,T7DNA,聚合酶,高,无,快,高,化学修饰,T7DNA,聚合酶,低,无,快,高,遗传修饰,T7DNA,聚合酶,无,无,快,高,逆转录酶,无,有,低,中,Taq DNA,聚合酶,无,有,快,高,3.,常用,DNA,聚合酶的特性比较,第四节,DNA,修饰酶,一、末端脱氧核苷酸转移酶,1.,来源,小牛胸腺纯化出的一种小分子量的碱性蛋白质。,2.,组成,大小两个亚基。,3.,特性,5,3DNA,聚合酶活性,(,逐个地将脱氧核,苷酸分子加到线性,DNA,分子,3-OH,末端,),（,terminal transferase,）,不需要模板,！,需要,3OH,、二甲胂酸缓冲液。,底物可以是单链,DNA,、,是,3,端,突出的双链,DNA,、,平末端,在,Co,2,+,代替,Mg,2,+,下也可以。,随机添加的,dNTPs,。,如果只有一种,dNTP,，就添加上,同聚物,。,DNA 5,3,TTT,dTTP,，末端转移酶,4.,末端转移酶的用途,（,1,）同聚物加尾,给,外源,DNA,片断,和,载体,分子分别加上互补的同聚物尾巴，以使它们有效地连接。,外源,DNA,载体,DNA,5,3,5,3,CCC,CCC,GGG,GGG,dGTP,dCTP,末端转移酶,（,2,）再生酶切位点,克隆片断。,A,AGCT,T,T,TCGA,A,5,5,Hind,酶切,A,TTCGA,AGCTT,A,Klenow,补平,AAGCT,TTCGA,AGCTT,TCGAA,AAGCT,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,末端转移酶,dTTP,AAA,AAA,外源,DNA,AAGCT,TTT,TTCGA,AGCTT,TTT,TCGAA,AAA,AAA,Hind,位点,Hind,位点,连接,二、碱性磷酸酶,1.,碱性磷酸酶种类,从大肠杆菌中分离出来。,B,acterial,a,lkaline,p,hosphatase,，,BAP,（,1,）细菌碱性磷酸酶,（,2,）小牛肠碱性磷酸酶,C,alf,i,ntestinal alkaline,p,hosphatase,，,CIP,从小牛肠中纯化出来。,具有抗热性。,SDS,中加热,68,o,C,可完全失活。,2.,碱性磷酸酶的特性,催化脱掉,DNA,（或,RNA,）,5,端的磷酸,根。,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,碱性磷酸酶,3.,碱性磷酸酶的功能,（,1,）防止线性化的载体份子自我连接,单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接。,AAGCTT,TTCGAA,Hind,酶切,A-OH,T,TCGA,-,P,P,-,AGCT,T,HO-A,碱性磷酸酶,5,5,5,A-OH,TTCGA-,OH,HO,-AGCTT,HO-A,OH,与,OH,不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。,但同一酶切后的,外源,DNA,的,5,端有,P,，能与脱磷酸的载体,OH,连接。,三、,T4,多核苷酸激酶,1.,来源,T4,噬菌体的,pseT,基因编码。,从,T4,感染大肠杆菌细胞中分离出来。,多种哺乳动物细胞中也发现这种酶。,2.,功能,T4,多聚核苷酸激酶催化,ATP,的,-,磷酸基团移到多聚核苷酸的,5,末端单核苷酸上。,5,3,HO-,-OH,5,3,HO-,-OH,3,32,P,-,-OH,5,3,HO-,-,32,P,5,(,-,32,P,)ATP,多核苷酸激酶,3,P-,-OH,5,3,HO-,-P,5,碱性磷酸酶,第五节,核酸外切酶（,Exonucleases,）,是一类从多核苷酸链的一头开始催化,降解,核苷酸的酶。,一、单链,DNA,外切酶,1.,大肠杆菌核酸外切酶,I,（,exo I,）,5,3,外切,识别,5-OH,2.,大肠杆菌核酸外切酶,（,exo,）,5,3,、,3,5,外切,识别,3-OH,、,5-P,二、双链,DNA,外切酶,1.,核酸外切酶,（,exo,）,3,5,外切,识别,3-OH,主要用途：,在,DNA,双链的末端产生出单链区域。,5,5,5,5,exo,与,klenow,配合进行,3,端标记,-OH,HO-,2.,核酸外切酶（,exo,）,5,3,外切。,主要用途：,使,DNA,双链变成单链（短）。,5 P-,-P 5,5,5,exo,成为测序模板。,识别,5-P,（但不能降解,5-OH,）,虽然也能切割单链,DNA,但效率仅为双链的,1/200.,不能切割带切口或缺口的,DNA.,3.T7,基因,6,核酸外切酶,5,3,外切。,用途与,exo,一样。,既能识别,5-P,，又能识别,5-OH,。,5,5,5,5,DNA,外切酶,切割方式,识别位点,单链,大肠杆菌核酸外切酶,I,（,exo I,）,5,3,5-OH,大肠杆菌核酸外切酶,（,exo,）,5,3,3,5,5-P,3-OH,双链,核酸外切酶,（,exo,）,3,5,3-OH,核酸外切酶（,exo,）,5,3,5-P,T7,基因,6,核酸外切酶,5,3,5-P,5-OH,第六节,单链核酸内切酶,一、,S1,核酸酶,1.,来源,稻谷曲霉（,Aspergillus oryzae,）。,2.,特性,（,1,）高度单链特异性,（,2,）反应条件,低水平,Zn,2,+,pH4.0,4.3,3.S1,核酸内切酶的功能,（,1,）催化单链,RNA,或,DNA,降解。,（,2,）切掉双链核酸中的单链区。,S1,S1,发卡或有缺口的部位。,ATGCAT GCATGC,TACGTA CGTACG,T,甚至能识别单个核苷酸的单链区！,（,3,）降解限制酶切形成的单链突出端。,4.S1,核酸酶的用途,（,1,）定位,RNA,DNA,RNA,S1,S1,200bp,400bp,某限制酶切后再与,RNA,杂交,某限制酶位点（参照物）,RNA,RNA,位于某限制酶位点,左,200bp,和右,400bp,。,RNA,位置,不能配对的内含子区域形成的单链环被,S1,切掉。,mRNA,DNA,（,2,）用,mRNA,测定基因中的外显子序列,二、,Bal 31,核酸酶,1.,来源,埃氏交替单胞菌（,Alteromonoas espejiana,）,2.,功能,既是,单链,特异的,DNA,（,RNA,）内切酶；,又是,双链,特异的,DNA,外切酶。,降解双链,DNA,或其上的单链缺口、未配对的单链区域。,4.Bal31,的用途,定位测定,DNA,片断中的限制酶位点分布。,3.,反应条件,Mg,2,+,、,Ca,2,+,EGTA,（乙二醇双四乙酸）专一性螯合,Ca,2+,，可终止反应。,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,与对照组（不用,Bal31,消化）只用相同的酶切的电泳比较。,根据酶切片断消失的先后顺序，判断这些片断在原,DNA,中的位置。,用,Bal31,消化线性,DNA,，并在,不同的时间,加入,EGTA,终止反应，再酶切电泳。,Bal31,控制消化法：,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,分别用各个内切酶切后电泳，记录片断数目和大小。,EcoR I,BamH I,Hind III,Marker,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,EcoR I,EcoR I,BamH I,Hind III,Bal31,分别用原内切酶切后电泳，判断片断数目和大小。,Hind III,EcoR I,BamH I,Marker,思考题,按适当的顺序,列出将一种,mRNA,的,cDNA,克隆到表达载体所用到的酶,?,1,用反转录酶以,mRNA,为模板复制出单链,cDNA.,2,DNA,聚合酶以单链,cDNA,为模板合成双链,DNA.,3,S1,核酸酶切割双链,DNA,形成平末端,.,4,用限制性内切酶切割载体,.,5,用,DNA,连接酶将,cDNA,插入载体中,.,