第一章绪论1基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 绪论,基因工程的概念,基因工程的诞生与发展,基因工程研究的主要内容,基因工程的意义与发展前景,第一节 基因工程的概念,基因工程,是在分子水平进行的遗传操作,指将一种或多种生物体(,供体,)的基因或基因组提取出来,或者人工合成基因,按照人们的愿望,进行严密的设计,经过体外加工重组,转移到另一种生物体(,受体,)的细胞内,使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。,一、概念,基因工程,是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括,上游技术,和,下游技术,两大组成部分。,上游技术,指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而,下游技术,则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。,重组DNA技术,重组DNA技术,是指将一种生物体（,供体,）的基因与,载体,在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（,受体,）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操程序，也称为,分子克隆技术。,遗传工程,广义：,包括细胞工程和基因工程。,狭义：,就是基因工程。,一般所说的遗传工程就是基因工程,克隆,作名词时,指含有某目的DNA片段的重组DNA,分子或含有该重组分子的无性繁殖系。,作动词时,是指基因的分离与重组过程。,三、基因工程的用途,分离、扩增、鉴定、研究、整理,生物信息资源,大规模生产,生物活性物质,设计、构建,生物的新性状甚至新物种,9,第二节 基因工程的诞生与发展,一、基因工程诞生的理论基础,（一）理论上的三大发现,1.证实了DNA是遗传物质。,2.揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留,复制机理。,3.遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定。,10,S型,R型,特 征,光滑,菌落,（,s,mooth,）,粗糙,菌落,（,r,ough,）,有,多糖荚膜,无,荚膜,具有,毒性,无,毒性,抗原型,S、S、S,R、R,表1 肺炎双球菌的类型及特征,Frederic Griffith,18791941,图,Griffth,的肺炎双球菌转化实验,S型死菌,R型活菌,R 型,S,型,S型死菌,S,+,R,转化物质,R型菌体,S型菌体,S型死菌,遗传物质,Griffth 对,实 验 结 果 的 推 测,S,菌 株,多糖,脂类,蛋白质,RNA,DNA,R,菌落,DNA+DNase,R菌株,R菌株,R菌株,R菌株,R菌株,R菌株,分离纯化,杀死灭活,R,菌落,R,菌落,R,菌落,R,菌落,R,+,S,活的,活的,活的,活的,活的,死的,（二）技术上的三大发明,1.限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割,2.DNA连接酶的发现与DNA片段的连接,3.基因工程载体的研究与应用,一、基因工程诞生的理论基础,限制性核酸内切酶的发现与,DNA,的切割,1970,年,Smith,和,Wilcox,在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶,Hind,使,DNA,分子的切割成为可能,.,1972,年,Boyer,实验室又发现了名叫,EcoR,的核酸内切酶,.,后来陆续发现了大量类似于,EcoR,核酸内切酶，每种有各自独特的识别序列,.,这为基因工程提供了重要的技术基础,DNA分子,核酸内切酶,一系列不连续的片段,DNA,连接酶的发现与,DNA,片段的连接,1967,年,世界上有,5,个实验室几乎同时发现了,DNA,连接酶。,1970,年,美国的威斯康星大学,(Wisconsin University),的,Khorana,实验室又发现了,T4,噬菌体,DNA,连接酶,具有更高的连接活性。,1972,年底,人们已经掌握了好几种连接双链,DNA,的方法,使基因工程的创立又迈进了重要的一步。,13,基因工程载体的研究与应用,从,1946,年起，,Lederberg,开始研究细菌的,性因,子,F,因子。,到,20,世纪,60,年代，相继发现,其他质粒,，如,抗药,性因子,（,R,因子,）和,大肠杆菌素因子,（,CoE,）。,1973,年，,Cohen,将,质粒,作为基因工程的,载体,使,用。,这是基因工程诞生第三项技术发明。,二、基因工程的诞生,（一）基因工程诞生的背景,20,世纪,70,年代初期,有关基因工程的,理论,获得重大突破,.,基因工程的一些,相关技术,得到发展，并很快应用于基因,操作实验。,如：,外源,DNA,对感受态大肠杆菌细胞的转化技术,琼脂糖凝胶电泳技术,Southern,转移杂交技术等,无论在理论上还是技术上，都已经具备开展,DNA,重组的工作条件。,（二）基因工程的诞生,1972,年，美国斯坦福大学的,P.Berg,领导的研究小,组，在世界上第一次成功地实现了,DNA,体外重组,，,并因此与,W.Gilbert,及,F.Sanger,分享了,1980,年度的,诺贝尔化学奖,。,具体实验过程,酶切,酶切,T4,噬菌体连接酶,杂种DNA分子(SV40和,DNA重组),猿猴病毒SV40,噬菌体DNA,第一个重组体构建,18,1973,年,美国斯坦福大学的,S.Cohen,等人也成功地进行了另一个体外,DNA,重组实验,.,具体实验过程,R6-5质粒DNA,pSC101质粒DNA,EcoR,切割,T4,连接酶,重组DNA分子,转化,E.coli,转化子菌落表现出,双重抗性特征,注,:R6-5:编码有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌素质粒DNA。,Psc101：编码有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌素质粒DNA。,随后,S.Cohen,又与,H.Boyer,等人合作进行了一系列,实验。,具体实验过程,非洲爪蟾的编码核糖体 基因的DNA片段,Psc101,质粒,重组,导入,E.coli,非洲爪蟾的基因进入了,E.coli,细胞，并转录出相应的,mRNA,产物,基因工程发展史上,第一次,实现转化成功的例子。,基因工程从此诞生，这一年（,1973,年）被定位基因,工程诞生的元年。,三、基因工程的发展,基因工程的艰难阶段,基因工程的逐渐成熟阶段,基因工程的迅速发展阶段,1971,年,史密斯（,Smith H.O,.,）等人从细菌中分离出的一种,限制性酶,酶切病毒,DNA,分子，标志着,DNA,重组时代的开始。,1972,年,伯格（,Berg P,.,）等用限制性酶分别,酶切,猿猴病毒,和,噬菌体,DNA,，将两种,DNA,分子用,连接酶,连接起来,得到新的,DNA,分子。,1973,年,科恩（,Cohen S,.,）等进一步将酶切,DNA,分子与质粒,DNA,连接起来，并将,重组质粒,转入,E.coli,细胞中。,典型事件：,22,1982,年,美国食品卫生和医药管理局批准，用,基因,工程在细菌中生产人的胰岛素,投放市场。,1983,年,转基因,烟草和马铃薯,获得成功。,1994,年,延熟保鲜的,转基因番茄,商品生产。,1997,年,克隆羊,“多莉”,诞生,（苏格兰科学家利用,6,岁成年,母羊乳腺细胞）。,1998年,美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只,实验鼠,。,2000年,美国用无性繁殖技术克隆,猴子,“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。,2001年,美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的,人体胚胎,。,2003,年,5,月意大利宣布克隆成功,克隆马,“普罗梅泰亚”（世界上首次由哺乳动物生下它自己的克隆体，既是母女、又是姐妹关系）。,2003,年,12,月,美国德州,农业机械大学宣布,克隆,成功,白尾鹿,。,2005,年,12,月韩国,克隆狗,斯,努,皮,Snuppy,（中）。,第三节 基因工程研究的主要内容,一、基因工程的主要内容,基础研究,克隆载体的研究,受体系统的研究,目的基因的研究,生物基因组学研究,应用研究等,（一）,基础研究,自基因工程问世以来，基因工程的基础研究一直受到科技工作者的重视，主要包括：,构建一系列克隆载体和相应的表达系统,建立不同物种的基因组文库和,cDNA,文库,开发新的工具酶,探索新的基因工程新技术、新操作方法,27,（二）克隆载体的研究,1.研究克隆载体的意义,由于基因工程的发展与克隆载体的构建密切相关，因此，,构建克隆载体,是基因工程技术的,中心环节,。,（二）克隆载体的研究,2.研究成果,最早构建和发展的是用于原核生物的克隆载体，促,进了以,原核生物,为对象的基因工程研究的迅速发展,.,Ti,质粒的发现及,Ti,质粒衍生的克隆载体的成功构,建，使,植物基因工程,研究得到迅速发展。,动物病毒克隆载体的构建成功，使,动物基因工程,研,究取得进展。,29,（二）克隆载体的研究,3.今后的研究重点,构建新的克隆载体仍是今后研究的重要内容之一，尤其是构建适合于,高等动物,和,高等植物,转基因,表达载体,和,定位整合载体,。,（三）受体系统的研究,1.何谓受体,受体,是克隆载体的,宿主,是外源目的,基因表达的场所,。,2.用于基因工程的,受体,的分类,原核生物,真核生物,受体,31,原核生物,原核生物,大肠杆菌,是早期被采用的最好,受体系统,，几乎是现有一切克隆载体的,宿主。,建立了一系列,基因组文库,和,cDNA文库,，以及大量,转基因工程菌,，开发了一批已投入市场的,基因工程产品,。,大肠杆菌作为,受体,32,真核生物,酵母菌,是较早被用于基因工程受体的真核生物（酵母菌是十分简单的单细胞真核生物，基因组相对较小，有的菌株还含有质粒，便于基因操作）。,酵母菌作为,受体,建立了一系列,工程菌株，,不仅是外源基因（尤其是真核基因）,表达的受体,，而且是当前建立,人,和,高等动物,及,高等植物,复杂基因组文库,的,受体系统,33,真核生物,随着克隆载体的发展，高等动植物也用作基因工程的受体：,高等植物,用于基因工程受体的一般是高等植物的,愈伤组,织,、,细胞,和,原生质体,，也用,部分组织,和,器官,。,目前用于基因工程受体的,双子叶植物,有,拟南芥,、,烟草,、,番茄,、,棉花,等；,单子叶植物,有水稻,、,玉米,、,小麦,等，并且也获得了相应的转基因植物。,真核生物,高等动物,动物由于体细胞再分化能力差，目前主要以,生殖细,胞,和,胚细胞,作为基因工程受体，并获得了,转基因,鼠、鸡、鱼等动物,。,动物,体细胞,用于基因工程受体主要是为获得,系列转,基因细胞系,，或用于,基础研究材料,，,生产基因工程,药物,。人的体细胞同样可作为基因工程杂受体，获,得的转基因细胞系可用于,病理研究,和,基因治疗,。,（四）目的基因研究,1.什么样的基因可以称为目的基因,总的来说，基因工程研究的,基本任务,是,开发人们特殊需要的基因产物,，则相应的基因就称为,目的基因,。,具体来说，具有以下特征的可被称为目的基因：,具有优良性状的基因,致病基因,目前还不清楚其功能的基因,36,（四）目的基因研究,2.获得目的基因的途径,构建基因组文库和,cDNA,文库，从而筛选出目,的基因。,应用,PCR,技术直接从某生物基因组中扩增出需,要的基因。,对于较小的目的基因也可用人工化学合成。,37,（四）目的基因研究,3.目的基因的分类,第一类是与医药有关的基因,第二类是抗病虫害和恶劣环境,的基因。,第三类是编码具有特殊营养价,值的蛋白质或多态的基因。,38,近年来，基因组的研究工作越来越受到重视，人们试图搞清楚某种生物基因组的全部基因，为全面开发各种基因奠定基础。,1.,研究对象,以,整个基因组,为研究单位，而,不以单个基因,为单,位作为研究对象。,（五）生物基因组学研究,（五）生物基因组学研究,2.,研究目标：,认识,基因组的结构、功能和进化；,阐明,整个基因组所包含的遗传信息和相互关系；,充分,利用,有效资源，预防和治疗人类疾病。,3.重要组成部分：,基因组计划（genome project）大体上可分为：,构建,基因组的,遗传图谱,；,构建,基因组的,物理图谱,；,测定,基因组DNA的,全部序列,；,绘制,基因组的,转录本图谱,；,分析,基因组的,功能,。,基因组计划研究开始于1990年。,美国启动被誉为“人体阿波罗计划”的“,人类基因组,计划,”,，投资30亿美元，计划历时15年,测定,人类基因组的30亿个核苷酸对,的,排列次序,构建,高分辨率,的人类基因组遗传图谱和,物理图谱,发展,生物信息学。,人 类 基 因 组 计 划,2001,年,12,月,14,日，美、英等国科学家宣布绘制出,拟南芥,基因组的完整图谱。,基 因 组 研究的重大事件,在美国提出人类基因组计划后，,日本,等国和,中国,分别启动了“,水稻基因组计划,”。,2002,年,4,月,5,日,Science,刊登中国独立完成的,水稻基因组草图序列,，这是继人类基因组工作草图之后完成测定的最大基因组。,2005,年,完成全基因组精细图,。,水稻基因组的总基因数约为,3.84.0,万个,。,基 因 组 研究的重大事件,45,2002,年,12,月,21,日,Nature,发表中国独立绘制完成,粳稻基因组第四号染色体,精确测序图,。,第四号染色体中的,总碱基数目为0.35亿碱基对,，,覆盖了,该染色体全长序列,98,的区域，碱基序列的精确度达到,99.99%。完整测定,着丝粒序列,在高等生物中属于首次。,基 因 组 研究的重大事件,国际水稻（粳稻）基因组,计划始于1998年，,日、美、中、法,等国家和地区参加，,我国对测序计划的贡献率为20%,。,2005,年,8,月,10,日,，,Nature,宣布历时,6,年半的水稻全基因组测序完成,水稻,12,条染色体上,37544,个基因,的精确位置（遗传图谱），误差率,0.01%,是高等动植物中第一个完成着丝点测序。,基 因 组 研究的重大事件,国际水稻基因组测序计划,2004,年,3,月,1,日，,科学家宣布绘制完成首幅,禽鸟类,物,种的,基因组,序列草图,。,材料：,红原鸡（鸡的远祖）,。,完成单位：,中、美、德、英、瑞典、荷兰等。,水平：,总碱基数目约为10亿碱基对,，该序列草图与人类基因组序列进行了并列比较（由美国华盛顿大学负责）。同时完成一张鸡遗传差异图谱（由中科院负责），对红原鸡、肉鸡（英）、蛋鸡（瑞典）、乌鸡（中）进行序列差别分析。,作用：,鸡是研究,低等脊椎动物,和,人类等哺乳动物,的理想中介，因此在禽流感防治、改善家禽和人类健康等方面有明显应用价值。,49,（六）应用研究,基因工程应用研究涉及,医、农、牧、渔,等产业，与,环境保护,也有密切的联系。基因工程研究应用包括,药物研究,、,基因疫苗研究,、,转基因植物研究,、,转基因动物研究,以及,酶制剂工业,、,食品工业,、,化学与能源工业,等。,转基因,发光鱼,其中研究成果最显著的是基因工程药物和转基因植物研究，已取得了喜人的成果。,（六）应用研究,转基因烟草,荧火虫荧光素酶,51,二、基因工程基本操作程序（步骤）,从复杂的生物有机体基因组中，经过,酶切消化,或,PCR,扩增,等步骤，分离出带有,目的基因的,DNA,片段,。,在体外,将带有目的基因的外源,DNA,片段连接到能够,自我复制的并具有,选择记号的载体分子,上，形成,重,组,DNA,分子,。,将重组,DNA,分子转移到适当的,受体细胞,(,亦称寄主细,胞,),，并与之一起,增殖,。,52,从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组,DNA,分子的,受体细胞克隆,。,从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得,到扩增的,目的基因,，供进一步,分析研究使用,。,将目的基因克隆到,表达载体,上，导入寄主细胞，,使之在新的遗传背景下,实现功能表达,，产生出人,类所,需要的物质,。,二、基因工程基本操作程序（步骤）,53,基因工程的技术组合,第四节 基因工程的意义与发展前景,一、基因工程研究的意义,基因是控制一切生命运动的物质形式。,基因工程的本质是按照人们的设计蓝图，将生物体内控制性状的基因进行优化重组，并使其稳定遗传和表达。,因此：,大规模生产,生物活性物质,设计、构建生物的,新性状,甚至,新物种,分离、扩增、鉴定、研究、整理,生物,信息资源,概括地讲，基因工程研究与发展的意义体现在以下三方面：,分离工程,分离工程,基因工程,蛋白质工程,途径工程,工程细胞,发酵工程,细胞工程,生物活性物质,酶,野生细胞,野生细胞,酶工程,大规模生产生物活性物质,二、基因工程的发展前景,今后基因工程将重点研究：,基因组学,基因工程药物,动植物生物反应器,有关环保的基因工程,通过这些方面的研究、开发，对人类,生活质量,的全面,改善,、,健康水平,的全面,提高,、人类赖以生存的,环境,从根本上得到,优化,将做出巨大的贡献。,