质粒DNA的提取、定量、PCR鉴定.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,质粒,DNA,的提取、定量、与,PCR,鉴定,王妮莎,1,一、实验流程,简述实验内容流程，,PCR,操作步骤,煮菌，,PCR,（,PCR,程序最后设,4,保温）,约,2,小时收集,PCR,产物,学习,PCR,原理,质粒,DNA,提取,（约,1,小时）,紫外检测定量知识（计算方法），步骤,紫外检测,定量,琼脂糖电泳原理,电泳,（样品：质粒,DNA,，,PCR,产物，酶切产物，,Marker,）,约,30,分钟,观察电泳结果、,记录、拍照、保存,2,二、实验目的,掌握碱裂解法提取质粒的方法,了解和掌握紫外吸收检测,DNA,浓度与纯度的原理和测定方法,学习水平式琼脂糖凝胶电泳，检测质粒,DNA,的构型、分子量的大小,掌握,PCR,基因扩增的原理和操作方法,3,聚合酶链式反应,(PCR),Polymerase Chain Reaction,4,仪器,:PCR,仪,(BioRad MJ mini),台式离心机,灭菌的薄壁离心管,微量加样枪,凝胶电泳系统等,凝胶成像系统,一、实验仪器,5,6,1,、,菌液：,DNA,模板,大肠杆菌,DH5a,菌株,(,含靶基因,CHD5,片段的,pMD19-T,),二、实验材料,抑癌基因,7,2,、引物：正向引物：,5 GTA,AAA,CGA,CGG,CCA,GT 3,反向引物,:5 CAG,GAA,ACA,GCT,ATG,AC3,3,、,2Premix,：,Taq,酶：,5U/l,4dNTP:10mM each,10buffer:500mM KCl,100mM Tris-HCl(pH 8.3),MgCl2:25mM,4,、灭菌去离子水,二、实验材料,8,94,预变性,2,分钟后开始以下循环,94 30,秒,55 30,秒,30,循环,72 60,秒,72 8,分钟；,4,保温。,实验过程约,1,小时,30,分钟,三、实验步骤,9,温度（,）,时间（,min,）,94,72,50,94,变性（,30s,）,50,退火（,30s,）,72,延伸,（,60s,）,循环,1,循环,2,循环,3,PCR,反应的温度循环周期,PCR,反应的每一个温度循环周期都是由,DNA,变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是,94,变性,30s,，,50,退火,30s,，,72,延伸,60s,。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,DNA,变性,形成,2,条单链,DNA,单链,与引物复性,子链延伸,DNA,加倍,10,灭菌去离子水,11,l,2*,Premix,25,l,正向引物,-,SO100,(10,M),2,l,反向引物,-,SO101,(10,M),2,l,菌液：,10,l,总体积,50,l,菌液煮沸,10min,2,、取,0.2 ml PCR,反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂,(,注意每换一种试剂换一个新吸头,且,PCR,反应管标记在侧面,),：,如配好的反应液较多沾到管壁上，可将,PCR,反应管置台式离心机中瞬时离心或者将反应管盖上盖子使劲甩，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪,(PCR,仪,),上。,11,四、结果分析,1,、用,1%,的琼脂糖凝胶电泳鉴定,;,2,、加,5uLPCR,产物进行电泳,;,3,、预期,PCR,产物大小约,400500bp;,12,*,由,1985,年穆里斯（,K.Mullis,）发明，他也因此获得了,1993,年的诺贝尔化学奖。,PCR,（,Polymerase Chain Reaction,）即聚合酶链式反应，是指在,DNA,聚合酶催化下，以,DNA,为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在,体外复制,DNA,的过程。,五、实验原理,13,14,15,PCR,反应系统的组成,模板,DNA,引物,dNTP,耐热的,DNA,聚合酶,缓冲液,16,(,一,),模板,DNA,PCR,可以以,DNA,或,RNA,为模板进行核酸的体外扩增。,模板的浓度要适当,基因组,DNA,：,50-100,ng,质粒,DNA:5-10,ng,95,模板,DNA,17,(,二,),引物,与摸板,DNA,链互补的小片段,DNA,分子；作为,DNA,复制的起始点，即与目的片段互补的一段寡核苷酸链。,PCR,特异性反应的关键；,引物,1,引物,2,55,18,引物的特异性：,引物的设计与合成对,PCR,的成功与否起着决定性的作用,引物的浓度：引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性,引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成,一般认为,PCR,反应中引物的终浓度为,0.2,1mol/L,为宜,引物的设计：使用引物设计软件,Oligo 6,Primer premier,NTI,9.0,Omiga,Dnastar,等,19,引物的设计原则：,1.,长度,一般为,1530 bp,2.,G,C,含量,一般为,4060,3.,引物二聚体,（,1,）不应有自身互补序列,（,2,）两个引物之间不应有多于,4,个碱基的互补,4.,引物修饰,5,端可修饰，,3,端不能进行修饰,5.,同源性,与非特异结合区同源性不超过,70,6,、,Tm,值,高于,55,20,（三）,Taq,酶,从水生栖热菌,Thermus,Aquaticus,（,Taq,）中分离出的热稳定性,DNA,聚合酶,酶浓度：,酶的浓度太低会使扩增产物产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异性扩增,每,100l,反应液中含,1-2.5U,Taq,DNA,聚合酶为佳,保存：,-20,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,21,Taq,DNA,聚合酶（,thermus aquaticus),酶活性,(%),温度,(),40 50 60 70 80 90,100,80,60,40,20,22,（四）,dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg2+,结合，使游离的,Mg2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,23,（五）,Mg2+,Mg2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5mmol/L-2.5mmol/L,反应体系。,Mg2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg2+,过高影响反应特异性。,Mg2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg2+,浓度。,24,变性温度与时间,变性充分：变性温度越高，时间越长变性就越充分。,变性温度、时间要适应：温度过高、时间过长又会影响,Taq DNA,聚合酶的活性，,变性温度,90-95,为宜。,退火温度与时间：,复性温度决定着,PCR,的特异性。温度越低复性越好，,升高复性温度可以增加非特异性结合，大多数,PCR,反应的,复性温度在,35,70,一般低于引物,Tm,值的,5,左右。,复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。,引物延伸温度一般为,72,。,延伸时间：,72,时，核苷酸的合成速度为,35-100,个核苷酸,/S,，这取决于缓冲体系、,pH,、盐浓度和,DNA,模板的性质。然而，延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现。,延伸温度与时间：,25,PCR,循环次数,循环次数要恰当：一般是循环次数过多，非特异性背景严重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。,常规,PCR,循环次数一般为,25,40,个周期。,26,PCR,相关技术,27,荧光定量,PCR,（,real-time PCR,）,PCR,相关技术,融汇,PCR,技术、,DNA,探针杂交技术（标记有荧光报告基团与荧光淬灭基团），结合先进的光谱检测技术发展起来的一项新技术，通过测定荧光强度来对,PCR,产物进行实时定量。,28,PCR,相关技术,优点：起始定量,29,PCR,技术的主要用途,（一）目的基因的克隆,（二）基因突变,（三）,DNA,和,RNA,的微量分析,（四）,DNA,的序列测定,（五）基因的突变分,析,30,PCR,的临床应用,遗传病的诊断：,-,地中海贫血诊断、产前诊断、肝癌研究、,-1,抗胰蛋白酶缺陷症、苯丙酮尿症、痛风病等诊断研究,生物识别：,PCR,已用于人免疫缺陷病毒（,HIV,）、乙肝病毒（,HBV,）、人乳头瘤病毒（,HPV,）等十几种病毒检测,癌基因的研究：选择肿瘤基因突变部位进行扩增，可协助对肿瘤的诊断。,31,质粒,DNA,的提取与定量,Extraction and Quantitation of Plasmid DNA,32,一、什么是质粒？,独立于细菌染色体以外，能独立自主复制的闭合环状,DNA,分子；,基因工程常采用的,载体,33,质粒提取方法,方法：,碱裂解法,煮沸裂解,羟基磷灰石柱层析法,酸酚法等。,概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理,选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：,质粒的大小,大肠杆菌菌株,裂解后用于纯化的技术和实验要求,34,基本步骤,所有分离质粒,DNA,的方法都包括,3,个基本步骤：,1),培养细菌使质粒扩增,2),收集和,裂解细菌,3),分离、纯化质粒,DNA,分离质粒,DNA,三步曲,分离,质粒,收集,裂解,细菌,质粒,扩增,35,二、实验原理,基于,染色体,DNA,与,质粒,DNA,的,变性与复性,的差异而达到分离目的。,碱性条件下：,染色体,DNA,的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。,质粒,DNA,的大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。,pH,值至中性：,染色体,DNA,不能复性形成网状结构，通过离心，与不稳定的大分子,RNA,、蛋白质,-SDS,复合物等一起沉淀下来而被除去。,质粒,DNA,恢复原来的构型。,36,37,三、实验材料,宿主菌：大肠杆菌,DH5a,菌株,载体：,PMD-18T,质粒,插入片段基因：,CHD5,CHD5,38,米尔副教授领导的研究小组发现的,CHD5,，其编码基因位于,1,号染色体的特异部分（,1p36,）。当,CHD5,失去功能的时候，细胞内平时起抑癌作用的系统会被关掉。,CHD5,如同肿瘤抑制网络的总开关，这提示,CHD5,与多种人类癌症有关。根据,CHD5,的调节功能，可以设计更好更有效的癌症治疗策略。此前，这个基因一直是个谜。这项研究对未来的癌症治疗将产生重要影响，提高,CHD5,的表达量会带来额外的抑癌效果。临床实验中也发现，许多神经胶质瘤患者的,CHD5,基因缺失，说明,CHD5,与人类癌症有莫大关系，打开,CHD5,开关功能的药物可能会对很多种癌症的治疗有效。,补充知识：,模板基因,39,溶液,P1,（细菌悬浮液）,已加入,RNaseA,溶液,P2,（细菌裂解液）,溶液,P3,（中和液）,去蛋白液,PE,洗脱液,WB,已加入无水乙醇,灭菌水,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅,（二）材料：含,pMD18-T,质粒的大肠杆菌,DH5,（三）试剂：,LB,培养基（液体、固体）,Bioteke,质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）,40,溶液,I,50 mmol/L,葡萄糖,25 mmol/L TrisCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA(pH8.0),2,mg,/,m,L,溶菌酶,作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块,41,溶液,II,0.2 mol/L NaOH(,从,5mol/L,贮存液中现用稀释,),1%SDS,作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,注意：时间勿太久，动作要温和，轻轻颠倒几次,42,溶液,III,5mol/L,乙酸钠,60ml,冰乙酸,11.5ml,水,28.5ml,所配成的溶液中钠的浓度为,3mol/L,，乙酸根的浓度为,5mol/L,。,作用：酸性条件下质粒,DNA,复性，变性蛋白,-SDS,线性,DNA,沉淀，,Na,可中和,DNA,注意：复性时间不宜过长,43,2,、离心层析柱,硅基质膜在高盐、低,pH,值状态下选择性地结合溶液中的质粒,DNA,，不吸附蛋白质、多糖等物质；,通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；,低盐，高,pH,值的洗脱缓冲液将纯净质粒,DNA,从硅基质膜上洗脱；,44,四、实验步骤,取,1.5ml,培养物加入,Eppendorf,管中,9000rpm30 s,，,弃上清,加入,250l,溶液,P1,，吹打，使细菌沉淀分散，,彻底悬浮,。,加入,250l,溶液,P2,，颠倒,6,10,次混匀（,不要剧烈振荡,），直到溶液变得,清亮,.,加入,400l,溶液,P3,，立即,温和,混匀，室温放置,3-5min,。,13000rpm,离心,10min,，小心,取上清液（,700-800,l,）,。,将,吸附柱,放于收集管中，将上一步所得上清液加入,吸附柱,中，,13000rpm,离心,3min,，,弃滤液,。,加入,500l,去蛋白液，,13000rpm,离心,1min,，,弃滤液,，,向吸附柱中加入,500l,漂洗液,WB,，,13000rpm,离心,1min,，,弃滤液,。,重复步骤,8,一次。,空柱,13000rpm,离心,2min,，然后室温放置,3-5min,，使残留乙醇挥发。,取出吸附柱,，放入一个干净的,离心管,中，在吸附膜的中间加,60l-100l,洗脱缓冲液，室温放置,1min,，,13000rpm,离心,1min,洗脱质粒,DNA,，,-20,保存备用。,45,质粒定量检测,紫外分光光度计法,原理：,1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,2,而且物质对光的吸收是具有选择性的,3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,46,一、质粒定量,紫外吸收检测质粒,DNA,的浓度,因为组成核酸的碱基,(G,A,T,C,）在,260nm,处具有强吸收峰，所以通过测定,260nm,的吸收峰即可对,DNA,进行定量。,dsDNA(,双链,DNA),1OD,260,=50ug/ml,ssDNA(,单链,DNA),1OD,260,=33ug/ml,RNA,1OD,260,=40ug/ml,记录,OD,260,值，通过计算确定,DNA,浓度，公式如下,:,质粒,DNA(,g,/ml)=50(OD,260,),稀释倍数,47,根据在,260nm,以及在,280nm,的读数比值,（,A260/280,=,OD,260,/OD,280,）,估计核酸的纯度,A260/280,=1.8,DNA,样品较纯,符合实验要求,A260/280,1.9,RNA,污染,A260/280,1.6,有蛋白质或其它杂质的污染,注意,:eppendorf,公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒,DNA,的最终浓度和,A260/280,值,.,A260/A280,可以反应,DNA,的纯度：,48,二、实验仪器,核酸蛋白测定仪,比色杯,49,三、实验方法,1,打开仪器电源开关，无需预热。,2,根据样品的不同，在仪器控制面版上选择对应的方法组，如测量质粒,DNA,浓度选 ，测量,RNA,浓度选 等，以此类推。,3,选择进入方法组后，选择你所需要的方法，然后按,enter,键 确认。,4,按,parameter/dilution,键 设置样品稀释倍数，输入样品的体积和稀释样品所用稀释液的体积，按,enter,键 确认。（,取质粒,DNA,样品,2l+98l,灭菌水）,5,后推打开仪器上放置石英比色皿的槽盖。,6,按照设置的稀释方法，先向石英比色皿中加入对应体积的空白稀释液，然后把石英比色皿放入检测槽，按,blank,键 进行调零。,7,再按照设置的稀释方法，向石英比色皿中加入对应体积的样品，并用微量加样器轻轻混匀。,8,按,sample,键 ，仪器会根据样品的稀释倍数自动计算出样品的最终浓度。,注意事项：,1,为确保液体始终处于检测区的中心位置，被检测样品的体积必须,50ul,。,2,为避免石英比色皿受到污染，每次检测样品浓度前后都要用灭菌蒸馏水或去,RNase,水清洗石英比色皿,3,实验结束后，前推盖上检测槽的槽盖，并关掉仪器电源。,50,数据处理,测量次数,质粒,DNA,浓度,(,g/ml),Ratio,值,(A,260,/A,280,),1,2,3,平均值,51,琼脂糖凝胶电泳,DNA a,garose gel electrophoresis,52,一、琼脂糖凝胶,天然琼脂（,Agar）,是一种多聚糖，主要由琼脂糖（,Agarose，,约占80）及琼脂胶（,Agaropectin）,组成。,琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。,琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳,。,53,在一定电场强度下，,DNA,分子的迁移取决于,分子筛效应,，即,DNA,分子本身的大小和构型,(,相对分子质量不同的,DNA,片段泳动速度不一样,),，且,DNA,分子的迁移速度与相,对分子质量的对数值成反比关系。,作用：,凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的,DNA,，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的,DNA,分子：一,般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环,。,二、琼脂糖凝胶电泳原理,染色,溴化乙锭,(EB):3,8-,二氨基,-5-,乙基,-6,苯基菲啶溴盐,),，可与,DNA,结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性。,Gelview,:,荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光,54,琼脂糖凝胶浓度与,DNA,分子的有效分离范围,胶浓度（）,线性,DNA,分子大小（,kb,）,0.3,5,60,0.6,1,20,0.7,0.8,10,0.9,0.5,7,1.2,0.4,6,1.5,0.2,4,2.0,0.1,3,胶浓度越大，越适宜分离的,DNA,越小,55,影响迁移速率因素,1,、,DNA,的分子大小,2,、琼脂糖浓度,3,、,DNA,分子的构象,4,、电源电压,5,、嵌入染料的存在,6,、离子强度影响,56,三、实验材料,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。,6loading buffer,Gelview,：荧光染料,在紫外光照射下呈现绿色荧光,TBE,：,TBE,贮液,2L,：,54g Tris-base,、,27.5g,硼酸、,20ml 0.5M,的,EDTA(pH8.0),加水至,1L,用钱稀释,10,倍,琼脂糖,：,1g,5,、,DNA Marker5000,57,DNA Marker,是分子量不同的,DNA,片段，主要用途就是,DNA,分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。,应选择在目标片段大小附近,ladder,较密的,marker,，这样对目标片段大小的估计较准确。,58,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,三、实验步骤,59,样品准备：将,6,l,PCR,产物、提取的质粒,DNA,、分别与大约为样品体积,1/6,的,loading buffer,用加样器轻轻混匀；,上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中；,盖上电泳槽，接通电源，开始电泳；,电泳条件：电压,120v,；时间,25,30,分钟；,电泳结果分析：紫外检测仪直接观察电泳条带,60,注意事项,凝胶浓度选择,根据样品,DNA,分子大小而定，所以电泳前应对,DNA,片段大小有粗略的估计。,倒胶,时把握好胶的温度，不要高于,60,，温度太高会使制板变形。,胶一定要凝固好才能拔梳子，方向要竖直向上，不要弄坏点样孔,电泳前，确认,样品孔位于电场负极,；,点样时枪头下伸，一定不要弄破胶，并且,点样孔内不能有气泡,，缓冲液不要太多,Gelview,有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔,紫外线照射不要太久,61,采用,1,琼脂糖凝胶电泳分析,PCR,产物、酶切产物以及提取的,DNA,四、结果分析,DNA-marker,质粒,DNA,PCR,产物,酶切产物,点样顺序,62,五、预期实验结果,M:DL5000 DNA Marker,1,4,7,10,为,质粒,2,5,8,11,为,PCR,目的条带,;,3,6,9,12,为酶切片段,M 1 2 3 4 5 6 7,8 9 10 11 12,5000 bp,3000 bp,2000 bp,1500 bp,1000 bp,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp,酶切长片段,含目的,DNA,片段的酶切短片段,63,温馨提示,防止紫外线对人皮肤及眼睛的损伤，避免直接照射皮肤与眼睛。,Gelview,是强诱变剂，有致癌性，操作时要带手套，防止污染。所有含有,Gelview,的溶液在弃置前应当进行净化处理。,64,一、回顾实验流程,简述实验内容流程，,PCR,操作步骤,煮菌，,PCR,（,PCR,程序最后设,4,保温）,约,2,小时收集,PCR,产物,学习,PCR,原理,质粒,DNA,提取,（约,1,小时）,紫外检测定量知识（计算方法），步骤,紫外检测,定量,琼脂糖电泳原理,电泳,（样品：质粒,DNA,，,PCR,产物，酶切产物，,Marker,）,约,30,分钟,观察电泳结果、,记录、拍照、保存,65,思考题,碱法提质粒中溶液,I,、,II,、,III,的作用？,2.,简述,PCR,产物电泳出现非特异扩增条带的原因。,66,