第5章-基因工程载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,（,1,）在寄主细胞中能自我复制，即本身是复制子；,（,2,）容易从寄主细胞中分离纯化；,（,3,）载体,DNA,分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以像载体的正常组分一样进行复制和扩增；,（,4,）有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装；,（,5,）能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；,（,6,）用于表达目的基因的载体还应具有启动子（强启动子）、增强子、,SD,序列、终止子等。,作为基因工程所用的载体，需具有以下特性：,第一节质粒载体,质粒载体是基因工程重要的载体之一。它是以质粒DNA分子为基础构建而成，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA文库。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造，从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。,一、质粒的一般生物学特性,1.质粒的概念,质粒（plasmid）是存在于细胞质中的一类独立于染色体外的可自主复制的遗传成分，绝大多数质粒为共价闭合环状DNA（covalent closed circular DNA，cccDNA），少数是线性。质粒不仅仅存在于原核生物中，也存在于真核生物及其细胞器。除了酵母的杀伤质粒（killer plasmid）是一种RNA分子外，其它所有质粒均为DNA分子。,3.质粒DNA的复制,质粒的复制是受质粒和宿主细胞双重遗传系统的控制。环状质粒的复制主要有型复制和滚环复制两种形式。,根据质粒控制拷贝数的程度，质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。,严紧型质粒是一种低拷贝数的质粒，只在细胞周期的一定阶段进行复制，与染色体复制同步，当染色体不复制时，也不能复制。,松弛型质粒是一种高拷贝数质粒，在整个细胞周期中随时都可以复制，是独立于染色体进行复制的。,通常小质粒为松弛型质粒，大质粒为严紧型质粒。,在基因工程中，松弛型质粒更适合构建克隆载体。,4.质粒的命名原则,1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母“p”代表质粒（plasmid），在p字母后面用两个大写字母代表发现或构建这一质粒的作者或实验室名称，用数字代表构建的一系列质粒的编号。如pBR322就是按照这一标准命名的，其中“BR”则是分别来自该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的首字母。,二、理想质粒载体的必备条件,作为基因工程理想的质粒载体必须具备以下几个条件：,（1）具有复制起点，在宿主细胞中能自主复制。,（2）带有尽可能多的单一限制性酶切位点，以供外源DNA片段定点插入。,（3）具有合适的选择标记基因，为宿主细胞提供易于检测的表型特征。,（4）具有较小的分子量和较高的拷贝数。,1.pBR322质粒载体,1977年，F.Bolivar和R.L.Rodriguez 构建了一个典型的用于基因克隆的通用质粒载体pBR322质粒载体。目前使用广泛的许多质粒载体几乎都是由此发展而来的。,pBR322质粒DNA分子的大小为4363 bp，分子量为2.610,6,dal。具有ColEI松弛型复制子，在每个,E.coli,细胞中维持约20个拷贝。含有选择标记基因氨苄青霉素抗性基因（Amp,r,）和四环素抗性基因（Tet,r,）。现在已知pBR322 DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。,三、常用的质粒载体,由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：,（1）具有较小的分子量。,不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段。,（2）具有两种抗生素抗性基因，供作转化子的选择记号。可以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。,（3）具有较高的拷贝数。经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累10003000个拷贝，这为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,3.pUC质粒载体,1987年，美国加利福尼亚大学（University of California）的科学家J.Messing 和J.Viria在pBR322质粒基础之上构建了一种广泛使用的新型质粒载体即pUC系列质粒载体。包括PUC8/9、PUC18/19、PUC118/119等。,pUC系列的质粒载体通常是成对构建的，二者的差别仅在于多克隆位点的方向相反。设计这样一对质粒克隆载体，便于用限制性核酸内切酶切割产生的一个DNA片段以正、反两个方向插入克隆载体，保证DNA片段中基因的信息链与质粒克隆载体信息链连接，进行有效的表达。,一种典型的pUC系列质粒载体包括以下四个组成部分：,（1）来自pBR322质粒的复制起点（ori）；,（2）氨苄青霉素抗性基因（Amp,r,），但其核苷酸序列已经发生了变化，不再含原来的限制性核酸内切酶切割位点；,（3）大肠杆菌,-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码,-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ,基因；,（4）位于lacZ,基因中的靠近5,端的一段多克隆位点（MCS）区段，但它的存在并不破坏该基因的功能。,pUC质粒载体可以选出在克隆载体中已插入了外源DNA片段的重组子，这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选,pUC18质粒载体优点：,第一，具有更小的分子量和更高的拷贝数。,第二，适用于组织化学方法检测重组体。,第三，具有MCS区段。pUC18质粒载体具有与M13mp8噬菌体载体相同的多克隆位点MCS区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。,第二节 噬菌体载体,噬菌体（bacteriophage，简称phage）是一类细菌病毒的总称。利用重组DNA技术构建的以噬菌体为主体的载体，就是噬菌体载体。与质粒相比，噬菌体结构要复杂些，病毒颗粒主要由DNA（或RNA）和外壳蛋白质组成，其DNA分子上除了复制起点之外，还有编码外壳蛋白质的基因。噬菌体感染细胞比质粒转化细胞更为有效，而且噬菌体的克隆容量也明显大于质粒的。,一、噬菌体的生物学特性,噬菌体由遗传物质核酸及其外壳组成。噬菌体颗粒外壳是蛋白质分子，内部的核酸可能存在各种形式。,不同种类的噬菌体颗粒在结构上差别很大，可分为3种类型。大多数噬菌体是具尾部结构的二十面体，头部下端连接着一条尾部结构，看起来像是一种小型的皮下注射器，如T4噬菌体。另两种类型是无尾部结构的二十面体型和线状体型。,噬菌体的感染效率极高。一个噬菌体颗粒感染了一个细菌细胞之后，便可迅速地形成数百个子代噬菌体颗粒，每一个子代颗粒又各自能够感染一个新的细菌细胞，再产生出数百个子代颗粒，若是在琼脂平板上感染生长的细菌，则是以最初被感染的细胞所在位置为中心，慢慢地向四周均匀扩展，最后在琼脂平板上形成明显的噬菌斑，也就是感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的圆形透亮空斑,a 噬菌体增殖的第一步是吸附到寄主细胞上，同一个细胞可以同时吸附一个以上的噬菌体颗粒；,b 噬菌体的DNA注入到感染的寄主细胞内；,c 噬菌体DNA大量增殖；,d 子代噬菌体颗粒的组装；,e 寄主细胞溶菌，释放出大量的新的噬菌体颗粒；,f 噬菌体的DNA从寄主染色体DNA删除下来；,g 溶源性细胞通常按照正常细胞的速率进行分裂,噬菌体的生活周期有溶菌周期和溶源周期两种不同类型。其中把只具有溶菌周期的噬菌体称为烈性噬菌体（virulent phage）。把既能进入溶菌周期又能进入溶原周期的噬菌体称为温和噬菌体（temperate phage）。,、,噬菌体载体,噬菌体载体（,lambda phage vector,）是最早使用的克隆载体之一，构建,噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。同时，其也是迄今为止研究的最为详尽的一种大肠杆菌双链,DNA,噬菌体，在重组,DNA,的研究中有着相当广泛的应用。,外形特征类似于蝌蚪，由头和尾组成。头部呈等轴的20 面体，直径约54 nm，DNA被包裹在其中；尾部无尾鞘，长150 nm，主要由衣壳蛋白组成。,1噬菌体载体的生物学特性,噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。由DNA（DNA）和外壳蛋白质组成。噬菌体具有溶菌和溶源两条生长途径。,噬菌体DNA是一条线性双链DNA分子，长度为48502 bp。在其两端的5,末端各带有一个长为,12个碱基（序列为5,GGGCGGCGACCT3,）的单链互补黏性末端。一旦进入宿主细胞，黏性末端互补配对形成双链环状,DNA分子，这种由黏性末端结合形成的双链区段称为,cos位点,（cohesive end site）。随后环状DNA的两切口在宿主细胞的DNA连接酶和促旋酶的作用下，形成封闭的环状双链，充当转录的模板。,2.,噬菌体载体的构建,在基因工程中，噬菌体载体是最主要的一种载体。,然而野生型的噬菌体并不适于直接用作基因克隆的载体，必须对野生型DNA进行改造使之成为理想的基因克隆载体。,噬菌体基因组人为地划分为三个区域：,（1）左侧区，从基因A到基因J，包含外壳蛋白质的全部编码基因；,（2）中间区，介于基因J到基因N之间，这个区又称为非必需区，包含了一些与重组有关的基因，以及使噬菌体整合到染色体的int基因，和把原噬菌体从寄主染色体删除下来的xis基因；,（3）右侧区，位于N基因的右侧，包含全部的主要调节基因以及噬菌体的复制基因（O、P）和溶菌基因（S、R）。,对野生型的噬菌体的改造主要包括以下几个方面：,（1）去除DNA非必需区，增加承载外源DNA片段的容量。,（2）去除多余的限制酶切割位点，确定12个单酶切位点作为克隆位点。,（3）DNA的非必需区组入选择标记基因，以方便对重组子进行筛选。,噬菌体载体中主要利用噬菌体的生物学特性来做选择标记。主要有c I基因失活、Spi 筛选、lacZ 基因失活。,（4）建立重组的DNA分子的体外包装系统，高效的感染受体细胞。,3.,噬菌体载体种类,两种不同的类型：插入型载体（insertion vector）和置换型载体（replacement vector）。,置换型载体：允许外源 DNA 片段替换非必需DNA 片段的载体，称为置换型载体，又称取代型载体（subtitution vectors）。这类载体是在噬菌体基础上改建而成，由左臂、右臂以及左右臂之间的一段填充片段组成，其中左臂包含使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因，全长约20 kb；右臂包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因，这个区域约长12 kb；中间填充片段约长18 kb，这一段DNA可以被外源片段置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。置换型噬菌体是使用最广泛的载体。,插入型载体：通过特定的酶切位点允许外源 DNA 片段插入的载体称为插入型载体（insertion vectors）。由于 噬菌体对所包装的 DNA 有大小的限制，因此一般插入型载体设计为可插入6 kb外源DNA片段，最大11 kb。,插入型载体又分为两种类型：c I基因插入失活：在c I基因上有EcoR I及Hind III的酶切位点，外源基因插入后将导致c I基因的失活。c I基因失活后噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。利用不同的噬菌斑形态作为筛选重组体的标志。,Lac Z基因插入失活：在非必需区段引入lac Z基因，在Lac Z基因上有EcoR I位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝斑白筛选）。,4.柯斯质粒载体,柯斯质粒载体（cosmid vector）是一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体，也称为粘粒载体，即由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成。,（1）柯斯质粒载体的构成,柯斯质粒载体是一种环状双链DNA分子，大小为46 kb。它由4部分组成，包括质粒的复制起点、一个或多个限制性核酸内切酶的单一切割位点、抗性标记基因和噬菌体的黏性末端片段。来自DNA部分的片段除了提供cos位点，在cos位点两侧还具有与噬菌体包装有关的DNA短序列，这样就能够包装成有感染性的噬菌体颗粒。,（2）柯斯质粒载体的特点,目前已经在基因克隆通用的质粒载体的基础上，发展出了许多不同类型的柯斯质粒载体，柯斯载体的特点大体上可归纳成如下四个方面：,第一，具有噬菌体的特性。,第二，具有质粒载体的特性。,第三，具有高容量的克隆能力。,第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,（3）柯斯质粒载体克隆基因的基本程序,柯斯质粒载体具有质粒载体的性质，可以按照一般质粒克隆载体进行操作，转化宿主细胞，可在宿主细胞内进行自我复制。,第三节 其它载体,一、酵母载体,以重组DNA技术重新修饰构建的酵母作为载体，即酵母载体。目前，人们已构建了许多酵母质粒载体，根据质粒的复制方式不同，把它们分为几个不同的种类。,1.整合型载体(integrative yeast plasmid vectors，YIp）,复制型载体（yeast replicating plasmid，YRp）,着丝粒型载体（yeast centromere-containing plasmid或yeast centromere plasmid，YCp）,附加体型载体（又称游离型质粒，yeast episomal plasmids或yeast extrachromosomal plasmid，YEp）等。,以上几种类型的载体，它们共同的特点是：,（1）能在大肠杆菌中克隆，并且具有较高的拷贝数。,（2）含有在酵母中便于选择的遗传标记。,（3）含有合适的限制酶切位点，以便外源基因的插入。,整合型载体（,YIp,）,YIp,型载体比较简单，属于穿梭质粒、自我复制型载体，由大肠杆菌质粒和酵母的,DNA,片段构成的。,YIp,型载体含有,4,个主要部分：,多克隆位点；,抗氨苄青霉素基因 Ampr；,大肠杆菌复制起点；,尿嘧啶原养型基因Ura3+，在酵母菌第V染色体上有Ura3+的同源顺序，通过交换可将YIP整合到第V染色体中。,2.复制型载体（YRp）,YRp型载体是酵母的DNA片段插入到大肠杆菌质粒中构成的，其中酵母DNA片段不但提供了选择标记，还携带有来自酵母染色体DNA的自主复制顺序（ARS）。,YRp型载体既含有大肠杆菌的复制起始区和选择标记Amp,r,，又含有酵母的复制起始区和选择标记Leu,2+,。它可以转化大肠杆菌Amp,s,细胞，也可以转化酵母Leu细胞。该载体的这一功能是非常有用的。,3.附加体型载体（YEp）,YEp型载体是一种罕见的真核细胞质粒载体，一般由大肠杆菌质粒、2m质粒以及酵母染色体的选择标记构成。,YEp型载体pYF92就是由酵母的2m质粒、pBR322质粒和酵母的His,3+,(组氨酸)基因构成的。,由上可以看出，在使用酵母中的克隆载体时都存在着稳定性与拷贝数之间的矛盾。能稳定遗传的（YIp，Ycp）都是单拷贝，而拷贝数高的（YRp、YEp）又都不稳定。因此在基因操作中，要根据不同的使用目的进行选择和改造载体。,若在YRp型质粒中插入酵母染色体的着丝粒区，构成了酵母着丝粒型载体，由于着丝粒区的作用，这类载体在供体细胞中的行为类似染色体，能够稳定遗传，但以单拷贝存在，因此由供体细胞重新获得YCp质粒则比较困难。,酵母人工染色体（,YAC,）,YAC,是目前能克隆最大,DNA,片段的载体，可插入,100,2000 kb,的外源,DNA,片段。,Y AC,载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括,1,个复制起点序列、着丝粒和,2,个端粒。,二、人工染色体载体,2.细菌人工染色体（BAC）,细菌人工染色体（BAC）又称为F黏粒（fosmid），实际上是一种质粒载体，它与一般质粒载体的差别在于其复制单元的性质。每个BAC环状DNA分子中携带一个抗生素抗性标记（Cmr），一个来源于大肠杆菌F因子的严谨型控制的复制子oriS，一个促进DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE）以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因位点（parA，parB，和parC）,第四节 表达载体,根据表达所用的受体细胞，表达载体可分为原核细胞表达载体和真核细胞表达载体。,一、原核表达载体,在克隆载体的基础上，表达载体的构成特别强调与表达强弱相关的构成元件如启动子、终止子、核糖体结合位点等。,1.启动子,启动子位于转录起始点上游，是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列，是启动基因转录所必需的一段DNA顺式调控元件。没有启动子，基因就不能转录。,2.终止子,在,一个基因的3端或是一个操纵子的3端往往还有一特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为转录终止子（terminator）。在构建表达载体时，为了防止由于克隆的外源基因的表达干扰了载体系统的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的核糖体RNA的转录终止子。,3.核糖体结合位点,核糖体是蛋白质合成的场所，mRNA有效地翻译依赖于mRNA的稳定性及其与核糖体结合的能力。在原核细胞中，当mRNA结合到核糖体上后，翻译或多或少会自动发生，细菌在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。核糖体RNA的识别与结合位点。根据发现者的名字，将其命名为Shine-Dalgarno序列，简称S-D序列。,二、真核表达载体,将体外通过各种不同途径获得的目的基因重组到可以模拟真核蛋白活性的环境载体中，即构成真核表达载体。,真核表达载体的典型代表植物细胞的Ti质粒表达载体、昆虫细胞的杆状病毒表达载体和哺乳动物细胞的SV40病毒表达载体作一简要介绍。,1.Ti质粒的结构,Ti质粒（tumor inducing plasmid）存在于能够引起植物形成冠瘿瘤的土壤农癌杆菌中。这种肿瘤的形成是由Ti质粒决定的，故称为诱导肿瘤的质粒，简称Ti质粒。,（一）植物细胞的Ti质粒表达载体,Ti质粒为环状双链DNA，相对分子量为1.2108，大小为200250 kb。Ti质粒可分为4个区：,（）T-DNA区（transfer-DNA region），Ti质粒中能转移到植物细胞内的区域，称为T-DNA（transfer DNA），是Ti质粒最重要的组成部分。,（ii）毒性区（Virulence region，Vir），位于T-DNA区的上游的一个3040 kb的区域内，该区段编码的基因虽然并不整合进植物基因组中，但其表达产物可激活T-DNA向植物细胞的转移，这一个区域也称为致病区。,（iii）接合转移区（Region encoding conjucations，Con），该区含有与农杆菌之间接合转移有关的基因（tra），这些基因受宿主细胞合成的冠瘿碱激活，使Ti质粒在细菌之间转移。,（iv）复制起始区（Origin of replication，Ori），调控质粒的自我复制。,2.Ti质粒的改造,Ti质粒的T-DNA能够自发地整合到植物染色体DNA上，诱导植物形成肿瘤，是一种理想的天然植物基因工程载体。,T-DNA上的opine合成酶基因具有一个强的启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达，这都是Ti质粒作为载体的优点。但把它用作常规的克隆载体却存在以下缺陷：,一是Ti质粒上存在的一些对于T-DNA转移无用的基因使其片段过大，在基因工程中难以操作；二是天然Ti质粒上存在着许多限制内切酶酶切位点，难以进行DNA重组操作；三是T-DNA上Onc基因产物干扰宿主内源激素平衡，导致肿瘤，阻碍细胞分化和植物再生；四是Ti质粒没有大肠杆菌复制起点，不能在大肠杆菌中复制，限制了Ti质粒的应用。,基于以上原因，为了使Ti质粒适于基因工程的需要，必须对其进行改造：,保留T-DNA的转移功能；,取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株；,通过简便的手段可使外源DNA插人T-DNA之中，并随着T-DNA整合到植物染色体上。,3.Ti质粒表达载体,利用T-DNA可携带外源DNA片段并整合到植物基因组的特性，经对天然Ti质粒的改造，构建用于植物遗传转化的表达载体，分为一元表达载体和双元表达载体等类型。,（1）一元载体 研究发现，去除T-DNA区中的致瘤基因，仅保留其两边界及与T-DNA转移所必需的25 bp序列，造成T-DNA大段缺失可形成所谓卸甲的质粒，并在T-DNA上插人外源基因并不影响T-DNA的转移和整合功能。一元载体就是含目的基因的中间表达载体与改造后的受体（Ti质粒）通过同源重组所产生的一种复合型载体，也称为共整合载体。由于该载体的T-DNA区与Vir区紧密连锁，也称为顺式载体（cis-vector）。,（2）双元载体 双元表达载体由2个分别含有T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成，即微型Ti质粒（min-Ti plasmid）和辅助Ti质粒（helper Ti plasmid）。微型Ti质粒是含有T-DNA边界，缺失Vir基因的Ti质粒，同时还带有目的基因，选择标记基因和多克隆位点以及大肠杆菌和农杆菌的复制起始位点。双元载体不仅构建方便，而且其T-DNA整合进入植物细胞不需要带进许多冗余DNA序列，转化效率高于一元载体。,（二）昆虫细胞的杆状病毒表达载体,1.杆状病毒的生物学特性,杆状病毒（baculoviruses）属杆状病毒科，是家蚕等一些昆虫的病毒，其基因组为一双链闭合环状DNA，长度是80220 kb。每种杆状病毒的宿主范围很窄，专一性感染无脊椎动物，对脊椎动物和植物细胞无感染性。,病毒体内的一种高表达蛋白为P10蛋白，在细胞核内和浆内形成纤维网状，可能与细胞的溶解有关。P10蛋白基因和多角体蛋白基因都已被定位、克隆和测序，其启动子具有极强的启动蛋白表达能力，被用来构建杆状病毒转染质粒。,2.杆状病毒表达载体的构建,杆状病毒的基因组十分庞大，限制性核酸内切酶识别位点很多，其载体的构建策略是：在基础质粒（如pUC质粒）上插入多角体蛋白基因（或P10蛋白基因）及其两端侧翼，并在多角体蛋白基因启动子（或P10启动子）下游编码区产生缺失，去除编码序列，然后在此部位插入多克隆位点（MCS）用于外源基因的克隆，外源基因插入后形成重组杆状病毒克隆载体。,3.杆状病毒转移载体的构成基本元件,（i）启动子,包括4类：,即刻早期启动子，与病毒转录有关；,早期启动子，与病毒复制有关；,晚期启动子，控制病毒的组装；,非常晚期启动子，控制包含体的形成或细胞溶解。,（ii）polyA加尾信号。,（iii）同源重组序列。,（iv）穿梭载体必需元件。,4.杆状病毒表达载体的特点,（i）具有高等真核细胞内的蛋白质修饰、加工和转运体系；,（ii）AcNPV是非辅助病毒，不需要任何辅助因素，可在悬浮培养的昆虫细胞内大量增殖，易获得大量的重组蛋白；,（iii）大部分表达的蛋白质在昆虫细胞中能保持活性和可溶性，优于细菌；,（iv）杆状病毒的基因组较大（128 kb），适合克隆大片段外源基因；,（v）杆状病毒宿主范围很窄，不感染脊椎动物，其启动子在哺乳动物细胞中无活性，用它表达癌基因或毒性蛋白较安全。,（三）SV40病毒表达载体,当表达高等真核基因时，哺乳动物表达体系比昆虫表达体系显得更为优越。能够将目的基因置入哺乳动物细胞的载体，就是哺乳动物表达体系的载体，一般是病毒载体。在众多的病毒载体中，SV40表达载体是研究得最为详细、发展最快的一种。下面仅对SV40载体作简要介绍。,1.SV40病毒,SV40病毒是一种小型二十面体的蛋白质颗粒，由VP1、VP2和VP3三种病毒外壳蛋白构成，中间包装着病毒基因组DNA。SV40 DNA是双链闭合环状DNA分子，长度5243 bp。,根据SV40基因组表达的时间不同，可把它分为早期转录和晚期转录两个区域，以单一的EcoR I识别位点为0.0，将整个基因组分为10个区段。早期转录贯穿整个裂解循环，包括与病毒感染相关的t抗原基因（small T-antigen）和T抗原基因（large T-antigen）等，当三种病毒衣壳蛋白合成之后，即与新复制的病毒DNA装配成病毒颗粒，病毒由细胞释出，细胞崩解死亡,2.SV40病毒载体,野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小的重组DNA就不能被包装为成熟的病毒颗粒，如果在其DNA 上插入外源基因，则无法正常包装，用SV40作为载体有两种方式：,用SV40 DNA与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；,重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中,由于天然SV40病毒作为载体有诸多缺陷，实际上已很少使用。目前绝大多数实验室所使用的SV40载体都是经过改造的，通常只保留SV40的复制起始区和早期区域启动子以及多聚腺苷酸化位置和小t抗原的内含子。,本章小结,基因工程中的载体是基因克隆操作中的重要工具，能携带目的基因或DNA片段进入宿主细胞，其本质是DNA（少数为RNA）。,基因工程载体有克隆载体和表达载体之分，克隆载体主要用来克隆和扩增DNA片段，表达载体主要使外源基因在宿主细胞中进行表达。,基因工程载体必须具备以下特性：,（1）在寄主细胞中能自我复制，即本身是复制子。,（2）容易从寄主细胞中分离纯化。,（3）载体DNA分子中有一段不影响它们扩增的非必需区域，插在其中的外源基因可以象载体的正常组分一样进行复制和扩增。,（4）有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装。,（5）能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测。,（6）用于表达目的基因的载体还应具有启动子（强启动子）、增强子、SD序列、终止子等。,克隆载体主要有质粒载体、噬菌体载体、酵母载体、人工染色体载体等。常用的质粒载体有pBR322和pUC 系列载体等。噬菌体载体主要有温和性噬菌体和单链丝状噬菌体M13。噬菌粒载体由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成，可克隆长达10 kb的外源DNA片段。,表达载体根据表达所用的受体细胞可分为原核细胞表达载体和真核细胞表达载体。原核表达载体的表达元件主要包括启动子、转录终止子和核糖体结合位点，为此真核表达载体的开发已引起重视。真核表达载体主要有3种类型：改造过的质粒载体、整合载体和病毒载体。,思考题,以,pBR322,为例，论述质粒载体必须具备哪些条件？,描述,pUC18/19,的基本结构和特性。,试述,噬菌体载体是如何进行构建的？,比较不同类型的基因克隆载体有何不同？并举例说明（至少,4,种）,简述表达载体需要哪些基本元件？各有什么作用？,论述双元载体的概念及构建原理。,