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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,本资料仅供参考，不能作为科学依据。谢谢,细胞凋亡,第1页,细胞凋亡,Cellular Apoptosis,一、概论,伴随生物学研究深入，生物学家越来越意识到细胞死亡，尤其是细胞凋亡含有特殊生物学意义，对于一个多细胞生物来说，要维持完整性和保持平衡性，凋亡是一个非常主要生物学过程。多细胞生物诞生、生长、发育、存活以及死亡，无一不伴伴随细胞凋亡过程。,第2页,细胞死亡是组织病理学中心议题，细胞死亡现象也是生命新陈代谢固有本质。比如胚胎发育,(embryonic development),正常组织更新（,Normal tissue turnover,），以及在增殖淋巴细胞群体中选择适当克隆（,selection of appropriate clones,），这种细胞生理性死亡是种系发育史中早就存在，有利于动物发育中许多生命功效。,第3页,1972,年,Keer,依据细胞发生了与坏死完全不一样死亡过程而提出了细胞凋亡（,Apoptosis,）概念。,80,年代末，细胞凋亡成为新医学研究热点。,正是因为发觉了细胞凋亡规律，三位科学家取得了年诺贝尔医学或生理学奖。他们是英国西德尼,布伦纳、美国,H,罗伯特,霍维茨和英国约翰,E,苏尔斯顿。,第4页,二、凋亡概念：,细胞凋亡是细胞循本身程序结束其生命主动死亡过程，含有特征形态和生化改变，是由基因控制个别细胞发生自主有序死亡。即是由基因控制细胞有目标，有选择性自我消亡过程，这种淘汰机制是确保生命进化基础。,第5页,三、凋亡形态特征,凋亡发生过程表现为细胞死亡（,dying process,）和被去除,(elimination process),（细胞缩小致密染色质边集核碎片凋亡小体）,1,、丧失了特殊表面结构（微绒毛等）和接触区，形成光滑轮廓，从周围活细胞中分离出来；,2,、细胞缩小,：,胞浆细胞器集中（,squeeze,）,胞膜出芽或起泡（,bleb,）,细胞皱缩（,shrinkage,）；,第6页,3,、保持胞浆细胞器完整性,扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，线粒体不肿胀，内膜不破裂；短暂滑面内质网（,SEN,）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；有时有聚积排例半结晶状核糖体；可有与细胞表面平行微丝束。,4,、形成调亡小体（,Apoptotic bodies,）,由凋亡细胞裂解为若干个由质膜包绕小体，每个凋亡小体有自己一簇细胞器。周围不引发炎症反应。,第7页,5,、核内染色质结构改变（这是最引人注意改变,）,染色质（,chromatin,）凝集于核膜下表现为：,核质固缩（,condenation,）；,边集（,margination,）；,核浆紧实（,compaction,）；,核膜皱折（,fold,）。,第8页,HE1000,，小鼠凋亡肝细胞,第9页,HE1000,，小鼠凋亡肝细胞,第10页,在透射电镜下，染色质浓缩在一起呈颗粒状，半月形磨茹，或完整捻珠形；核孔集中于少数区域，浓缩染色质并不贴附在核膜上；转录复合物从核仁中脱落到核浆中呈一簇嗜锇酸小体。残留核仁蛋白关键移到周围染色质特征性部位。核扭曲，断裂呈若干片断，全部片断开始时都有质膜包绕。,第11页,6,、凋亡细胞、凋亡小体被识别与吞噬,：,凋亡细胞或凋亡小体快速被吞噬,同质或异质细胞,吞噬体（,phagosome,）,深入变性,溶酶体残留小体（,lysosomal residual bodies,）,偶然凋亡小体逃避被吞噬，如凋亡导管上皮掉入管腔。,第12页,几点说明：,1,、,形态学改变告诉我们凋亡细胞发生早期细胞体积缩小（,凋亡,第49页,第50页,增加凋亡能干预肿瘤发生与发展，许多,肿瘤凋亡指数（,Apoptotic index AI,）,与肿瘤进展、预后相关。如：,基底细胞癌,（,basel cell carcinoma,）就癌细胞来说其异型性和分化程度应为高度恶性肿瘤，但其生物学行为为低度恶性表现，仅为局部浸润极少转移。研究发觉该肿瘤中细胞凋亡显著，这对降低肿瘤浸润与转移有一定关系。,乳腺癌,：,作为激素控制靶器官，乳腺细胞凋亡受激素控制，细胞凋亡调控异常是乳癌发生原因之一。,ER/PR,（,+,）乳腺癌抗雌激素治疗,或卵巢切除去势疗法能使瘤细胞发生凋亡。,BCl-2,阳性乳癌，产生耐药主要是抑制化疗药品阿霉素诱发细胞凋亡作用。,第51页,前列腺癌,是男性常见肿瘤，伴随前列腺特异性,抗原（,prostatic specific antigen,）应用，新发觉前列腺癌急剧增多。雄激素依赖型前列腺癌,(Androgen drpendent prostatic carcinoma ADPC)BCl-2,（）时，性腺切除、雄激素拮抗剂治疗有效，其机制是对雄激素敏感癌细胞在缺乏雄激素后凋亡。雄激素非依赖型前列腺癌（,Androgen Independent prostatic carcinoma AIPC,）,BCl-2,（,+,）时，治疗效果差。转移性前列腺癌,70%,病人只有短暂疗效，,3,年内复发转变为,AIPC,，新研究发觉抗寄生虫药“苏拉明（,suramin,）可诱导,AIPC,中癌细胞凋亡。,第52页,膀胱癌,也是一个常见肿瘤，复发率高，,10-25%,浸润，预后差。研究结果显示，从正常移行上皮演变为,级、,级膀胱癌时,BCl-2,表示显著低于,级膀胱癌，提醒,BCl-2,可能在肿瘤进展和转移中起一定作用。,小细胞肺癌,BCl-2,、,BCl-XL,表示为主；而非小细胞肺癌以,BCl-XL,为主，,BCl-I,基因家族表示失衡对肺癌细胞凋亡有主要作用。总之增加癌细胞凋亡能干扰肿瘤生物学过程。,第53页,（二）肿瘤细胞凋亡与基因调控,依据调控基因功效分为两大类，这两类基因相互作决定细胞生死命运。,细胞增殖抑制基因,p35,、,p53,、,RB,、,DOC,（与粘附分子类似基因）、,WT-1 1,、促进细胞凋亡基因 （,wimls tumor type-1,）、,DAD 1,、等,自杀基因（,suicidal gene,）,凋亡蛋白，凋亡基因,细胞凋亡促进基因（,APO-1/Fas,、,TGF-,、,SP2,、,Bax,、,c-rel,、,Bel-XS,、,Bak,）,2,抑制细胞凋亡基因 促进细胞增殖基因（,c-myc,、,c-eld 1,、,ras,、,v-src,）,（生长基因,/,抗凋亡基因）,抑制细胞凋亡基因（,Bcl-2,、,EIB,、,LMW-5-HL,、,C-Kit,、,Bel-XL,）,第54页,（三）凋亡相关基因有三类：,1,、,细胞凋亡过程表示基因，多数抑癌基因；,2,、,促细胞凋亡基因，多数抑癌基因；,3,、,抑制细胞凋亡基因，多数癌基因。,第55页,凋亡与细胞增殖有许多潜在联络。从细胞形态学上看，细胞凋亡与有丝分裂超微结构事件，如核膜消失、染色体凝集、细胞膜内陷等有许多共同之处；从分子水平上看，有许多原癌基因和抑癌基因与细胞增殖和凋亡相关，它们经过各自通道参加细胞凋亡调控，研究较多基因有,BCL2,、,Caspase,家族、,IAP,家族、,Fas,、,P53,、,Cmyc,等,。,第56页,1.Bcl-2,家族,Bcl-2,家族包含一组相关蛋白，它们分别与,Bcl-2,在,4,个保守区含有同源结构域,(BH1-4),，并以此作为结构基础，形成同源性或异源性二聚体，经过蛋白,蛋白之间相互作用，调整细胞凋亡，在细胞凋亡路径上游远端，组成一个主要细胞内凋亡调控点。,第57页,（,1,）,Bcl-2,家族组成,第58页,第59页,细胞内,Bax,高表示时，细胞对死亡信号敏感，加速细胞凋亡，当,Bcl-2,高表示，,Bcl-2,可与,Bax,形成异源性二聚体，抑制细胞凋亡。所以,Bcl-2,Bax,百分比对决定细胞凋亡敏感性起主要作用，抑制凋亡因子,/,促进凋亡因子总比率，最终决定细胞生存或死亡。,第60页,（,4,）,Bcl-2,在肿瘤中表示与肿瘤发生,：,Bcl-2,在各种肿瘤中表示已得到证实。普通来说，,Bcl-2,阳性肿瘤要比,Bcl-2,阴性肿瘤预后差。在一些比较常见恶性肿瘤中，,Bcl-2,表示经常阳性有：慢性淋巴细胞白血病、慢性髓白血病伴有原始细胞危象者和急性髓白血病几乎,l00,阳性，滤泡淋巴瘤,80,阳性，,T,、,B,非霍奇金淋巴瘤,65,阳性，霍奇金淋巴瘤,40,阳性，乳腺癌,80,阳性，神经母细胞瘤,40,阳性，鼻咽癌,80,阳性，前列腺癌,75,阳性，肺鳞癌,25,阳性，肺腺癌,10,-15,阳性。,第61页,在,85,滤泡型恶性淋巴瘤，存在,t(14,；,18)(q32,；,q21),。这一染色体易位使位于,14,号染色体长臂免疫球蛋白重链基因和位于,18,号染色体,bcl2,基因转录活性位点拼接，造成,bcl2,基因过分表示，使,B,淋巴细胞免予凋亡而长久存活，并可能附加其它基因突变而发展成淋巴瘤。,Bcl-2,免疫染色最惯用于区分反应性滤泡性淋巴瘤。,在甲状腺中，,Bcl-2,抗体还不能用于区分桥本甲状腺炎和低分化,MALT,淋巴瘤。,第62页,Bcl-2,第63页,Follicular lymphoma(Bcl-2 immunostaining),第64页,Follicular lymphoma:Bcl-2,第65页,反应性增生淋巴结,第66页,Bcl-2,免疫染色,第67页,在生发中心,Bcl-2,阳性,:,怎样判断,?,第68页,同时做,CD3,免疫染色证实为生发中心,T,细胞浸润,第69页,2.Caspase,家族,Caspase,家族是一组蛋白酶，介导即将死亡细胞高效而特异蛋白水解作用，是细胞凋亡执行者。,Caspase,蛋白水解酶有,2,个特征：,、,都是半胱氨酸蛋白酶；,、,作用部位都在天冬氨酸残基后位点,.,第70页,Caspase,家族,功 能,凋亡 其它,caspase-4(TX/ICH-2/ICEref-),炎症,caspase-5(TY/ICEref-),炎症,caspase-13(ERICE),m,caspase-11(ICH-3),m,caspase-12,炎症,caspase-1(ICE),炎症,caspase-14(MICE),caspase-3(CPP32/apopain/Yama),效应者酶,caspase-7(Mch3/ICE-LAP3/CMH-1),效应者酶,caspase-6(Mch2),效应者酶,caspase-8(MACH/FLICE/Mch5),开启者酶,caspase-10(Mch4),开启者酶,caspase-2(ICH-1/mNedd2),开启者酶,caspase-9(ICE-LAP6/Mch6),开启者酶,CED3,第71页,Caspase,家族组成,至今已发觉有,14,种,Caspase,，分为,3,组。,1,、,Caspase-2,，,-8,，,-9,，是细胞凋亡起始,Caspase,，,2,、,Caspase-3,，,-6,，,-7,，执行细胞凋亡，是效应,Caspase,。,这两组,Caspase,在细胞凋亡中缺一不可。,3,、由,Caspase-1,，,-4,，,-5,组成，与细胞凋亡关系不是很亲密，可能与各种炎症因子成熟相关。,第72页,(2)Caspase,活化路径,Caspase,家族蛋白都是以,非活性酶原,方式存在于胞质中，当它们经过一定路径被,活化,后，依据一定次序，,裂解,一些主要蛋白底物，造成对应,底物活化或灭活,，最终可能需经过,信号转导路径,，产生,凋亡,细胞一系列形态和生物化学改变。,第73页,3.IAP,家族,IAP,家族是抑制细胞凋亡作用一组蛋白。在人类已确认有,6,种,IAP,相关蛋白,(NAIP,、,c-IAP1,hIAP-2,、,c-IAP2,hIAP-1,、,XIAP/hICP,、,Survivin,和,BRUCE),，有研究表明，以上蛋白过表示，都能够不一样程度地抑制各种原因如,TNFR,、,Fas,受体介导、柔红霉素、,VP,16,诱导以及去除生长因子后所引发细胞凋亡。有研究表明在酵母和哺乳动物细胞中，,IAP,家族蛋白抑制,caspase,活性，抑制细胞凋亡，作用强度为,XIAPc-IAP2,c-IAPl,Survivin,。,第74页,5,种,IAP,在人体内不一样组织中分布不一样,。,XIAP,分布较广，除外周血白细胞以外，成人或胚胎其它组织中都有表示；,c,lAPl,、,c,IAP2,在肾、小肠、肝、肺和神经系统（低级）表示较高。,NAIP,在成人肝、胎盘中有所表示，脑中亦有微量表示，,RT,PCR,方法可检测到。,Survivin,在正常细胞中，除了正在分裂细胞之外，它在成熟终末分化组织中基本无表示，而在胚胎发育过程中和人部分肿瘤组织中表示，是一个新肿瘤标识，有报道说，,Survivin,与肿瘤细胞抗药性、肿瘤转移过程中血管生成以及一些肿瘤如神经母细胞瘤等预后不良相关。,第75页,4,、,Fas,：,也称为,APO-1,（,CD95,），是,1989,年两家试验室同时发觉在细胞株表面介导凋亡蛋白分子，属于,NTFR,（肿瘤坏死因子受体）和,NGFR,（,N,生长因子受体）家族，分子量,45000,，细胞膜抗原，能抑制肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，许多耐药与复发肿瘤中,CD95,和,Fasl,突变，尤其在淋巴瘤、白血病和肠癌病人中常有,Fas APO-1,表示，对预后有一定影响。,Fasl,为,T,淋巴细胞上,Fas,天然配基（,ligant,），,Fasl,与表示,Fas,细胞结合、即造成后者走向凋亡。,第76页,5,、,P53,：,对,P53,认识分三个阶段，在,80,年代初一经发觉就认为是一个肿瘤基因，以后发觉主要表现在癌中所以称为癌基因，经过相当一段时间后，伴随对凋亡研究深入，,89,年才证实,P53,为抑癌基因（肿瘤基因癌基因抑癌基因）。正常细胞内存在野生型,P53,对细胞增殖有抑制作用。,研究发觉细胞在转化过程中表示,P53,有三种情况：,无改变；,细胞停滞在,G1,期；,细胞凋亡。,第77页,第78页,第79页,第80页,6,、,c-myc,：,转录调整因子,c-myc,在各种肿瘤中高表示，对增殖和凋亡都有调控作用，它能够促进细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制细胞分化，即使在有肿瘤细胞,(,如,HL-60,白血病细胞,),不能直接促进凋亡，它也能增加细胞对各种凋亡诱导原因敏感性。当一些抑癌原因存在时（抗癌因子，低浓度血清，抑止细胞周期因子）、,c-myc,蛋白促进细胞凋亡。当有致癌原因存在时,c-myc,蛋白促进癌细胞增殖。,第81页,7,、其它与细胞凋亡相关基因：,死亡基因,ced3,、,ced4.ICE(interleukin-l p-converting enzyme),是哺乳动物细胞凋亡蛋白酶，与线虫凋亡基因,ced3,同源，在细胞凋亡中起“刽子手”作用，能够诱导各种类型凋亡；不过,ICE,介导细胞凋亡受,BCL2,所抑制。,吞噬基因,参加凋亡细胞吞噬，并非造成细胞死亡，如,ced1,、,ced2,、,ced6,、,ced7,、,ced8,；,核酶基因,Nmc-1,第82页,第83页,(,四,),凋亡与肿瘤治疗研究,鉴于凋亡是肿瘤细胞死亡一个形式，又有如此众多癌基因和抑癌基因参加凋亡调控，因而人为地施加影响以,激发凋亡诱导基因活性和降低凋亡抑制基因活性，可能是治疗肿瘤有效路径,。实际上，当前临床上所采取各种抗肿瘤治疗方法如化疗、放疗、物理治疗、生物治疗、促细胞分化治疗甚或基因治疗多是经过诱导细胞凋亡，以求到达治疗肿瘤目标。,第84页,肿瘤疗效判定应考虑到,：,、,是否经过治疗后发生凋亡，这是肿瘤化疗效果好坏关键之一；,、,增加凋亡指数（,Apoptosis Index,）与增生指数,(proliferatory Index),比值,AI/PI,，已成为新治疗目标；,、,同时能否诱导细胞凋亡已成为筛选抗癌药品新标 准；,、,诱导细胞凋亡治疗将是对肿瘤治疗方法主要补充与革新。,第85页,当前治疗肿瘤新构想,在肿瘤治疗中诱导凋亡,。,1,、导入,P53,（野生型,WT,）抑制肿瘤增生；,2,、下调突变型,P53,BCl-2,活性与表示，减弱其对细 胞凋亡抑制；,3,、抑癌基因引入瘤细胞，降低致瘤性，使肿瘤细胞逆转为正常细胞；,4,、引入一些细胞因子，抑制肿瘤恶性表型，使细胞丧失致瘤性；,5,、应用点突变技术，使异常表示癌基因失活或修复突变基因；,6,、导入药品敏感基因，有利于细胞凋亡；,第86页,九、凋亡与其它疾病,1,、细胞凋亡异常增加（不该死死了）,神经系统退行性变：,a,、老年性痴呆；,b,色素性视网膜炎；,c,、帕金氏综合征,骨髓发育不良综合征（恶性贫血）,缺血性损伤：心肌梗死；缺血缺氧性脑病；肾小球肾炎,肝病变：病毒性肝炎和酒精性肝炎,AIDS,第87页,2,、细胞凋亡过分降低（该死不死）：,本身免疫性疾病：,a,、系统性红斑狼疮（,SLE,）；,b,、肾小球肾炎（,GN,）等,肿瘤：,a,、激素依赖性肿瘤（乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌）；,b,、造血系统肿瘤（淋巴瘤、白血病）等,各种病毒感染：,腺病毒、疱疹病毒、痘病毒等,第88页,十、凋亡检测方法,1972,年,keer,提出细胞凋亡概念，,1980,年用电泳检测细胞凋亡，并证实了,DNA,断裂特征。,1986,年在秀丽降杆线虫（,caeovhabditis elegan,）中观察,1090,个体细胞，其中,131,个细胞在发育过程中经过凋亡而消失，并找到两个基因,ced3,、,ced4,，他们表示与细胞凋亡亲密相关，故称为死亡基因。所以细胞凋亡检测经历以下几个过程；,从单纯形态学辩认形态与生化结合形态、生化、分子生物学技术相结合各种伎俩。,第89页,（一）凋亡检测要处理问题是：,1,、,被研究体系中是否有凋亡发生，即定性。,2,、,凋亡发生率，显示群体细胞量度。这是一个相正确概念，应同时结合细胞群体增殖率来分析，则更客观，更能反应细胞群体生长状态。,3,、,了解细胞凋亡严重度，以反应凋亡阶段。,第90页,（二）检测细胞凋亡各种形态学方法比较,检验方法 可判定凋亡细胞特征,光学显微镜（,LM,）细胞缩小、核浓缩、细胞周围透明圈,相差显微镜（,PCLM,）细胞鼓泡，凋亡小体,透射电镜（,TEM,）微绒毛消失、核染色质沿核膜分布,新月体形成、凋亡小体,激光共聚焦（,CLSM,）凋亡细胞固缩染色质及核碎片定位,扫描电镜（,SEM,）细胞表面泡状突起,流式细胞仪（,FCM,）低前向散射光、高侧向散射光,缩时摄影术（,TLP,）凋亡细胞形成过程,第91页,2,、流式细胞仪检测,细胞凋亡时膜通透性增加介于正常细胞与坏死细胞之间，用荧光素染色细胞悬液，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞。惯用,Hoechs-PI,染色，正常细胞对染料拒染，荧光着色淡。凋亡细胞主要摄取,Hoechs,染料呈强蓝色荧光。坏死细胞,DNA,有强嗜,PI,性呈强红色荧光。,第92页,3,、核酸电泳检测细胞凋亡,（,DNA,片断检测细胞凋亡）,细胞凋亡和坏死时，细胞中,DNA,发生断裂，小分子,DNA,片断增加，高分子,DNA,降低，胞浆内出现,DNA,片断，然而凋亡细胞,DNA,断裂是由内源性内切酶作用，断点都是规律性发生在核小体之间，所以出现,180-200bp,及其倍数,DNA,片断。坏死细胞,DNA,片断是无特征杂乱片断。在凝胶电泳中出现特征性泳带能够判断凋亡细胞，这方法缺乏定位特征，无法确定哪个细胞发生凋亡。,第93页,4,、酶联免疫吸附法,(ELISA,法,),ELISA,方法检测细胞凋亡后形成由组蛋白及,DNA,片断组成核小体。此方法敏感性高，所需细胞数少，可检测低至,510,2,/m L,凋亡细胞。另外，此方法不需特殊仪器，比较适合基层工作。,缺点,:,(1),不能准确测定凋亡发生绝对量,;,(2),适合单一成份细胞检测，对于多细胞成份组织或细胞混合物，不能判定凋亡发生在哪种细胞,;,(3),不能提供单个细胞或相关细胞组织学定位。,第94页,5,、,DNA,片断原位标识,1993,年,Wifsman,等提出,DNA,片断末端标识法，,Fehsel,等,1994,年提出原位缺口转移检测细胞凋亡方法。这些方法提出把凋亡研究带进了新阶段，尤其是这些技术发展为原位凋亡检测试剂盒，,早期凋亡检出,TUNEL,。,缺点,:,(1),坏死细胞亦有,DNA,裂点形成，也可展现,TUNEL,反应阳性，因而特异性较差。,(2)TUNEL,结合免疫组化检测时，固定过程对检测影响较大，切片大小、薄厚会直接影响到固定效果，从而产生结果差异。,第95页,Tunel,反应：探针靶核酸,DNA-DNA,为间接法,杂交体,探针,半抗原标识物,标识探针,靶核酸,杂交体,酶标特异性抗体,显色,间接法原位杂交示意图,第96页,第97页,DAB,镜下控制,显色,水洗,75,酒精,85,酒精,95,酒精 无水酒精,（,Tunel,检测法,）,第98页,灌注固定大鼠肝，,Tunel,反应阳性，,DAB,显色，血管内无红细胞背景染色。,125,第99页,非灌注固定大鼠肝，,Tunel,反应阳性，肝细胞核,BCIP/NBT,显色呈紫黑色，血管内红细胞呈桃红色。,250,第100页,RNA,酶,(RNase),保护试验,这种高度敏感试验技术起源于对一些噬菌体,DNA,依赖性,RNA,聚合酶研究，这种酶是从,DNA,模板上合成高度特异性,RNA,探针理想工具，用来检测和定量研究,mRNA,。这么，,cDNA,片断能够被克隆到含有噬菌体引物质粒中，并可用来合成放射性标识反义,RNA,探针。,应用人类凋亡模板试剂盒中,32P,标识反义,RNA,探针与从标本中分离,RNA,杂交，再行,RNA,酶处理。最终用放射自显影或吸光度分析法分析翻译产物。此试验优点是敏感性高，可在一份总,RNA,标本中同时定性不一样种类,mRNA,第101页,用,RT-PCR,方法进行,mRNA,半定量分析,提取细胞,RNA,，与逆转录酶、,RNA,酶抑制剂,(RNA sin),和,dNTP,孵育合成,cDNA,，然后在特异性,cDNA,引物诱导下进行,PCR,反应，最终琼脂糖凝胶电泳测定,PCR,反应产物大小。试验灵敏性很高，不过对于细胞组成不单纯组织或细胞悬液说来，不能确定与凋亡相关基因,mRNA,起源于哪类细胞，所以还应该进行蛋白表示研究。,第102页,截止当前为止，凋亡检测方法已经有许各种，但任何一个方法都有本身缺点和应用不足，影响检测结果判断和意义分析。假如需要处理这些问题，在检测中已测出有凋亡发生时，怎样解释结果？怎样与疾病和肿瘤发生发展联络起来呢？,第103页,首先我们必须建立正常时该体系凋亡状态，正常对照组，以判断检测组凋亡是生理性，还是病理性。,同时检测该体系细胞增殖状态，对照该体系增殖指数和凋亡指数，以判断该体系细胞周转率。,建立致病原因对被测体系影响对照组，确定该致病原因与被测体系细胞增殖、凋亡相关性（对照组控制）。,怎样定量与排除其它干扰。,第104页,十一、凋亡生物学意义,细胞凋亡是生物体内无用、老化、或一些损伤细胞死亡一个形式，不引发局部组织损伤或炎症反应，主要意义在于生物进化需要。竞争性选择机制，是确保个体发育、成熟、和维持正常生理过程所必需。,1,、去除多出细胞,2,、去除无用细胞,3,、去除有害细胞,4,、去除衰老细胞,5,、有选择性地去除细胞,第105页,十二、存在问题与展望,即使发觉细胞凋亡现象已经近,40,年，但人们真正认识到其重大理论和实际意义，还是近几年事。细胞凋亡分子机制研究说明细胞凋亡过程是受基因调控，是主动连续程序化反应，在细胞凋亡研究中还有许多关键问题末处理。,第106页,1,、在细胞发育过程中,细胞凋亡终究是何时，又是怎样开始？（时间与方式）；,机体是怎样决定一个细胞将要走向死亡；,在细胞有丝分裂和成熟之间有没有能激活细胞凋亡开关点基因（,Switch point gene,）存在？,第107页,2,、机体内有没有真正杀手基因（,Killer gene,）存在,?,死亡相关基因是怎样调控？,3,、细胞凋亡终究是经过哪些信号传导路径起作用？,4,、哪些疾病与细胞凋亡规律失常相关？能否经过调控细胞凋亡来到达治疗目标？,5,、细胞凋亡与衰老关系怎样？是否有活命基因（,survival gene,）存在,?,第108页,假如能发觉凋亡特异性基因或其产物，或其它特异性标志物，就可能成为检测凋亡指标。当前对凋亡认识是一个连续过程，深入研究可能会发觉凋亡存在不一样阶段，而不一样阶段可能会出现不一样标志物，从而发觉凋亡阶段性标识物。,凋亡机制在细胞生长、发育过程中所含有独特生物学效应，能够经过增加或降低一些特定细胞对凋亡敏感性来发展治疗疾病新方法和药品。,阻断凋亡可能有利于艾滋病治疗，一些,N,激素基因替换疗法可能对中枢,N,系统退行性病变有益。,第109页,应该认可对细胞凋亡研究还刚才开始，怎样利用分子生物学和细胞生物学等当代最新技术，从分子水平上深入揭示细胞凋亡开启，发生和发展规律，为研究胚胎发生、发展、个体形成、器官细胞平衡稳定、本身免疫性疾病、肿瘤形成原因等增加新理论内容，并以此来指导医疗实践，还有很多工作要做。,第110页,
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