选修三-专题一1.2基因工程的基本操作程序.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,真核生物的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,与RNA聚合酶结合位点,前体信使RNA,成熟的信使RNA,第二节基因工程的基本操作程序,（一）获得目的基因,（二）构建基因表达载体形成重组DNA分子,（三）将目的基因导入受体细胞,（四）目的基因的检测与鉴定,基因工程的基本操作程序,鸟枪法：散弹射击法,供体细胞DNA,限制酶,许多DNA片段,载入,载,体,导入,受体细菌,扩增,产生特定性状,分离,目的基因,构建基因组文库并获得目的基因：,目的基因的mRNA,逆转录,单链DNA,合成,双链DNA（目的基因）,逆转录法,构建cDNA文库并获得目的基因,载入,载,体,导入,受体细菌,扩增,产生特定性状,分离,目的基因,蛋白质氨基酸序列,推测,mRNA的核苷酸序列,推测,结构基因的核苷酸序列（单链）,根据已知氨基酸序列直接合成,DNA,化学合成,人工合成,核苷酸序列已知，把将要合成的,DNA,序列,输入到,DNA,合成仪，用化学方法直接人工,合成,聚合酶链式反应,（,PCR,：Polymerase Chain Reaction),Kary B.Mullis,PCR是由美国科学家,穆利斯提出的一种,体外,简化条件下模拟DNA体内复制的,DNA,快速扩增的方法,，此技术获得1993年诺贝,尔化学奖。,PCR的反应体系,模板：DNA,原料：,四种 脱氧核苷酸；,酶：Taq酶（,TaqDNA聚合酶）,嗜热细菌中分离得到,引物：,DNA片段,Mg,2+,（维持酶活性所必需）,PCR缓冲液：,维持PH恒定，保护Taq酶,PCR反应过程可分为三步：,变性、退火、延伸,1变性,双链模板DNA解离为单链结构。（9095）,DNA,双链,DNA,单链,变性,2退火,引物与模板互补成双链。（,55,60）,(由于引物浓度高，序列短，所以易与模板结合。),PCR反应过程可分为三步：,变性、退火、延伸,引物,PCR反应过程可分为三步：,变性、退火、延伸,3延伸,在,Taq酶,作用下，合成特异DNA序列。,70,75,延伸,变性,第二次循环,退火,第二次循环,延伸,第二次循环,PCR反应曲线,理论上，PCR反应产物呈指数增长，但这种增长形式在扩增25-30个循环以后便放慢直至停止，达到反应平台。此时扩增产物量不再随循环次数的增加而呈指数增长。,PCR仪程序设定,PCR的应用,PCR具有省时、操作简便、特异性强、灵敏度高、效率高、应用范围广等特点。PCR技术在,分子生物学、医学和案件侦破,等领域得到广泛应用。,实例 1：,1、下列获取目的基因的方法中需要模板链是（）,A.从基因文库中获取目的基因,B.利用PCR技术扩增目的基因,C.反转录法,D.通过DNA合成仪利用化学方法人工合成,（二）基因表达载体的构建形成重组DNA分子,切割目的基因和质粒的限制酶是同一种限制酶吗？,同一种,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代，使目的基因表达和发挥作用。,（三）将重组DNA分子导入受体细胞,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,主要借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,导入方式：,（三）将重组DNA分子导入受体细胞,导入微生物细胞：,受体细胞：大肠杆菌,CaCl,2,细胞壁的通透性增大,重组质粒进入受体细胞,导入植物细胞：,土壤农杆菌转化法,基 因 枪 法：单子叶植物常用的一种基因转化方法，但成本较高。,花粉管通道法：十分简便经济的方法。我国的转基因抗虫棉就是用此方法获得。,将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,重组DNA提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,转基因动物,1.筛选含有目的基因的受体细胞,通过检测标记基因的有无，来判断目的基因是否导入受体细胞。,（1）抗药性筛选法：,菌株为某种抗生素缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如抗氨苄青霉素，抗卡拉霉素等）。,如何筛选出含有目的基因的受体细胞？,（这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。）,（四）目的基因的检测与鉴定,pBR322,质粒结构,如果外源DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活,标记基因,进行筛选,限制性内切酶,识别序列,外源基因连接,PSt,PSt,自主复制,（2）营养缺陷型筛选法：,载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质，构成营养缺陷。,如何筛选？,（在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是转化子。）,2.目的基因的表达,2.目的基因的表达,检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,分子水平,个体水平,目的基因成功表达的标志体现特定性状,检测性状,（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组DNA,用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）,方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,利用DNA分子杂交筛选含有目的基因的细菌克隆,检测方法：,DNA分子杂交技术,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,（4）鉴定（个体生物学水平）：,（2）检测目的基因是否转录出了mRNA,（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法,:,抗原抗体杂交,过程:,用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了,mRNA,思考：,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的,珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,