对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展.pdf

植物保护2 0 2 3,49(5):390 -398 庆祝植物保护创利6 0 周年专辑-一生物防治篇Plant Protection对半翅目害虫具有活性的B杀虫蛋白研究进展孙晓妮，曹蓓蓓，束长龙，耿丽丽，王泽宇，张杰*（中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害综合治理全国重点实验室，北京10 0 193）摘要半翅目害虫寄主范围广、危害时间长，给我国农林业生产带来了严重的经济损失。应用有效的绿色防控手段替代化学杀虫剂防治半翅目害虫，对于保障粮食安全生产、保护动物及人类生命健康、维护生态平衡具有重要意义。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis产生的杀虫蛋白对多种害虫展现出高效特异的杀虫活性，对非靶标生物安全，为全球农业、林业和卫生害虫的绿色防控做出了突出贡献。本文综述了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、危害特点及主要防治手段，重点归纳了Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性研究进展以及挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白基础，并针对Bt杀虫蛋白在半翅目害虫绿色防控方面的应用提出了建议。关键词半翅目；刺吸式口器；苏云金芽胞杆菌；杀虫蛋白；杀虫活性中图分类号：S433.3Advances in Bt insecticidal proteins against hemipteran pestsSUN Xiaoni，CA O Be i b e i，SH U Ch a n g l o n g，G ENG Li l i，W A NG Ze y u，ZH A NG Ji e*(State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Abstract Hemipteran pests have a wide host range and a long injury time,which have brought serious economiclosses to agricultural and forestry production in China.The application of effective green control means instead ofchemical insecticides to the control of hemipteran pests is of great significance for ensuring the safety of foodproduction,protecting animal and human life and health,and maintaining ecological balance.The insecticidalproteins produced by Bacllus thuringiensis(Bt)have shown high and specific insecticidal activity against a varietyof insect pests,and made outstanding contributions to the green control of agricultural insect pests around theworld.In this review,we summarized the species,injury characteristics,and main control methods of importanthemipteran pests in agriculture and forestry.We also summarized the research progresses in the insecticidalactivity of Bt insecticidal proteins against hemipteran pests and the basis for mining Bt insecticidal proteins againstHemiptera,and put forward reasonable suggestions for the application of Bt insecticidal proteins to hemipteranpest control.Key words Hemiptera;stinging and sucking mouthparts;Bacillus thuringiensis;insecticidal protein;insecticidal activity农作物病虫害的暴发为害对粮食安全构成严重威胁。全球每年因病虫害造成的损失约占作物总损失的35%，其中虫害损失占病虫害总损失的14%左右1-2 。农业生产中害虫种类繁多，半翅目刺吸式口器害虫已成为我国农作物面临的主要威胁之一，其不仅刺吸植物汁液，绝大多数种类还可传播植物病毒。半翅目的稻飞虱、小麦蚜虫是危害全国主粮生产最重要的两类害虫。稻飞虱主要危害水稻，一般稿日期：2 0 2 3-0 7-0 5修订日期：2 0 2 3-0 7-19基金项目：国家自然科学基金（32 2 7 2 6 2 6）*通信作者E-mail:3文献标识码：ADOI：10.16 6 8 8/j.z w b h.2 0 2 3338Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193,China)可造成水稻产量损失10%2 0%，严重时损失可达50%甚至绝收；小麦蚜虫在小麦生产过程中造成损失占比最高，达33.45%3。此外，蝽、木虱、粉虱等其他半翅目害虫为害棉花、果树、蔬菜等也造成严重经济损失。长期以来，半翅目害虫的防治主要依靠化学农药，然而此类害虫的生物学特性促使其对大多数化学杀虫剂均产生了抗性并长期维持在中等至高等水平4-5;同时，不科学地使用化学杀虫剂还带49卷第5期来了农药残留、食品安全等风险，也引发了环境污染、生态失衡等问题。目前，农业害虫绿色防控中通常选用微生物杀虫剂替代化学杀虫剂来控制靶标害虫，其中应用最广泛当属以苏云金芽胞杆菌Bacillusthuringiensis(Bt)为基础的微生物杀虫剂和转Bt基因作物。本文系统地梳理了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、为害特点以及主要防治手段，重点归纳了国内外来源于苏云金芽胞杆菌的杀虫蛋白对半翅目害虫杀虫活性的研究进展，总结了挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白的基础,并提出了Bt杀虫蛋白应用于半翅目害虫防治的建议。1半翅目害虫的为害与防治半翅目Hemiptera 是昆虫纲不完全变态类昆虫中数量最多的目，目前已知物种数量约10.4万种6 。此类昆虫个体小、繁殖能力强、种群数量大、寄主范围广，绝大多为植食性，通过刺吸式口器刺吸植物汁液直接引起植物组织坏死，其取食和产卵过程中产生的机械损伤，分泌的水解酶等化学物质以Table 1 Damages and control of major hemipteran insect pests in China种类害虫名称SpeciesPest name褐飞虱Nilaparvata lugens飞虱类白背飞虱SogatellafurciferaPlanthoppers灰飞虱Laodelphar striatellus荻草谷网蚜Sitobionmiscanthi禾谷管蚜Rhopalosiphumpadi蚜虫类麦二叉蚜 SchizaphisgraminumAphids棉蚜Aphisgossypii桃蚜Myzuspersicae温室白粉虱Trialeurodesvaporariorum粉虱类黑刺粉虱AleurocanthusspiniferusWhiteflies烟粉虱Bemisiatabaci绿盲蝽Apolyguslucorum中黑盲蝽Adelphocoris suturalis蝽类茶翅蝽Hal yomorpha hal ysStinkbugs荔枝蝽Tessaratomapapillosa菜蝽Eurydemadominulus大青叶蝉Cicadellaviridis黑尾叶蝉Nephotettircincticeps叶蝉类Leafhoppers木虱类Psyllids孙晓妮等：对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展表1我国主要半翅目害虫的危害与防治主要寄主Primary host水稻水稻水稻、玉米小麦、大麦小麦小麦、大麦棉花、瓜类梨、桃等果树，十字花科蔬菜茄果类蔬菜，果树、花卉等作物柑橘、梨等果树茄果类蔬菜，果树、花卉、棉花等作物刺吸汁液、传播病毒棉花，桑、枣等果树棉花、甜菜、大豆等梨、苹果、桃等果树荔枝、龙眼等果树十字花科蔬菜杨、柳等林木、果树水稻、菱白、小麦等电光叶蝉Maiestasdorsalis水稻、玉米、高梁等二点叶蝉Cicadulafascifrons草坪草、水稻、小麦等梨木虱Cacopsylla chinensis梨等果树柑橘木虱Diaphorina citri柑橘、柚子等果树梧桐木虱Carsidaralimbata梧桐、楸树、梓树等林木391及排泄至茎秆或叶片表面的“蜜露”使得霉菌更易滋生，间接抑制了寄主植物的呼吸和光合作用7，甚至一些类群还可传播多种植物病毒引起植物病毒病，导致作物的产量降低与质量下降，是世界上最重要的农林害虫种类。1.1我国主要半翅目害虫及其危害我国农业生产中重要的半翅目害虫包括飞虱、蚜虫、粉虱、蝽、叶蝉和木虱（表1),严重威胁了我国主粮作物、经济作物以及设施农业蔬菜等的安全生产。1)飞虱：主要为稻飞虱，是水稻上主要的刺吸式口器害虫，包括褐飞虱Nilaparvatalugens、白背飞虱 Sogatella furcifera和灰飞虱Laodelpha stri-atellus。稻飞虱在我国年均发生面积16 0 0 万hm左右（数据来源 https:/ 万15万t，其中褐飞虱、白背飞虱被列入农业农村部一类农作物病虫害名录。2)蚜虫：主要包括荻草谷网蚜Sitobionmiscanthi、禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi、麦二叉蚜 Schizaphis grami-num、棉蚜Aphisgossypi、桃蚜Myzuspersicae，为害小麦、大麦等禾本科作物，棉花，瓜类，梨、桃等果危害方式Damage mode刺吸汁液刺吸汁液、传播病毒酸酯类、有机磷类以化学杀虫剂为主，主要为新烟碱类、有机磷刺吸汁液、传播病毒类、菊酯类、氨基甲酸酯类、大环内酯类及吡啶杂环类以化学杀虫剂为主，主刺吸汁液要有新烟碱类、菊酯类、大环内酯类及几丁质合成抑制剂以化学杀虫剂为主，主要为有机磷类、菊酯类、刺吸汁液氨基甲酸酯类及新烟碱类刺吸汁液、传播病毒以化学杀虫剂为主，主刺吸汁液要为新烟碱类、氨基甲刺吸汁液酸酯类、有机磷类刺吸汁液、传播病毒以化学杀虫剂为主，主要刺吸汁液为有机磷类、新烟碱类、菊酯类及大环内酯类防治方法Control method以化学杀虫剂为主，主要为新烟碱类、氨基甲392树以及十字花科蔬菜。蚜虫全国发生面积约130 0万hm,其中禾谷缢管蚜、麦二叉蚜被列入农业农村部一类农作物病虫害名录。3)粉虱：设施蔬菜上最重要的农业害虫之一，主要有温室白粉虱Trialeu-rodes vaporariorum、黑刺粉虱 Aleurocanthusspiniferus和烟粉虱Bemisia tabaci。其中烟粉虱被称为“超级害虫”被列为最危险的10 0 种入侵物种之一E8。4)蝽：常见种类包括绿盲蝽Apolyguslucorum、中黑盲蝽Adelphocoris suturalis、茶翅蝽Halyomorpha halys等，主要为害棉花、果树以及十字花科蔬菜等。5)叶蝉：半翅目中最大的类群，主要包括大青叶蝉Cicadellauiridis、黑尾叶蝉Nepho-tettixcincticeps、电光叶蝉Maiestasdorsalis，主要寄主为水稻、小麦、玉米和林木等。6)木虱：包括梨木虱Cacopsylla chinensis、柑橘木虱Diaphorinacitri、梧桐木虱Carsidaralimbata，为害我国梨、柑橘等果树和梧桐等林木，其中柑橘木虱是柑橘重要病害黄龙病的传播者。1.2半翅目害虫的防治及其存在问题长期以来，半翅目害虫的防治主要由化学杀虫剂主导，以新烟碱类、有机磷类、菊酯类等类型为主，常用品种包括吡蚜酮、吡虫啉、噻嗪酮等。化学农药能在害虫大面积暴发时快速发挥作用，挽回损失，在保障我国粮食供应方面发挥了关键作用。然而，由于蚜虫、粉虱、飞虱等半翅目害虫具有种群数量大、繁殖速度快、适应性极强等生物学特点，长期滥用化学杀虫剂进行防治已造成害虫抗药性不断上升。目前褐飞虱、灰飞虱、棉蚜、烟粉虱等多数重要半翅目害虫已对多种常规化学农药产生较高抗性9-10 。灰飞虱已对毒死蜱、吡虫啉、氟虫腈、噻嗪酮和乙虫腈分别产生了中到高等水平抗性，如对溴氰菊酯的抗性水平高达10 7 2 倍11；棉蚜对呋虫胺、噻虫嗪、啶虫、噻虫胺、吡虫啉和噻虫啉6 种新烟碱类杀虫剂产生了较高水平的抗性，其中对啶虫、噻虫胺、吡虫啉和噻虫啉的抗性倍数最高，分别达2 6 8 2、13756、1542 倍和1393倍12 。除了化学防治外，其他防治手段也在半翅目害虫综合防治中发挥了一定的作用。抗虫品种选育是农业防治中主要策略之一，目前已经选育出的对稻飞虱有效的水稻品种包括ASD7IR36Mudgo“梗8 9”等，抗蚜虫大豆品种有吉科豆1号”吉农9号等。但是，传统育种比较困难，周期又长，因庆祝植物保护创利6 0 周年专辑一生物防治篇此通过应用抗性作物品种进行半翅目害虫的防治面临巨大挑战。此外，稻虱缨小蜂Anagrus nilapar-vatae13、烟蚜蜂Aphidius gifuensis14等寄生性天敌昆虫与异色瓢虫Harmoniaacyridis14、黑肩绿盲蝽Cyrtorhinuslividipennis15等捕食性天敌昆虫在国内的半翅目害虫防治上也有所应用，但优良天敌昆虫品种选育艰难，且其工厂化繁育、打破滞育等问题仍然困扰天敌昆虫大规模商业化。目前已有少量生物源杀虫产品应用于半翅目害虫的防治，如微生物农药金龟子绿僵菌Metarhiz-iumanisopliae CQMa421、球孢白僵菌Beauveriabassiana 以及植物源农药印楝素等16-19，然而这些屈指可数的生物农药并不能满足半翅目害虫为害日益严重的防治需求。2苏云金芽胞杆菌当前,我国农作物的病虫害防治在“预防为主、综合防治”基础上，推行“绿色防控、生态治理”，寻找绿色安全高效的防治手段、减少化学农药使用量现已成为全社会关注的热点。苏云金芽胞杆菌(Bt)是迄今为止生物防治中应用最成功的昆虫病原细菌。此类细菌绝大多数天然存在于全球各地土壤中，现已从土壤、水、昆虫尸体、植株根系及叶片等环境中分离获得。Bt因其在整个生命周期中产生不同类型的杀虫物质而闻名于世，其在芽胞形成期产生具有多种形态的伴胞晶体蛋白一Cry蛋白（crystalprotein)和Cyt蛋白（cytolytic protein)，在营养生长阶段还可合成并分泌营养期杀虫蛋白Vip(vegeta-tive insecticidal protein）以及分泌型杀虫蛋白Sip(secreted insecticidal protein)。目前 Bt 制剂与转 Bt基因植物已成功应用于鳞翅目、鞘翅目等咀嚼式口器害虫的防治。然而，典型的Bt杀虫晶体蛋白对半翅目刺吸式口器害虫的杀虫活性较低，尚无商业化应用的先例。2 0 18 年以来，国内外研究人员才陆续发现多个对飞虱、蚜虫等半翅目害虫有较高杀虫活性的新型Bt杀虫蛋白2 0-2 3,这些杀虫蛋白基因有望开发转Bt基因植物用于半翅目害虫的防治，标志着稻飞虱等半翅目害虫的绿色防控取得了突破性进展。2.1苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白Bt杀虫蛋白种类多，对多种农业害虫、线虫及不同来源的人类癌细胞均具有生物活性。这些杀虫202349卷第5期蛋白对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等农林业重要害虫以及一些线虫、原生动物和螨虫具有高效特异的毒杀作用2 4。最初，Bt杀虫蛋白依据杀虫谱的不同分为CryI、Cr y、Cr y、Cr y I V 类；1998 年，修订的四级命名系统将Bt杀虫蛋白按照氨基酸相似性程度进行分类2 5。随着基因组测序技术与蛋白质结构解析技术的发展与更新，细菌杀虫蛋白命名委员会根据蛋白结构特征（如three-domain，T o x in _1o/Bin-like，Etx _M tx 2 等)并结合先前的四级命名系统，将细菌杀虫蛋白重新定义了17 个类型2 5,更好地反映了杀虫蛋白种类与杀虫作用方式的多样性。截至2023年6 月，细菌杀虫蛋白质资源中心已命名并公布了10 7 5个Bt杀虫蛋白（数据来源https：/www.bpprc.org），涵盖了17 类细菌杀虫蛋白中的10 个类型2 5:1)Cry(mnemonic retained for three-domainproteins)：由3个核心结构域组成，也称之为 3D-Cry蛋白(three-domain Cry protein)。Cr y 蛋白是Bt最主要的杀虫活性成分，多达7 55种；2)Mpp(pesticidal proteins with homology to the Etx_Mtx2family）：与Etx_Mtx2家族同源的杀虫蛋白，已命名32 种；3)Tpp(pesticidal proteins with ho-mology to the Toxin_10/Bin family):与 Toxin_10/Bin家族同源的杀虫蛋白，已有30 种;4)Gpp(pesti-cidal proteins with homology to the aegerolysins):与溶血酶（aegerolysins）同源的杀虫蛋白；5）App(pesticidal proteins with a predominately alpha hel-ical structure)：主要具有-螺旋结构的杀虫蛋白;6)Cyt(mnemonic retained for Cyt related proteins):溶细胞毒素相关的蛋白，已公布44种；7)Vip(mne-monic retained for Vip3 related proteins):Vip3 蛋白家族，多达131种;8)Vpa(pesticidal proteins re-lated to Vip2 catalytic component):与 Vip2 催化组分相关的杀虫蛋白;9）Vpb（p e s t i c i d a l p r o t e i n s r e-lated to the binding partner of the Vipl/Vip2 bina-rytoxin）：与二元毒素Vipl/Vip2结构相关蛋白；10)Xpp(a holding name for pesticidal proteins withcurrently unclassified homology groups)：目前未分类的同源杀虫蛋白家族。Bt蛋白的杀虫作用机理研究主要集中于3D-Cry蛋白，以CrylA蛋白对鳞翅目幼虫的“顺序结合”模型为代表。然而，对半翅目害虫有高活性的Bt杀虫蛋白近几年才陆续发现，其杀虫机制尚未明确。孙晓妮等：对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展3932.2Bt制剂与转Bt基因作物的应用Bt菌株通过发酵生产制成微生物杀虫剂产品，此类制剂具有靶标特异性、对非靶标生物几乎无副作用等特点。1938 年，全球首个Bt杀虫制剂Spo-rine在法国问世，主要用于防治地中海粉Ephes-tiakuehniella。随着基因工程技术的迅猛发展，研究人员开发出杀虫谱广、杀虫毒力高的第二代Bt杀虫剂，如我国第一个Bt工程菌G033A及其产品2 6 。Bt制剂一般为喷雾剂、粉剂、颗粒剂等，可在农田、温室、空中以及水生环境使用，对农作物以及观赏植物上的害虫具有良好防效。Bt制剂在全球生产应用已有8 5年，迄今为止登记产品数量达2 49 个（数据来源http：/w w w.c h i n a p e s t i c i d e.o r g.c n/），成为应用最成功的微生物杀虫剂。随着现代生物技术在农业方面的迅猛发展，全球转基因作物的种植面积急剧增加。自19 9 6 年开始种植以来，目前已有包括玉米、棉花、马铃薯、大豆、水稻、甘蔗、白杨、豇豆、番茄和茄子在内的10 种植物2 7 0 多个转Bt基因品种或品系在全球范围内批准商业化种植（数据来源https：/w w w.i s a a a.org/gmapprovaldatabase/）。转Bt基因抗虫作物面积在全球种植面积达1亿hm,这些Bt杀虫基因主要被用于增强作物对鳞翅目和鞘翅目害虫的抗性，包括crylA、c r y 1C.c r y 1F、c r y 2 A、c r y 3A、c r y 3Bb l、cry9C、c r y 34A b 1/c r y 35A b l和vip3A。此外，已商业化的抗半翅目的转Bt基因作物仅有一例，即孟山都公司开发的表达Cry51Aa2突变蛋白的转Bt基因棉花用于防治半翅目豆荚草盲蝽Lygus hesperus和美洲牧草盲蝽Lyguslineolaris27。3对半翅目害虫有活性的Bt杀虫蛋白据统计,共计2 2 种Bt杀虫蛋白对半翅目害虫展现出不同程度的杀虫活性（图1），这些蛋白依据结构特征可分为3D-Cry、Cy t、M p p、T p p 等4大类。3.1 3D-Cry 蛋白目前，已报道了9 种3D-Cry蛋白对蚜虫、飞虱、木虱等具有杀虫活性，其中绝大多数3D-Cry蛋白对半翅目害虫的毒性处于较低水平。1995年，Walters等测试了3D-Cry蛋白对蚜虫的杀虫活性，发现2 0 0 g/mLCry2Aa蛋白对马铃薯长管蚜Macrosiphum euphorbiae成虫7 2 h的致死率为92%，同样条件下36 0 g/mLCry3A,350g/mLCry11A394庆祝植物保护创利6 0 周年专辑生物防治篇2023Cry1AbCrylAc豌豆蚜Cry1BaAcyrthisiphon pisumCry1Cb23D-CryCry2AaCry3ACry4ACryl1ACry73BalCytlAaCyMpp51Aa2MppMpp64Ba/CaTpp78AalTpp78Ab1Tpp78BalTpp78Bb1Tpp78CalTppTpp78DalTpp80Aa3Tpp80AclTpp78Ad1Tpp78Ael红色箭头：蛋白对靶标害虫的LCso10g/mL，表示高水平杀虫活性；橙色箭头：蛋白对靶标害虫的LCso介于10 10 0 g/mL，表示中等水平杀虫活性；黑色箭头：蛋白对靶标害虫的LCso100g/mL或仅测定了高蛋白浓度(2 0 0 g/mL)下的害虫致死率，表示低水平杀虫活性；蓝色箭头：蛋白对靶标害虫表示仅存在体重抑制活性，表示无杀虫活性。Red arrow:The LCso value of the protein against the target insect pest 10 g/mL,indicating a high level of insecticidal activity;Orange arrow:TheLCso value ranging from 10-100 g/mL indicates moderate insecticidal activity;Dark arrow:LCso 100 g/mL or only the mortality of the insect at highprotein concentration(200 g/mL)is measured,indicating low level of insecticidal activity.Blue arrow indicates only weight inhibition activity of theprotein against the target pest,or no insecticidal activity.蛋白对马铃薯长管蚜成虫的致死率分别仅为52%、64%28。2 0 0 9年，Porcar等发现高浓度的Cry1A、Cry3A、Cr y 4A、Cr y l 1A 对豌豆蚜Acyrthosiphonpisum若虫有一定程度的致死作用,经胰蛋白酶活化后这些Cry蛋白的杀虫毒力有所增强；蛋白浓度为50 0 g/mL时，Cryl1A、C r y 4A 对豌豆蚜致死率可达10 0%，Cry3A蛋白的致死率为6 0%，而CrylAb致死率仅为2 5%；进一步测定发现，Cry4A对豌豆蚜的致死中浓度（lethal concentration 50，LCso)为7 0 10 0 g/mL29。随后2 0 11年,Li等测试了浓度为50 0 g/mL的CrylAc对豌豆蚜2 龄若桃蚜Myzus persicae马铃薯长管蚜Macrosiphumeuphorbiae柑橘木虱Diaphorina citri豆荚草盲蝽Lygus hesperus褐飞虱Nilaparvata lugens白背飞虱Sogatellafurcifera灰飞虱Laodelphax striatellus图1对半翅目害虫有杀虫活性的Bt杀虫蛋白Fig.1Bt proteins with insecticidal activity against hemipteran pests虫的杀虫活性，蛋白处理后7 d豌豆蚜的死亡率接近71%30。2 0 13年,Shao等发现Cry1Ab原毒素对褐飞虱3龄若虫的LCso为190.2 3g/mL31，处于低水平杀虫活性。2 0 14年,Palma等报道了与Cry41Aa氮基酸序列一致性约40%的Cry41Aa-like蛋白（新命名法命名为Cry73Bal)对桃蚜2 龄若虫表现出中等毒性，LCso为32.7 g/mL32。最近5年，仅有3篇关于Cry1类蛋白对半翅目害虫杀虫活性的报道。2 0 18年,Shao等发现CrylAc原蛋白或胰蛋白酶激活的CrylAc蛋白对褐飞虱2 龄若虫的死亡率较低，LCso分别为198.92 g/mL和 450.18 g/mL33。2 0 19 年,49卷第5期Fernandez-Luna等研究发现CrylAb及CrylBa活化毒素对亚洲柑橘木虱成虫有杀虫活性,LCso约为120 g/mL34。2 0 2 2 年,Torres-Quintero 等发现 Bt菌株GP919在浓度为10 g/mL时对桃蚜若虫的致死率为8 0%以上,LCso为9.0 1g/mL;进而研究人员发现,该菌株中胰蛋白酶处理后的 Cry1Cb2(约6 5kD)对桃蚜若虫的 LCso为6.58 g/mL,这是首次报道 3D-Cry蛋白对半翅目刺吸式害虫具有较高水平的杀虫活性2 3。3.2细胞裂解杀虫蛋白(Cyt)对半翅目害虫具有杀虫活性的Bt细胞裂解杀虫蛋白(Cyt)研究较少，迄今仅有Porcar等测试了125g/mL的Cyt1Aa会对桃蚜若虫产生体重抑制活性,体重抑制率为40%2 9。3.3 Etx_Mtx2类杀虫蛋白(Mpp)迄今为止，已有来源于苏云金芽胞杆菌的Mpp家族蛋白Mpp51Aa2以及二元毒素Mpp64Ba/Mpp64Ca对几种盲蝽或者飞虱具有中等至高等水平杀虫活性的报道。2 0 12 年，Baum等发现Mpp51Aa2对棉花害虫豆荚草盲蝽的LCso为7 2.9g/mL35。孟山都公司开发的表达Cry51Aa2.834_16蛋白（突变改造的Cry51Aa2)的转基因棉花现已被批准应用于豆荚草盲蝽和美洲牧草盲蝽的防治，田间种植可有效控制盲蝽种群，这对于保护棉花免受盲蝽的取食危害具有重要的里程碑意义。随后2 0 18 年，本团队的Liu等从野生菌株Bt1012中获得了国际上第一个对稻飞虱有高毒力的二元毒素Mpp64Ba/Mpp64Ca,该蛋白组合对白背飞虱、灰飞虱3龄若虫的LCso分别为2.14和3.15g/mL201，自此国内关于对稻飞虱高活性的Bt杀虫蛋白的研究翻开了新的一页。3.4Toxin_10 类杀虫蛋白(Tpp)对半翅目害虫具有较高毒力的Bt杀虫蛋白主要属于Toxin_10类蛋白家族，共10 种，占Tpp家族Bt杀虫蛋白总数的三分之一。这10 种Tpp杀虫蛋白均由本团队发现、鉴定，目前均已获得命名，其杀虫活性测试的靶标害虫主要为稻飞虱。2 0 18 年，本团队从Bt野生菌株C9F1中克隆获得了新型Bt杀虫蛋白一Tpp78Aal,经测试Tpp78Aal蛋白对灰飞虱和褐飞虱均展现出较高的杀虫活性，LC5o分别为6.8 9g/mL和15.7 8 g/mL21。T p p 7 8 A a l 蛋孙晓妮等：对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展白的发现奠定了基础。4.1建立稳定的半翅目害虫室内杀虫活性测定体系与鳞翅目、鞘翅目等咀嚼式口器昆虫不同,测定半翅目害虫室内杀虫活性具有一定难度，因此建立高效稳定的半翅目害虫室内杀虫活性测定体系对于挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白具有重要意义。半翅目害虫具刺吸式口器，室内杀虫活性测定需采用人工液体饲料喂食。一方面，蚜虫、飞虱、粉虱等半翅目害虫对人工液体饲料的酸碱性、盐离子浓度十分敏感，过酸或过碱、盐离子浓度过高均会395白是全球首例高效毒杀稻飞虱的单一组分Bt蛋白，并且发现Tpp78Aal对几种蚜虫同样具有较强致死作用,LCso为10 30 g/mL36,该蛋白晶体结构已于2022年解析37，建立了Cry78Aa对稻飞虱的杀虫作用模型，初步揭示了杀虫机理（待发表资料)；因此该蛋白有望应用于转Bt基因作物防治多种半翅目刺吸式口器害虫。2 0 2 0 年，本团队从Bt野生菌株B4F11中克隆获得了与Tpp78Aal同源蛋白Tpp78Bal,其对灰飞虱3龄若虫的LCso为9.7 2 g/mL22。2 0 2 3年，本团队基于生物信息学分析进一步从本实验室菌株基因组数据库中筛选Tpp家族蛋白编码序列,并从中成功克隆表达了8 种新型Tpp家族蛋白。其中，Tpp78Abl、T p p 7 8 Bb l、T p p 7 8 C a l、T p p 8 0 A e l等 4种蛋白对灰飞虱3龄若虫的LC5o分别为8.1、8.6、10.1、9.6 g/mL，与Tpp78Aal蛋白的活性相当；Tpp78Dal、T p p 8 0 A a 3、T p p 8 0 A c l、T p p 8 0 A d l 等 4种蛋白在浓度2 0 g/mL时对灰飞虱3龄若虫的校正死亡率分别达到48.3%、49.6%、47.1%和48.4%，杀虫活性略低于Tpp78Aal蛋白38 4挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白的基础前期发现应用最为广泛的3D-Cry蛋白对半翅目刺吸式害虫的活性普遍较低,这可能是由于Bt与半翅目害虫生态位的空间隔离、半翅目害虫特殊中肠环境的限制、半翅目害虫肠道结构的阻碍及中肠结合特异性受体无法正确识别等诸多因素造成的33.39-48。如今高通量测序技术迭代发展，以及研究人员对半翅目害虫生物学特性认知的不断更新，均为后期具有高效杀半翅目害虫活性的Bt杀虫蛋396导致试虫大量死亡，因此针对不同半翅目害虫制定适宜的人工液体饲料配方是建立稳定的生测体系的第一步。2 0 0 1年,Fu等通过检测各种微量元素对水稻褐飞虱的作用，开发出能够使褐飞虱种群成功传代的D97褐飞虱人工饲料49，为后续褐飞虱生测体系的建立奠定了基础。目前本团队也已熟练掌握适用于灰飞虱等刺吸式害虫的液体人工饲料的配制以及“双层膜饲喂”技术50 ，试验过程中可针对具体情况适度控制液体饲料的盐离子浓度等。另一方面,理想的生测装置是建立稳定生测体系的关键因素之一。半翅目害虫个体小易溺死,生测过程中受生测装置内湿度影响较大。2 0 15年，本团队与本单位昆虫功能基因组研究团队合作设计了新的刺吸式害虫的生测装置51，该装置符合刺吸式害虫取食特点且可维持适宜的湿度，使得先前生测对照组30%左右的死亡率降至10%以下，为后期Mpp64Ba/Mpp64Ca、T p p 7 8 等新型Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性测定提供了可靠的技术保障。2 0 16 年，邵恩斯等发明了一种可同时进行多组试验的褐飞虱生测装置，为后续针对飞虱、叶蝉、蚜虫等刺吸式口器害虫的生测研究提供了技术支撑52 4.2建立候选菌株与杀虫基因资源数据库候选菌株与杀虫基因数据库的建立为发现对半翅目害虫具有较高活性的新型Bt菌株与杀虫基因资源提供了保障。前期研究人员发现对半翅目害虫具有高活性的一些新型Bt杀虫蛋白在出发菌株中表达量普遍偏低（如 Tpp78Aal、T p p 7 8 Ba l)2.2,利用传统方法测试菌株总晶体蛋白活性可能会遗漏一些高杀虫活性的关键蛋白。因此,建立杀虫基因资源数据库，优先从基因组层面考虑选择分子量偏小(30 50 kD)，且保守结构域明显区别于3D-Cry蛋白的新类型的Bt杀虫蛋白,如Mpp、T p p 等，有助于高效挖掘对半翅目害虫有效的新型Bt杀虫蛋白。Bt菌株资源库则是高通量筛选对半翅目害虫具有杀虫活性的Bt菌株的前提，目前Bt菌株资源挖掘仍主要通过土壤分离进行筛选。随着现代生物技术手段的不断发展，新型Bt基因的发现不再仅仅使用通用引物进行PCR扩增,Bt基因的挖掘已经上升到基因组水平。2 0 2 1年,Liu等设计了一种全面、高通量的Bt基因挖掘工具一BtToxin_Digger,其可以从数千个原始基因组和宏基因组数据中挖掘Bt 基庆祝植物保护创利6 0 周年专辑一生物防治篇因53,作为杀虫基因资源数据库的储备。本团队也有丰富的可供筛选的野生菌株资源，而且已通过高通量测序技术获得了6 0 0 0 株Bt菌株基因组数据，建立了菌株基因组数据拼接、组装、注释、比对等生物信息学分析平台541。此外，基于Bt杀虫蛋白氮基酸序列和细菌杀虫蛋白保守结构域特征，以及Bt杀虫基因连锁关系等，建立了成熟的新型Bt杀虫基因挖掘体系。5问题与展望半翅目害虫的直接取食与传播病毒造成的危害已成为农林业生产中的最重大威胁之一。Bt及其杀虫蛋白将成为控制半翅目害虫最安全有效的手段之一，因此需加快现有高毒力Bt杀虫蛋白的开发与应用，进一步深入挖掘对半翅目害虫高活性的Bt杀虫蛋白和菌株资源。未来,Bt及其杀虫蛋白对半翅目害虫的防治工作，应从以下几个层面考虑：第一，就目前已获得的几种杀虫活性较高的Bt杀虫蛋白(LCso10 g/mL)而言，不仅要深人了解这些新型Bt杀虫蛋白的杀虫机理，而且应针对半翅目害虫取食植物韧皮部或木质部汁液的为害特点，筛选组织特异表达启动子，开发符合实际应用要求的转Bt基因抗虫植物，于半翅目害虫取食的植物组织中稳定表达Bt杀虫蛋白,打破二者的生态隔离。第二,对于杀虫活性处于中等水平的Bt杀虫蛋白（10 g/mLLC5o100 g/mL），可利用蛋白质工程技术进行定向改造，提高其杀虫活性或扩大杀虫谱。例如,定点诱变对盲蝽有活性的Mpp51Aa2蛋白的关键氨基酸位点，获得了杀虫活性提高的改造蛋白55;将组织蛋白酶L和B型的酶切位点引入Cry4Aa后，促进了其对豌豆蚜的活性56 。第三，目前鉴定获得的对半翅目害虫有效的Bt杀虫蛋白资源仍十分有限。对于不同的半翅目害虫，应尽快制定相应的人工饲料配方并建立稳定的室内杀虫活性测定体系，综合利用高通量测序、生物信息学、杀虫活性测定等技术，深人挖掘对半翅目害虫具有高毒力的Bt杀虫蛋白。第四,应进一步了解对半翅目有活性的Bt菌株以及杀虫蛋白出发菌株的生物学特性，探索这些菌株与害虫寄主植物的互作关系，如促进植物产生抗虫代谢物、促进植物生长等。最新研究表明,Bt可作为内生