基因工程基本流程筛选与鉴定优品文档.ppt

,*,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程基本流程筛选与鉴定,1,1.,抗药性筛选法,pBR322,质粒上有两个抗生素抗性基因,:,Tet,r,和,Amp,r,。,Tet,r,上有插入位点,BamH I,和,Sal I;,Amp,r,上有插入位点,Pst I,。,基于载体遗传标记的筛选与鉴定,原理：,2,3,4,（,1,）四环素：,（,2,）氨苄青霉素抗性基因：,pBR322,抗生素标记选择,产生,-,内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘,-,青霉素指示液（,I,2,-KI-Ampicillin,）（蓝灰色）褪色。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。,（,3,）环丝氨酸：,5,选择过程,如果在,Tet,r,上插入外源,DNA,，导致四环素抗性基因失活，可用,四环素加环丝氨酸,平板培养基选择重组克隆。,Tet,r,失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；,Tet,r,不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,（,1,）四环素抗性插入失活,6,无环丝氨酸培养基,7,（,2,）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,如果,Amp,r,上插入外源,DNA,，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘,-,青霉素指示液选择。,8,2.,-,半乳糖苷酶显色反应筛选法,-,半乳糖苷酶,乳糖,半乳糖,葡萄糖,X-gal,半乳糖,5-,溴,-4-,氯靛蓝,+,+,深蓝色,原理,载体,上有一段,-,半乳糖苷酶基因（,Lac Z,）的,片段（氨基端），其上有外源,DNA,的插入位点。,受体菌基因组,中有突变的,-,半乳糖苷酶基因（,片段缺失）。可以被,IPTG,诱导表达。载体和受体菌基因组可以,互补,形成完整有功能的,-,半乳糖苷酶。,9,选择过程,10,-,半乳糖苷酶使,X-gal,分解成蓝色产物。,11,3.,营养缺陷型筛选,法,原理,载体,能够合成某些生长必须营养成分，,受体菌基因突变,不能合成这种生长必须的营养物质。,在缺少该营养物质的培养板上涂布细菌，长出的菌落均含有载体的，是否重组子需进行第二轮筛选。,12,选择过程,营养缺陷型受体,营养合成型载体,13,4.,噬菌斑筛选法,原理,以,-DNA,为载体的重组,DNA,分子经体外包装后转染受体，转化子在培养板上形成噬菌斑。,取代型载体，噬菌斑即为重组子；,插入型载体需进行二次选择,14,选择过程,15,基于克隆片段序列的筛选与鉴定,1.PCR,鉴定法,原理：,针对已知目的片段特异性扩增。包括：区分重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目的片段是否整合在受体基因组上。,PCR,鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。,16,选择过程,1,）从重组克隆中提取质粒（或基因组,DNA,）,2,）用相应引物进行,PCR,反应,3,）电泳,PCR,产物,4,）检查是否有,PCR,产物,5,）,PCR,产物的长度是否与外源基因一致,原理图,p58,17,2.Southern blot,杂交,原理：,从宿主细胞中提取,DNA,（或质粒载体），再用特异性探针（与目的基因同源）进行核酸杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。,18,选择过程,Southern blot,流程,19,3.,菌落,/,噬菌斑原位杂交,原理：,特异性探针（与目的基因同源）进行的核酸,原位,杂交,20,探针的制备及标记，,p60,选择过程,21,4.R-,环检测法,原理：,DNA-RNA,杂交：,外源基因的,mRNA,与重组载体杂交,22,选择过程,在,70%,甲酰胺中，把,DNA,双链变性，复性的时候，,DNA-RNA,杂交分子比,DNA-DNA,双链更稳定。电镜下可见一种,R-,环形结构。,23,缺点：需要电镜,24,5.Northern blotting,原理：,从宿主细胞中提取,RNA,，再用探针杂交。,主要检测插入片断是否被转录。检测表达载体。,25,选择过程,Northern blot,流程,26,6.,直接电泳检测,原理：,有插入片段的重组载体分子量比野生型载体分子量大,27,选择过程,从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。,分子量,Marker,载体,重组,克隆,28,7.,限制性酶切图谱法,限制性酶切图谱：核酸经限制性内切酶消化成片段，用电泳方法分离，不同的核酸形成的各自独特的条带图谱。,29,在外源片段大小及限制性酶切图谱已知的条件下，选择一两种内切酶切割载体，电泳后比较电泳结果,(DNA,条带数目和分子大小）差异进行区分。,或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。,原理：,30,A,B,A,或,B,31,不同克隆的酶切结果,32,选择过程,33,8.DNA,序列测定,原理：,通过对插入片段序列的测定确定是否是所需的重组子,34,选择过程,双脱氧末端终止法,化学降解法,焦磷酸降解法,高通量,Solexa,测序,35,36,基于外源基因表达产物的筛选与鉴定,1.,蛋白质功能检测,原理：,外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应的检测方案,针对表达载体的检测方法,37,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二,抗结合蛋白,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,125,I,标记的二抗,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,固相支持滤膜,固相支持滤膜,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,125,I,标记的二抗,结合蛋白,125,I,标记的二抗,38,选择过程,弥补缺陷,转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。,his,-,his,+,受体菌：,外源基因：,在不含组氨酸的培养基中生长,39,例：小鼠的二氢叶酸还原酶（,DHFR,）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。,DHFR,载体,连接,转化受体菌,三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板,含,DHFR,的克隆才能生长,2),增加新性状,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,40,3),酶活性检测,针对外源基因表达产物是酶。,扩散免疫沉淀检测分泌型产物,原理：抗原,抗体凝集反应,方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,42,含DHFR的克隆才能生长,-半乳糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。,基于外源基因表达产物的筛选与鉴定,载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。,载体能够合成某些生长必须营养成分，,在70%甲酰胺中，把DNA双链变性，复性的时候，DNA-RNA杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。,探针的制备及标记，p60,使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。,受体菌基因突变不能合成这种生长必须的营养物质。,western blot过程,外源基因编码具有特殊功能的酶或活性蛋白，根据抗原抗体反应原理，针对该表达产物设计相应的检测方案,针对外源基因表达产物是酶。,（2）氨苄青霉素抗性基因：,（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程,主要检测插入片断是否被转录。,基于外源基因表达产物的筛选与鉴定,菌落/噬菌斑原位杂交,酶联免疫吸附测定（,ELISA,）,原理：,一抗（,primary antibody,）：与目标分子的特异结合。,二抗（,secondary antibody,）：与一抗的特异性结合。,酶连（,enzyme-linked,）二抗：,携带能催化无色底物转变为有色物质（或发光）的酶，再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。,43,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,酶,待测基因,产物蛋白,一抗,二抗,无色的底物,有色的产物,比色观察,酶,44,方法：,固定样品,一抗结合,二抗结合,显色,/,发光反应,比色,45,2.,放射免疫原位检测,利用抗体作为“探针”,原位,检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。,蛋白,蛋白杂交,原理：,46,方法：把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈”。,载体能够合成某些生长必须营养成分，,Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；,对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。,Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。,PCR鉴定法不适用于大规模转化子的鉴定。,抑制细菌生长，但不杀死细菌。,载体能够合成某些生长必须营养成分，,pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因:,酶连（enzyme-linked）二抗：,包括：区分重组子与非重组子、期望重组子与非期望重组子、目的片段是否整合在受体基因组上。,125I 标记的二抗,选择过程,47,3.western blotting,蛋白,蛋白杂交,原理：,选择过程,western blot,过程,48,多抗,Blotting,结果,单抗,blotting,结果,49,4.,蛋白凝胶电泳,待筛选克隆与非重组子同时进行蛋白质电泳，电泳结束后通过染色对比相应条带辨识重组子。适合受体蛋白表达种类较少，外源基因高效表达的体系。,原理：,50,选择过程,SDS-PAGE,，染色,不适于筛选,51,5.,转译筛选法,借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期。适用于,mRNA,转录丰度高的外源基因。,原理：,52,选择过程,mRNA,无细胞翻译系统,35,S,标记的,甲硫氨酸,翻译,35,S,标记的肽链,PAGE,电泳,放射自显影,比较放射性,带纹的位置,载体,+,外源,DNA,转录,与预期的产物分子量相符？,53,感谢观看,