第7章-原核细胞基因工程.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,基因表达的基本概念与原理,基因表达,（,gene expression,）是指基因所包含的遗传信息通过转录生成,RNA,，再经过翻译生成蛋白质的过程。这其中也包括以,RNA,为终产物的表达，如生成,tRNA,和,rRNA,的过程。,基因表达有其特定的规律，并受到机体各种因素的调节和控制，即所谓基因表达调控（,regulation and control of gene expression,）。,时间特异性,（,temporal specificity,）和,空间特异性,（,spatial specificity,）。,有些基因在几乎所有细胞中持续地表达，而有些基因则随细胞种类的不同及环境条件的变化而开启和关闭，前者被称为,看家基因,（,housekeeping gene,），其表达属于,基础或组成型表达,；而后者属,诱导型,表达（受诱导剂或阻遏剂）调控。,基因表达的基本概念与原理,目的基因表达要素,目的基因,载体,宿主,需要表达的,DNA,序列,运送外源基因进入受体细胞,表达目的基因的细胞（原核或真核）,一、宿主菌,受体细胞应具备的条件,各种基因工程受体的特性,实验室常用的基因工程受体,各种原核宿主菌的特性,大肠杆菌,优点,：遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养,简单，重组子稳定。,应用,：（1）外源,DNA,的扩增和克隆,（2）原核基因的高效表达,（3）基因文库的构建,缺点,：产生结构复杂、种类繁多的,内毒素,。,各种原核宿主菌的特性,芽孢杆菌,优点,：遗传背景清楚，蛋白质,分泌机制,健全，生长迅速，,培养简单，,不产内毒素,应用,：适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽,的,有效分泌,。,缺点,：遗传,欠稳定,，载体受体系统欠完备,各种原核宿主菌的特性,链霉菌,抗生素,的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传,不稳定,，生长相对缓慢,各种原核宿主菌的特性,蓝藻,遗传背景简单，便于基因操作和外源,DNA,的检测,营光合自养型生长，培养条件简单,细胞壁主要由肽聚糖组成，便于外源,DNA,的转化,多数有内源质粒，为构建蓝藻质粒载体提供了良好的条件,在各个生长时期均处于感受态，便于转化,多数无毒，且富含蛋白质，早已用作食品或保健品,二、原核表达载体,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,质粒拷贝数,启动序列是,RNA,聚合酶识别、结合并启动转录的特异,DNA,序列，是基因表达的基本调控点之一。原核基因的启动序列中，在转录起始点上游,-10,至,-35,区域通常存在一些相似序列，称为共有序列或一致性序列（,consensus sequence,）。,启动子,启动子,启动子的构建,-35 区序列,-10 区序列,P,l,L,P,recA,P,trp,P,lac,P,traA,P,tac,启动子,T T G A C A,G A T A C T,T T G A T A,T A T A A T,T T G A C A,T T A A C T,T A G A C A,T A A T G T,T T T A C A,T A T A A T,T T G A C A,T A T A A T,P,tac,=,3,P,trp,=,11,P,lac,启动子,启动子最佳距离的探测,目的基因,E,E,A,E,E,启动子,A,酶切开,Bal31,酶解,目的基因,启动子,启动子的筛选,Ap,r,ori,galK,pKO1,终止密码子,采用鸟枪法战略，将合适大小的,DNA,片段,克隆到启动子探针质粒,pKO1,上,受体细胞染色体,DNA,上的,galE,、,galT,与质,粒上报告基因,galk,的表达产物联合作用，,可将培养基中的半乳糖酵解成红色物质,转化,galE,+,、,galT,+,、,galK,-,的大肠杆菌受体菌株,含有外源启动子活性的重组克隆,启动子,启动子的可控性,P,乳糖启动子,P,lac,的可控性：,O,P,O,高效转录,阻遏蛋白,诱导,乳糖 异丙基-,b,-D-,硫代半乳糖苷（,IPTG）,野生型的,P,lac,与其控制区,O,lac,偶联在一起，在没有诱导物,存在时，整个操纵子处于基,基底水平转录,底水平表达；诱导物可以使,启动子,P,lac,介导的转录大幅,提高,启动子,启动子的可控性,P,lac,乳糖启动子,P,lac,的可控性：,O,P,lac,O,高效转录,葡萄糖代谢,野生型的,P,lac,上游附近拥有,代谢激活因子（,CAP,）,结合,区，,cAMP,激活,CAP,，,CAP,基底水平转录,结合启动子控制区，进而促,进,P,lac,介导的转录。葡萄糖,代谢使,cAMP,减少，也能阻,遏,P,lac,介导的转录。因此，,基因工程中使用的乳糖启动,子均为抗葡萄糖代谢阻遏的,突变型，即,P,lac,UV5,CAP,cAMP,cAMP,浓度降低,P,lac,UV5,O,高效转录,启动子,启动子的可控性,P,trp,色氨酸启动子,P,trp,的可控性：,O,trp,除去,色氨酸,色氨酸启动子,P,trp,受色氨酸-阻遏,蛋白复合物的阻遏，转录呈基底,状态。在培养系统中去除色氨酸,基底水平转录,或者加入,3-吲哚丙烯酸,（,IAA,），,便可有效地解除阻遏抑制作用。,在正常的细菌培养体系中，除去,色氨酸是困难的，因此基因工程,中往往添加,IAA,诱导,P,trp,介导的目,的基因的表达,色氨酸,或加,3-吲哚丙烯酸,高效转录,阻遏蛋白,（,IAA,）,O,trp,P,trp,高效转录,O,trp,P,trp,启动子,启动子的可控性,l,噬菌体,启动子,P,l,L,的可控性：,噬菌体启动子,P,L,受,CI,阻遏蛋白阻,遏，很难直接诱导控制。在基因,工程中常使用温度敏感型的,cI,突,变基因,cI,857,控制,P,L,。,cI,857,阻遏蛋白,在42时失活脱落，,P,L,便可介导,目的基因的表达。但在大型细菌,培养罐中迅速升温非常困难，因,此常使用一个双质粒控制系统，,用色氨酸间接控制目的基因表达,P,trp,A,B,cI,857,P,L,目的基因,阻遏作用,P,trp,A,B,P,L,表达,色氨酸,核糖体结合位点,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频率，而且在很大程度上还与,mRNA,的翻译起始效率密切相关。大肠杆菌细胞中结构不同的,mRNA,分子具有不同的翻译效率，它们之间的差别有时可高达数百倍。,mRNA,翻译的起始效率主要由其,5,端的结构序列所决定，称为,核糖体结合位点,（,RBS,）,核糖体结合位点,大肠杆菌核糖体结合位点包括下列,四个特征结构要素,：,1.,位于翻译起始密码子上游的,6-8,个核苷酸序列,5,UAAGGAGG 3,，,即,Shine-Dalgarno,（,SD,）,序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的,16,S rRNA 3,端区域,3,AUUCCUCC 5,并与之专一性结合，将,mRNA,定位于核糖体上，从而启动翻译；,2.,翻译起始密码子,，大肠杆菌绝大部分基因以,AUG,作为阅读框架的起始位点，但有些基因也使用,GUG,或,UUG,作为翻译起始密码子；,3.SD,序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成,；,4.,基因编码区,5 端若干密码子,的碱基序列,核糖体结合位点的结构,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD,序列的影响,：,一般来说，,mRNA,与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于,SD,序列与,16,S rRNA,的碱基互补性，其中以,GGAG,四个碱基序列尤为重要。对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成,C,或,T,，,均会导致翻译效率大幅度降低,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD,序列与起始密码子之间的,序列,的影响,：,SD,序列下游的碱基若为,AAAA,或,UUUU,，,翻译效率最高；而,CCCC,或,GGGG,的翻译效率则分别是最高值的,50%,和,25%,。,紧邻,AUG,的前三个碱基成份对翻译起始也有影响，对于大肠杆菌,b,-,半乳糖苷酶的,mRNA,而言，在这个位置上最佳的碱基组合是,UAU,或,CUU,，,如果用,UUC,、,UCA,或,AGG,取代之，则酶的表达水平低,20,倍,.,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,SD,序列与起始密码子之间的,距离,的影响,：,SD,序列,与,起始密码子,之间的,精确距离,保证了,mRNA,在核糖体上定位后，翻译起始密码子,AUG,正好处于核糖体复合物结构中的,P,位，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，,SD,序列位于,AUG,之前大约,七个碱基,处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低,核糖体结合位点,核糖体结合位点对外源基因表达的影响,起始密码子,及其,后续若干密码子,的影响,：,大肠杆菌中的起始,tRNA,分子可以同时识别,AUG,、,GUG,和,UUG,三种起始密码子，但其识别频率并不相同，通常,GUG,为,AUG,的,50%,而,UUG,只及,AUG,的,25%,。,除此之外，从,AUG,开始的前几个密码子碱基序列也至关重要，至少这一序列不能与,mRNA,的,5,端非编码区形成茎环结构，否则便会严重干扰,mRNA,在核糖体上的准确定位。,目前广泛用于外源基因表达的大肠杆菌表达型质粒上，均含有与启动子来源相同的核糖体结合位点序列，序列和间隔是最佳的,终止子,强化转录终止的必要性,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即,RNA,聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的,DNA,序列，形成长短不一的,mRNA,混合物。,过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：,转录产物越长，,RNA,聚合酶转录一分子,mRNA,所需的时间就相应增加，,外源基因本身的转录效率下降,；,如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或,DNA,功能区域，如选择性标记基因和复制子结构等，则,RNA,聚合酶在此处的转录可能,干扰质粒的复制及其它生物功能,，甚至导致重组质粒的不稳定性；,过长的,mRNA,往往会,产生大量无用的蛋白质,，增加工程菌,无谓的能量消耗,；,更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大,降低,外源基因编码产物的,翻译效率,终止子,强终止子的选择与使用,目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌,rRNA,操纵子上的,rrnT,1,T,2,以及,T7,噬菌体,DNA,上的,T,f,。,对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用,终止子也可以象启动子那样，通过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基因组,DNA,中克隆筛选,pCP1,Ap,r,ori,Tc,r,筛选,Ap,r,、,Tc,s,的转化子,选择标记基因,目的：方便筛选,原核生物表型选择标记包括显性标记和营养缺陷型标记等。,最为常见的选择标记是抗生素抗性标记基因，常见的有,amp,r,、,tet,r,、,kan,r,和,st,r,等。,复制子,一段包括复制起始点（,ori,）和反式因子作用区段在内的,DNA,区段。,一般是受体细胞内的复制子，这样才能被受体细胞内相应的、与起始有关的酶和蛋白因子所识别。,复制方式：松弛式复制和严谨式复制,表,7-1,原核表达载体上的常用复制子,三、密码子偏好,生物体对密码子的偏爱性,不同的生物，甚至同种生物不同的蛋白质编码基因，对简并密码,子使用频率并不相同，具有一定的偏爱性，其决定因素是：,生物基因组中的碱基含量,在富含,AT,的生物（如单链,DNA,噬菌体,f,X174）,基因组中，密码子第三位上的,U,和,A,出现的频率较高；而在,GC,丰富的生物（如链霉菌）基因组中，第三位上含有,G,或,C,的简并密码子,占,90%,以上的绝对优势,密码子与反密码子相互作用的自由能,细胞,内,tRNA,的含量,如,GGG,、,CCC,、,GCG,、,GGC,、,AAA,、,UUU,、,AUA,、,UAU,等使用少；,如,GUG,、,CAC,、,UCG,、,AGC,、,ACA,、,UGU,、,AUC,、,UUG,等使用多；,三、密码子偏好,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程,大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高,效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择。一般而言，有两种策略,可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,外源基因全合成,同步表达相关,tRNA,编码基因,三、密码子偏好,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,按照大肠杆菌密码子的偏爱性规律，设计更换外源基因中不适宜的相应简并密码子，重组人胰岛素、干扰素以及生长激素在大肠杆菌中的高效表达均采用了这种方法,外源基因全合成,三、密码子偏好,密码子偏爱性对外源基因表达的影响,对于那些含有不和谐密码子种类单一、出现频率较高、而本身分子量又较大的外源基因而言，则选择相关,tRNA,编码基因同步克隆表达的策略较为有利。例如，在,人尿激酶原,cDNA,的,412,个密码子中，共含有,22,个,精氨酸密码子,，其中,7,个,AGG,、,2,个,AGA,，,而大肠杆菌受体细胞中,tRNA,AGG,和,tRNA,AGA,的丰度较低。为了提高人尿激酶原,cDNA,在大肠杆菌中的高效表达，将大肠杆菌的这两个,tRNA,编码基因克隆在另一个高表达的质粒上。由此构建的大肠杆菌双质粒系统有效地解除了受体细胞对外源基因高效表达的制约作用。,同步表达相关,tRNA,编码基因,四、质粒拷贝数,质粒拷贝数对细菌生长代谢的影响,目前实验室里广泛使用的表达型质粒在每个大肠杆菌细胞中可达数百甚至上千个拷贝，质粒的扩增过程通常发生在受体细胞的对数生长期内，而此时正是细菌生理代谢最旺盛的阶段。,质粒分子的过度增殖,以及其后目的基因的高效表达势必会,影响受体细胞的生长代谢,，进而导致重组质粒的不稳定性以及目的基因宏观表达水平的下降。,解决上述难题的一种有效策略是,将重组质粒的扩增纳入可控制的轨道。,四、质粒拷贝数,质粒扩增时序的控制,pCP3,拥有一个,温度可诱导型的复制子,pCP3,P,L,MCS,ori,Ap,r,在28时，每个细胞的质粒拷贝数为,60,在42时，拷贝数迅速增至,300,600,。,在此温度下，受体细胞染色体上的,CI,基,因表达的,温度敏感型阻遏蛋白,失活,因此，用一种手段同时控制质粒拷,贝数和基因的表达,第二节 原核表达策略,包涵体型表达,分泌型表达,融合型表达,其它类型的表达,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体及其性质,在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为,包涵体,（,Inclusion Bodies,，,IB,）。,富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有,氨基酸类似物,培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。除此之外，包涵体中还含有少量的,DNA,、,RNA,和脂多糖等非蛋白分子,包涵体型异源蛋白的表达,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点,能简化外源基因表达产物的分离操作,包涵体表达形式的优点：,包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来,能在一定程度上保持表达产物的结构稳定,在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁,包涵体型异源蛋白的表达,以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点,包涵体表达形式的缺点：,以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的,Cys,残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过,30%,包涵体型异源蛋白的表达,以包涵体形式表达目的蛋白的操作,如果未进行特殊设计（如分泌型表达或融合型表达），外源基因在大肠杆菌中表达的蛋白量占细胞总蛋白量,20%,以上时，表达产物一般倾向于形成包涵体。因此，以包涵体形式表达目的基因操作的关键就是,选择高表达的载体,。事实上，这种高表达率也是包涵体法的长处所在,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体的变性与复性操作,C,共价修饰的蛋白质,蛋白质变性复性的动力学原理：,C,1,C,2,C,n,C,U,I,1,I,n,N,X,1,X,2,X,n,X,Ag,Ag,Ag,Ag,I,有效变复性过程中的中间状态,X,脱离有效变复性过程而进入集聚的中间状态,N,天然状态的蛋白质,U,变性状态的蛋白质,A,集聚状态的蛋白质,在细菌细胞内，,集聚状态,和,共价修饰,的蛋白质不能进入复性过程，因此永远成为,无活性的蛋白质。,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体的变性与复性操作,包涵体的溶解与变性：,包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的,二硫键,和,次级键,在人工条件下，使包涵体溶解并重新进入复性途径中。,能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：,清洗剂,SDS,、,正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化,促溶剂,盐酸胍,、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发,形成的氰酸盐污染，后者能与多肽链中的氨基反应,混合溶剂,如,尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强,极端,pH,廉价，但许多蛋白质在极端,pH,条件下发生修饰反应,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体的变性与复性操作,包涵体的复性与重折叠（,refolding,）：,包涵体的复性与重折叠的主要任务是：,通过,次级键,的形成使蛋白质复性,将多肽链中被拆开的,游离巯基,重新折叠,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体的变性与复性操作,包涵体的复性与重折叠（,refolding,）：,复性操作,包涵体复性操作的方法包括：,分段稀释法，,逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生,一步稀释法，,蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大,试剂添加法，,精氨酸、甘氨酸、甘油、蔗糖、,PEG,、,Ca,2+,蛋白修饰法，,氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚,产物隔离法，,将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞,分子伴侣法，,GroEL,、,GroES、DnaK，,固定化，共表达,包涵体型异源蛋白的表达,包涵体的变性与复性操作,包涵体的复性与重折叠（,refolding,）：,二硫键形成,在包涵体变性体系中，始终存在着还原剂，使多肽链中的巯基保持还原状态，防,化学氧化法（,A,）,需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是,二硫键交换（,B,）,需要还原型和氧化型谷胱甘肽（,GSH,和,GSSG,），,二硫键,止二硫键错配导致严重的集聚。在变性操作结束后，这些游离型的巯基必须重新,配对形成二硫键，此时多肽链也重新发生折叠。形成二硫键的方式主要有：,随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠,形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好,HS,HS,S,S,+,2,e,+,2,H,+,A,HS,HS,S-S-R,HS,+,B,R-S-S-R,S,S,2,R-SH,分泌型异源蛋白的表达,在大肠杆菌中表达的异源蛋白按其在细胞中的定位可分为两种形式：即以可溶性或不溶性（包涵体）状态存在于细胞质中；或者通过运输或,分泌,方式定位于,细胞周质,，甚至穿过外膜进入培养基中。蛋白产物,N,端,信号肽,序列的存在是蛋白质分泌的前提条件,分泌型异源蛋白的表达,以分泌形式表达目的蛋白的优缺点,分泌表达形式的优点：,目的蛋白稳定性高,重组人胰岛素原若分泌到细胞周中，其稳,稳定性大约是在细胞质中的,10,倍,目的蛋白易于分离,目的蛋白末端完整,相当多的真核生物成熟蛋白,N,端并不含有,甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质,N,端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠,杆菌的,信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其,N,端,的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去,分泌型异源蛋白的表达,以分泌形式表达目的蛋白的优缺点,分泌表达形式的缺点：,相对其它生物细胞而言，,大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全,。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍。,分泌型异源蛋白的表达,蛋白质的分泌机制,原核细菌周质中含有多种,分子伴侣,可阻止分泌蛋白的随机折叠,，,分泌在细胞周质或培养基中的重组蛋白很少形成分子间的二硫键交联，因此与包涵体相比，分泌型重组蛋白具有较高比例的正确构象，生物活性的回收率增加，且对蛋白酶不敏感,。,分泌型异源蛋白的表达,分泌型目的蛋白表达系统的构建,包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分,泌到胞外，但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌,到培养基中，这一过程严格依赖于,细菌素释放蛋白,，它激活定位于膜,上的磷酸酯酶,，导致细菌内外膜的通透性增大。,因此，只要,将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上,即可构建完全分泌型的受体细胞。此时，用另一种携带大肠杆菌信号,肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞，并,使用相同性质的启动子介导目的基因的转录，则可实现目的蛋白从重,组大肠杆菌中的完全分泌。,融合型异源蛋白的表达,除了直接表达异源蛋白外，还可,将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接,在一起，并作为一个开放型,阅读框架,进行表达。由这种杂合基因表达出的蛋白质称为,融合蛋白,。在这种融合蛋白结构中，通常受体细菌的蛋白部分位于,N,端，异源蛋白位于,C,端。通过在,DNA,水平上人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点，可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白,受体蛋白,外源蛋白,N,端,C,端,切割位点,融合型异源蛋白的表达,以融合形式表达目的蛋白的优缺点,目的蛋白稳定性高,尤其对分子量较小的多肽效果更佳,目的蛋白易于分离,利用受体蛋白建立相应抗体、配体、底物,目的蛋白表达率高,与受体蛋白共用一套完善的表达元件,胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性,目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段。,亲和层析系统，可以快速获得纯度较高的融合蛋白,目的蛋白溶解性好,由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在,目的蛋白需要回收,融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获,融合型异源蛋白的表达,融合型目的蛋白表达系统的构建,融合蛋白表达质粒的构建原则：,受体细胞的结构基因要能,高效表达,，其表达产物可以通过,亲和,层析,进行特异性简单,纯化,两个结构基因,拼接位点处的序列设计,十分重要，它直接决定着,为目的蛋白分离回收创造条件,外源基因应装在受体蛋白编码基因的,下游,，为融合蛋白提供终,止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目,的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，,融合蛋白的裂解工艺,两个蛋白编码序列应保持,一致的翻译阅读框架,融合型异源蛋白的表达,融合型目的蛋白表达系统的构建,用于融合蛋白构建的受体蛋白：,谷胱甘肽转移酶（,GST）,维持良好空间构象,硫氧化还原蛋白（,TrxA,）,维持良好空间构象,pTrxFus,麦芽糖结合蛋白（,MBP）,促进分泌,金黄色葡萄球菌蛋白,A（SAPA）,免疫亲和层析,pRIT2T,外膜蛋白（,OmpF）,促进分泌,b,-,半乳糖苷酶（,LacZ）,免疫亲和层析,泛素蛋白（,Ubi）,维持良好空间构象,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,融合蛋白中受体蛋白部分的存在可能会影响目的蛋白的空间构象和生物活性，如果将之注入人体还会导致免疫反应，因此在制备和生产药用目的蛋白时，将融合蛋白中的受体蛋白部分完整除去是必不可少的工序。融合蛋白的位点专一性断裂方法有两种：,化学断裂法,酶促裂解法,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,用于蛋白位点专一性化学断裂的最佳试剂为,溴化氰,（,CNBr,）,它与多肽链中的,甲硫氨酸,残基侧链的,硫醚基,反应，生成溴化亚氨内酯，后者不稳定，在水的作用下肽键断裂，形成两个多肽降解片段其中,上游肽段,的甲硫氨酸残基转化为,高丝氨酸,残基，而下游肽段,N,端的第一位氨基酸残基保持不变。这一方法的优点是回收率高（可达到,85%,以上），专一性强，而且所产生的目的蛋白的,N,端不含甲硫氨酸，与真核生物细胞中的成熟表达产物较为接近。,如果异源蛋白分子内部含有甲硫氨酸残基，则不能用此方法,化学断裂法：,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,酶促裂解法：,单残基位点,蛋白内切酶,切割位点,梭菌蛋白酶,Arg-C,葡萄球菌蛋白酶,Glu-C,假单孢菌蛋白酶,Lys-C,猪胰蛋白酶,Arg-C,Lys-C,蛋白酶酶促裂解法的特点是断裂效率更高，,同时每种蛋白酶均具有相应的,断裂位点决定,簇,，因此可供选择的专一性断裂位点范围较,广。几种断裂位点专一性最强的商品化蛋白,酶分别在多肽链中的,精氨酸,、,谷氨酸、赖氨,酸,残基处切开酰胺键，形成不含上述残基的,下游断裂肽段，与溴化氰化学断裂法相似。,蛋白酶裂解融合蛋白的,前提条件,是外,源蛋白,分子内部不能含有精氨酸、谷氨酸,或,赖氨酸,，如果外源基因表达产物为小分子多肽，这一限制条件并不苛刻，但,大分子量的异源蛋白来说，上述三种氨基酸残基的出现频率是相当高的,Arg C,N,N,C,受体蛋白,目的蛋白,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,酶促裂解法：,多残基位点,为了克服仅切单一氨基酸残基的蛋白酶所带来的应用局限性，可在受体蛋白编码序列与不含起始密码子的外源基因之间加装一段编码,寡肽序列,（,Ile-Glu-Gly-Arg,）,的人工接头片段，该寡肽为具有蛋白酶活性的,凝血因子,Xa,的识别和作用序列，其断裂位点在,Arg,的,C,末端,。纯化后的融合蛋白用,Xa,处理，即可获得不含上述寡肽序列的目的蛋白。由于,Xa,的识别作用序列由四个氨基酸残基组成，大多数蛋白质中出现这种寡肽序列的概率极少，因此这种方法可广泛用于从融合蛋白中回收各种不同大小的目的蛋白产物,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,酶促裂解法：,多残基位点,启动子,受体基因,接头,目的基因,Met,Arg,Stop,Lys,Glu,Ile-Glu-gly-Arg,Arg,Lys,Glu,Ile-Glu-gly-Arg,表达,亲和层析,酶解回收,谷胱甘肽转移酶（,GST,）,谷胱甘肽,融合型异源蛋白的表达,目的蛋白的回收,酶促裂解法：,多残基位点,Pinpoint Xa,tac,生物素结合肽编码序列,Xa,因子识别位点编码序列,SP6,T7,Ap,r,ori,MCS,ATC GAA GGT CGC GAA GCT TCA GCT GGG ATC CGG TAC CGA TAT CAG ATC TCC CGG GGC GGC CGC,Xa-1,Ile Glu Gly Arg,Glu,ATC GAA GGT CGC GAA,A,GC TTC AGC TGG GAT CCG GTA CCG ATA TCA GAT CTC CCG GGG CGG CCG C,Xa-2,ATC GAA GGT CGC GAA,AA,G CTT CAG CTG GGA TCC GGT ACC GAT ATC AGA TCT CCC GGG GCG GCC GC,Xa-3,NruI HindIII PvuII BamHI KpnI EcoRV BglII SmaI NotI,Xa,因子切割位点,寡聚型异源蛋白的表达,从理论上讲，外源基因的表达水平与受体细胞中可转录基因的拷贝数（即,基因剂量,）呈正相关。然而重组质粒除了含有外源基因外，还携带其它的可转录基因，如作为筛选标记的抗生素抗性基因等。随着重组质粒拷贝数的不断增加，受体细胞内的大部分能量和原料被用于合成所有的重组质粒编码蛋白，而细胞的正常生长代谢却因能量不济受到影响，因此,通过增加质粒拷贝数提高外源基因表达产物的产量往往不能获得满意的效果,。,另一种通过增加外源基因剂量而提高目标蛋白产量的有效方法是构建,寡聚串联型异源蛋白表达载体,，即将多拷贝的外源基因克隆在一个低拷贝质粒上，以取代单拷贝外源基因在高拷贝载体上表达的策略,寡聚型异源蛋白的表达,以寡聚形式表达目的蛋白的优缺点,目的蛋白高效表达,在不提高质粒拷贝数的前提下，增加目的基因的拷贝数，可以,稳定表达小分子短肽,在一定程度上改善表达量,目的产物回收困难,短肽由于缺乏有效的空间结构，在细菌细胞中的半衰期较短。,串联短肽具有与蛋白质相似的长度及空间结构，因而抗蛋白酶,降解的能力大幅度提高,寡聚短肽需要裂解和进一步分离，才能获最终分子，但,裂解后,的短肽分子容易出现序列不均一性,寡聚型异源蛋白的表达,寡聚型目的蛋白表达系统的构建,P,SD,gene,gene,gene,gene,T,1,T,2,H,2,N,COOH,Met,Met,Met,Met,mRNA,CNBr,基本战略：,寡聚型异源蛋白的表达,寡聚型目的蛋白表达系统的构建,构建举例：,P,SD,T,1,T,2,EcoRI,BamHI,AATTCAGATCT,GTCTAGA,G,CCTAG,EcoRI,Bgl II,BamHI,EcoRI,BamHI,Bgl II,GATCT,A,G,CCTAG,EcoRI,BamHI,Bgl II,EcoRI,BamHI,Bgl II,EcoRI+BamHI,Bgl II+BamHI,BamHI,整合型异源蛋白的表达,以整合形式表达目的蛋白的优缺点,目的基因表达稳定,整合型的目的基因随受体细胞染色体,DNA,的复制而复制，在大,多数情况下相当稳定，工程菌在没有选择压力存在下可以连续,目的基因表达率低,单拷贝整合的目的基因表达率受到限制，此时可通过强化表达,元件而加以补偿,培养而不丢失目的基因表达盒，这对以改良物种遗传性状为目,的的基因工程案例特别有意义,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,在生物体细胞尤其是原核细菌细胞内，广泛存在着,DNA,的遗传重组机制，其可能的生物学功效是促进生物种群的进化。细胞内的,遗传重组,可分为两大类：,转位因子依赖型,同源序列依赖型,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,转位因子,是指生物细胞内天然存在的一类无复制能力的,DNA,可移动因子，不同生物种群拥有结构不同的转位因子，例如：,转位因子依赖型的体内重组：,转位因子家族,噬菌体,G,片段（,G-Fragment,）,原核细菌 插入顺序（,IS,）,真核细菌 转座子（,Tn,、,Ty,）,高等植物 可移动因子（,Ac,、,Ds,）,高等动物 跳跃基因（,mobil gene,）,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,转位因子依赖型的体内重组：,转位因子的结构,IS,（,1 kb,）,Ty,（,5 kb,）,Tn,（,2-20 kb,）,ACCATGGTT,TTGGTACCA,抗药性基因,转位酶基因,识别位点,阻遏基因,IR,IR,IR,IR,IS,IS,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,转位因子依赖型的体内重组：,整合形式,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,在很多原核细菌细胞中，染色体,DNA,链上的两个同源区之间可发生所谓的,同源重组,，其频率与细菌种类、两个同源区之间的距离同源区的长度、同源程度密切相关。,一般地说，距离越远、长度越长、同源性越高，重组的频率也就越高，,反之亦然。,同源重组有,整合,和,交换,两种形式，前者只需要一个断裂位点，而后者涉及两个断裂位点,同源序列依赖型的体内重组：,基本形式,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,同源序列依赖型的体内重组：,同源整合,ori,目的基因,同源区域,标记基因,整合位点,染色体,DNA,整合型异源蛋白的表达,DNA,体内重组的基本原理,同源序列依赖型的体内重组：,同源交换,ori,目的基因,同源区域,标记基因,交换区域,染色体,DNA,ori,+,第三节 基因工程菌的大规模培养,基因工程菌（简称工程菌）的大规模培养主要采用和借鉴微生物工程发酵的方法，通过工程菌的大规模发酵培养，实现外源基因表达产物的工业化生产。,基因工程菌的大规模培养过程,通过摇瓶操作研究基因工程菌生长的基础条件，如温度、pH值、培养基各种组分、碳氧比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响等，并为大规模培养提供高纯度菌种,。,通过培养罐操作确定规模化培养的参数和控制方案以及顺序，完成代谢产物分离。,菌种,一级种子摇瓶扩大培养,二级种子罐培养,原料,发酵培养基配制,灭菌,发酵生产,代谢产物分离,基因工程菌的发酵生产流程,一、基因工程菌发酵的特点,发酵产物生成的代谢途径不同,基因工程菌存在遗传不稳定性,基因工程菌发酵的其他特点,（生产规模较小，设备自动化程度要求高，产品附加值高，生产利润大，防扩散等）,二、基因工程菌的深层培养方式,深层培养,：,指与表面培养相对应，使用固体或液体培养基在固定的容器内通入无菌空气进行培养发酵的方法，现在通常用的是液体深层发酵。,常见的深层培养方式：分批培养、补料分批培养、连续培养、透析培养、固定化培养,1.分批培养,分批培养细菌生长曲线,2.补料分批培养,补料分批培养,：,也叫流加培养，是在发酵反应器中接种培养一段时间后，间歇或连续地补加新鲜培养基，发酵结束前一段时间停止补料，发酵结束后一次性放料的培养方法。,3.连续培养,连续培养,：,将种子接入发酵反应器中，先培养一段时间，使菌体细胞浓度和产物浓度达到一定的要求。然后，以恒定的速度开始进料和出料，控制一定稀释率进行不间断的培养。,4.透析培养,透析培养,：,利用膜的半透性原理使代谢产物和培养基分离，通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。,5.固定化培养,基因工程菌的发酵过程中采用固定化技术有其独特之处，它可以大大提高质粒的稳定性，而且对分泌型表达的工程菌发酵更为有利，便于进行连续培养。将固定化培养技术与连续培养、透析培养相结合，将是今后基因工程菌发酵的发展方向。,三、相关发酵的反应器,基,因工程发酵是为了获得最大量的基因表达产物,发酵罐的组成主要包括：发酵罐体、保证高传质作用的搅拌器、精细的温度控制和灭菌系统、空气无菌过滤装置、残留气体处理装置、参数测量与控制系统、培养液配制和连续操作系统。,对发酵生产来说，异源基因的高效表达取决于工程菌发酵工艺的最优化。,第四节 原核表达产物的分离纯化,传统发酵产品和基因工程产品提取精制的差异,一、分离纯化的目标与策略,分离纯化的目标：将重组蛋白质从杂质蛋白质、核酸、脂类、糖类以及其他代谢产物和培养基成分中分离出来,具体目标的制定由产物用途决定,分离纯化策略,确定分离纯化策略时必须考虑的因素,表达系统的影响,表达产物性质的影响,初始物料、杂质等因素的影响,生产工艺、生产条件的影响,制定合理的纯化方式和纯化工艺,二、分离纯化的一般过程,发酵液的预处理,细胞分离,细胞破碎,离心分离,柱层析,电泳,三、包涵体的溶解和重组蛋白的复性,包涵体的分离、洗涤与溶解,重组蛋白的复性,四、分泌蛋白的浓缩,沉淀法,超滤法,吸附/洗脱层析,第五节,基因工程菌不稳定性及其对策,基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制,改善基因工程菌不稳定性的策略,一、基因工程菌遗传不稳定性产生的原因,工程菌遗传不稳定性的表现形式,基因工程菌