反相高效液相色谱法测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量.pdf

2023年第36 卷第11期2.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥2 30 6 0 1)摘要：建立一种通过反相高效液相色谱-紫外测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量的方法。结果表明：方法的流动相为异丙醇-甲醇-水，且大豆磷脂酰胆碱在0.46 15 2.30 7 5mg/mL范围内线性关系良好(R=0.9977);方法的检出限为1.4mg/g、平均回收率为9 9.8%、相对标准偏差（RSD）为2.41%。方法的精确度高、重复性好,适用于大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量的测定。关键词：反相高效液相色谱；大豆；磷脂；磷脂酰胆碱Determination of phosphatidylcholine contentin soybean phospholipids by reversed phase highperformance liquid chromatography methodZHU Meng-nan,JIN Ri-sheng*,ZHANG Hua,YUAN Chuan-xun1,2(1.School of Food and Biological Engineering,Hefei University of Technology,Hefei 230601,Anhui,China;2.Engineering Research Center of Ministry of Education for Agricultural Products and Biochemistry,Hefei University of Technology,Hefei 230601,Anhui,China)Abstract:A method was established for the determination of phosphatidylcholine content in soybeanphospholipids by reversed phase high performance liquid chromatography with ultraviolet.The resultsshowed that the mobile phase of the method was isopropanol-methanol-water,the linear relationship ofsoybean phosphatidylcholine was good in the range of 0.461 5-2.307 5 mg/mL(R=0.997 7).Thedetection limit of the method was 1.4 mg/g,the average recovery rate was 99.8%,and the relativestandard deviation(RSD)was 2.41%.The method had high accuracy and good repeatability,and wassuitable for the determination of phosphatidylcholine content in soybean phospholipids.Key words:reversed phase high performance liquid chromatography;soybean;phospholipid;phos-phatidylcholine中图分类号：TS207.4磷脂酰胆碱(PC)是由亲水的磷酸脂基团和亲油的脂肪酸基团组成的两亲分子,因此具有很好的乳化性能,同时还具有调节血脂、降低胆固醇 1、强化脑部功能、增强记忆力 2 、调节脂肪代谢、防治脂肪肝的功效 3-41。因此,PC被广泛应用于食品、医药及化妆品等行业 5-6.收稿日期：2 0 2 2-12-0 6基金项目：安徽省科技重大专项（2 0 2 0 0 3a06020011)作者简介：朱梦男（19 9 2 一），女，硕士，研究方向为农产品加工。通信作者：金日生（19 8 2 一），男，博士，助理研究员，研究方向为农产品加工。粮食与油脂反相高效液相色谱法测定大豆磷脂中磷脂酰胆碱含量朱梦男，金日生?，张华，袁传勋 2（1.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽合肥2 30 6 0 1；文献标志码：A159文章编号：10 0 8-9 57 8(2 0 2 3)11-0 159-0 4目前PC含量的测定方法主要有紫外分光光度法 7 、薄层层析法 8 、核磁共振法 9 、红外光谱法 10 、高效液相色谱法11-12 、质谱分析法 13 等,其中高效液相色谱法灵敏度高、稳定性和重现性好，是检测PC最为有效的方法。而GB5009.272一2016食品安全国家标准食品中磷脂酰胆碱、磷脂160酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定中使用的流动相为正己烷-异丙醇-乙酸水的混合溶液，由于某些高效液相色谱仪的密封圈不耐正已烷,在使用该流动相时易受到限制。为解决该问题,本研究对国标方法中的高效液相色谱法进行改进，建立不含正已烷的反向高效液相色谱法测定大豆磷脂中PC的含量的方法。通过对流动相的分析选择，确定适宜的色谱分离条件,使PC与其他磷脂能有更好的分离度,以期能够准确定量分析大豆磷脂中PC的含量。1材料与方法1.1 材料与试剂大豆粉末磷脂，安徽元创科技有限公司;PC标准品（纯度9 2.3%），上海源叶生物科技有限公司；体积分数9 5%乙醇,分析纯；甲醇、异丙醇,色谱纯。1.2仪器与设备DHG型智能电热鼓风干燥箱，上海成顺仪器仪表有限公司;BSG-26电热恒温水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；Agilent-1260高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；EQ-500超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;RE-52CS-1型旋转蒸发器、SHB-I型循环水式多用真空泵，上海亚荣生化仪器厂；JA-2003分析天平，力辰仪器科技有限公司；TG16-WS离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。1.3试验方法1.3.1色谱分析色谱条件:Eclipse Plus Cis色谱柱（4.6 mm 250mm,5m）;柱温35;检测波长2 0 5nm;以异丙醇-甲醇-水作为流动相等度洗脱；流速0.5mL/min；进样量2 0 L。1.3.2标准系列溶液的配制1.3.2.1标准储备液的配制称取PC标准品适量,用10.0 mL甲醇溶解并定容至50.0 mL,得PC标准储备液（2.30 7 5mg/mL），密封后置于-2 0 冰箱保存备用。1.3.2.2标准工作曲线溶液的配制分别吸取PC标准储备液于10.0 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度线，配制成PC质量浓度分别为0.46 15、0.9 2 30、1.38 45、1.8 6 40、2.3075mg/mL的标准工作曲线溶液，通过0.2 2 m膜过滤，密封后置于-2 0 冰箱保存备用。1.3.3供试样品的制备粮食与油脂1.3.3.1样品前处理根据大豆PC易溶于低级醇，而其他磷脂几乎不溶于低级醇的特点,选用乙醇作为大豆PC的萃取剂;称取0.5g大豆磷脂粉末于圆底烧瓶中,加人体积分数9 5%乙醇溶液4.0 mL，以35萃取30min后，以6 0 0 0 r/min离心10 min；取上层清液先在温度为35的旋转蒸发仪上旋转蒸发，之后用氮气吹干，备用。1.3.3.2供试液的制备称取适量的乙醇提取物用5.0 mL甲醇溶解后倒人2 5.0 mL棕色容量瓶中,用甲醇定容至刻度线，通过0.2 2 m膜过滤，密封后于-2 0 保存备用。1.3.4方法验证根据GB/T274042008实验室质量控制规范食品理化检测建立校准曲线及校准曲线的工作范围。称取大豆磷脂样品，按照色谱优化后的方法，平行测定6 次,计算PC 的相对标准偏差（RSD），考察方法的重现性；根据大豆磷脂中PC的含量,按本底值的0.5、1.0、1.5倍3个水平，进行加标回收率测定，以回收率的高低评价方法的准确度。1.3.5实际样品的测定选取不同批次的大豆磷脂，按1.3.3.1的方法制备PC,按1.3.1的色谱条件进行液相色谱分析，计算不同批次大豆磷脂中PC的含量1.4统计分析采用 SPSS 软件对结果进行统计学分析(P0.05)。2结果与分析2.1流动相的选择高效液相色谱法在测定PC含量时，根据流动相的不同,色谱柱的选择可以分为正向色谱柱和反向色谱柱。反向色谱柱的流动相为甲醇-乙-水、氯仿-甲醇-水等，但氯仿-甲醇-水洗脱体系的缺点是氯仿有低紫外线波长的高吸收，在使用紫外检测器测定PC含量时会受到紫外吸收峰的影响。当异丙醇：甲醇：水体积比为6 4：2 6.4：9.6 时，大豆PC标准品和乙醇提取大豆PC样品的色谱图分别如图1所示。标准品和样品与其他磷脂在30 min内能较好分离,且基线比较稳定，峰型良好。另外，异丙醇的低紫外吸收比氯仿低，可以减少紫外吸收峰的干扰,并且异丙醇还具有改善峰型的作用。因此，本方法选取异丙醇-甲醇-水作为测定PC的流动相。2023年第36 卷第11期2023年第36 卷第11期05L02.2方法学验证2.2.1线性关系与检出限将质量浓度0.46 15 2.30 7 5mg/mL的标准溶液在最优流动相条件下测定。以PC峰面积为纵坐标,PC质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得到回归方程为y=1.432010*-1.468 310（R=0.9977),表明大豆PC在0.46 15 2.30 7 5mg/mL具有良好的线性关系。按照色谱仪3倍信噪比,得出本方法的检出限为1.4 mg/g。2.2.2相对标准偏差取同一质量浓度标准曲线溶液,按色谱条件重复进样6 次,PC的峰面积如表1所示。经计算PC峰面积的RSD为2.9 1%，表明仪器精密度良好。表1PC的峰面积测定次数峰面积111 932.2211 977.2311 644.6411 800.6511 070.8611 907.7粮食与油脂PC2.2.3重复性称取同一大豆磷脂样品6 份，测定样品中PC含量。大豆磷脂中PC含量如表2 所示。经计算PC含量的RSD为2.56%，表明该方法测定大豆磷脂中PC含量的重复性良好。表2 PC含量测定次数PC 含量/(mg/g)-1015时间/min（a）标准品PC1510图1色谱图16120251520时间/min(b）样品302530123456平均值RSD2.2.4回收率由表3可知:PC的回收率为9 6.6%10 4.0%。经计算PC回收率的RSD为2.41%，满足检测要求。因此,可以用该方法测定大豆磷脂中PC含量。表3大豆PC加标回收率（n=6)PC加PC本底PC测定PC 回标量/mg值/mg9.918.518.719.220.420.821.219.819.618.720.219.820.119.429.718.619.319.519.920.320.72.3实际样品测定用本方法对3批次大豆磷脂中PC含量进行测定。由表4可知：不同批次大豆磷脂中均检测出PC,且其含量相差不大,说明每批大豆磷脂中PC含量比较均匀，也说明该方法适用于大豆磷脂中PC18.519.819.619.418.818.719.12.56PC平均PC的值/mg收率/%回收率/%RSD/%27.997.028.0103.128.4101.029.8104.029.699.029.898.038.9100.537.698.539.6103.038.899.539.097.538.6101.047.698.348.4100.348.298.749.4103.448.797.349.196.699.82.41162含量的测定。表4大豆磷脂中PC的测定结果(n=3)样品编号PC含量样品118.6 0.30样品218.3 0.20样品318.5 0.403结论建立一种通过反相高效液相色谱-紫外测定大豆磷脂中PC含量的方法。结果表明：方法的流动相为异丙醇-甲醇-水，且大豆PC 在0.46 1 52.3075mg/mL范围内线性关系良好（R=0.9977)；方法的检出限为1.4mg/g、平均回收率为9 9.8%、RSD为2.41%。该方法的精确度高,重复性好,适用于大豆磷脂中PC含量的测定。本方法为大豆磷脂中PC 含量的准确分析提供参考。【参考文献1梁鹏，许艳萍，程文健，等大黄鱼鱼卵磷脂对小鼠脂质代谢的调节作用 J现代食品科技，2 0 16，32(11)：1-7.2 CHE H X,FU X Y,ZHANG L Y,et al.Neuroprotectiveeffects of n-3 polyunsaturated fatty acid-enriched phosphati-dylserine against oxidative damage in PC12 cells J.Cel-lular and Molecular Neurobiology,2018,38(3):657-668.【3】高燕，潘维恩，孟先志，等。水飞蓟宾-磷脂酰胆碱复合物联合还原型谷胱甘肽治疗飞行员脂肪肝 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