SN∕T 3170-2012 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法.pdf

书书书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛 犖犜 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱 犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书书书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位： 中华人民共和国北京出入境检验检疫局、 中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人： 邓丛良、 张凯、 高文娜、 吕玉峰、 梁新苗、 刘鹏。犛 犖犜 葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了进境植物检疫中葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进境植物苗木、 繁殖材料和植物产品的葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 植物病毒免疫电镜检测方法原理 葡萄皮尔斯病菌的分类地位葡萄皮尔斯病菌学名犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪 犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪 ， ， 该菌属原核生物界（ ） ， 薄壁菌门（ ） ， 木质部小菌属（犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪） 。 检疫鉴定依据以病菌在寄主上的症状特点、 病菌形态学特征及其培养特性、 病菌种的特征以及基因组序列作为葡萄皮尔斯病菌的检疫鉴定依据， 必要时辅助进行致病性测定（ 参见附录 ） 。仪器设备、 试剂及用具 仪器、 设备、 用具超净工作台、 生物培养箱、 电子天平、 酶标仪、 仪、 凝胶成像仪、 水浴锅、 高速冷冻离心机、 高压灭菌锅、 透射式电子显微镜、 冰箱、 液氮罐、 解剖刀片、 白磁盘保湿盒、 研钵、 微量移液器（ 可调式范围： ） 、 吸头（ 、 、 ） 、 离心管（ ） 、 管、 酶联板。 试剂和培养基检验所需的药品均为分析纯。检验中用到的试剂琥珀酸 柠檬酸 磷酸盐缓冲液， 其配制方法见附录。检验中用到的 培养基、 培养基、 培养基、 培养基， 其配制方法见附录。葡萄皮尔斯病菌的鉴定 双抗体夹心酶联免疫吸附（犇 犃 犛 犈 犔 犐 犛 犃） 检测利用双抗体夹心酶联免疫吸附测定法对样品进行初筛（ 见附录） ， 若检测结果为阳性， 需进行病原犛 犖犜 菌的分离培养或者 方法检测。 葡萄皮尔斯病菌的分离、 培养和鉴定 葡萄皮尔斯病菌的分离培养 植物样品叶片中葡萄皮尔斯病菌的分离培养：）叶片表面用 次氯酸钠溶液消毒 ， 然后用无菌水漂洗次；）用无菌刀片切下叶片的中脉和叶柄， 切出一个 的截面， 将汁液划线到 或 培养基上（ 柑橘叶片将汁液划线到 或者 培养基上） ；）划线后的平板放在塑料袋中于 生物培养箱中培养。 植物样品根或者茎中葡萄皮尔斯病菌的分离培养：）取根或茎用 次氯酸钠溶液消毒 ， 然后用无菌水漂洗次；）用解剖刀将根或茎切割长为 ， 直径 的小段。然后用琥珀酸 柠檬酸 磷酸盐缓冲液进行真空渗透；）真空渗透提取物（ 每个样品 ） 在 下离心 ；）离心后的沉淀用 的琥珀酸柠檬酸磷酸盐缓冲液悬浮， 取一滴（） 滴到 或 培养基上（ 柑橘用或者 培养基上） ；）平板在 中培养， 将平板放在塑料袋中防止培养基干燥。 葡萄皮尔斯病菌的菌落特征葡萄皮尔斯病菌在 培养 之后可以看到分离的菌落。菌落直径一般为 ， 圆形， 完整的边缘和表面凸起； 有时候形成的菌落具有波浪形的边缘， 表面扁平。 葡萄皮尔斯病菌的电镜观察按 的规定进行电镜观察。 葡萄皮尔斯病菌犘 犆 犚检测用 对病原菌进行检测的方法见附录 。结果判定酶联测定为阳性后， 经 检测待测样品的序列与 中已知的葡萄皮尔斯病菌同源性为 或者分离培养性状结合电镜观察为阳性即可判断为葡萄皮尔斯病菌。样品保存与复核 样品保存葡萄皮尔斯病菌为检疫性有害生物， 应做好以下准备， 并在周内接受复核。病菌要有活体样品存在， 其他实验样品应妥善保存于冰箱中， 以备复核。 结果记录与资料保存完整的实验记录包括： 样品的来源、 种类、 时间， 实验的时间、 地点、 方法和结果等， 并要有经手人和犛 犖犜 实验人员的签字。酶联测定需有酶联检测结果的原始数据， 检测需有电泳结果图片。 复核必要时由专家进行复核。犛 犖犜 附录犃（ 资料性附录）葡萄皮尔斯病菌相关材料犃 学名犡 狔 犾 犲 犾 犾 犪 犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪犠 犲 犾 犾 狊 犲 狋犪 犾 木质部难养细菌。犃 英文名 （ ） 。犃 分类地位薄壁菌门（ ） 木质部小菌属（犡 狔 犾 犾 犲 犾 犪） 木质部难养菌（犡犳 犪 狊 狋 犻 犱 犻 狅 狊 犪）犃 分布主要分布于法国、 意大利、 前南斯拉夫、 印度、 哥斯达黎加、 加拿大、 墨西哥、 美国、 阿根廷、 巴西、 巴拉圭、 委内瑞拉和南斯拉夫。我国台湾也有报道。犃 寄主宽皮橘（ 松橘） 、 甜橙（ 黄果、 广橙） 、 莴苣、 毒参属、 茜草科等 种植物。犃 主要症状侵染葡萄初期沿叶片边缘出现微黄色或红色病斑， 后期病斑形成同心轮纹状， 叶片干枯死亡。症状因品种而异， 在黑皮诺和赤霞珠品种上， 沿叶片边缘形成规则、 边缘逐渐褪色的病斑； 在无核白、 西万尼和白诗南品种上， 在叶脉间组织形成褪色的病斑。早秋时叶片干枯脱落， 只留下叶柄挂在茎蔓上。枝条： 感病新梢推迟老化成熟， 枝蔓表面形成“ 绿岛” 症状的病斑。如果当年没有明显症状， 在次年春天也会出现生长延迟和矮化的现象。果实： 发病果实一般停止生长， 逐渐枯萎， 有的病果可能提前着色， 但并不成熟。在感病第一个季节末期， 通常只有个个枝蔓出现明显病状， 随着病情发展逐渐沿蔓扩展向根部发展， 整个植株长势变弱， 症状逐渐明显。到了中期， 感病枝蔓上的一些或全部枝蔓萎蔫干枯， 枝蔓顶端和根可能全部死亡。葡萄感病第年， 一些枝蔓或短果枝会不发芽。有的枝蔓从月末到夏季， 可能正常发芽， 但全部新生枝条生长缓慢， 新叶叶脉间出现黄化。老叶出现萎缩， 在夏季末， 叶片边缘出现灼伤症状， 果穗皱缩干枯。犃 病原病原是一种细小的革兰氏阴性细菌， 具有数层卷绕的细胞壁和胞外纤维束。电镜下观察该菌为杆犛 犖犜 状， 大小为（ ）（） 单生， 无鞭毛， 革兰氏染色为阴性， 细胞壁波纹状， 无芽孢。具有波纹状细胞壁是这种细菌的典型特征。该细菌兼性好气性， 对营养要求苛刻， 在琼脂上不能生长， 生长需要血清蛋白或焦磷酸铁等。把感病葡萄的木质部做超薄切片， 可见到细菌堵塞维管组织。犃 发病条件温湿的冬季可增大昆虫介体的种群密度， 有利于该病害的转播流行。病菌适宜生长温度为 ， 干燥的夏季则有利于病害的发展。犃 传播途径病菌可以通过苗木和昆虫介体进行传播。叶蝉科（ ） 和沫蝉科（ ） 中的大多数昆虫均可作为传播介体。最常见的有红头大叶蝉（ ） 、 绿叶蝉（ ） 、 蓝绿叶蝉（ ） 、 亮翅叶蝉（ ） ， 介体可在野生寄主上吸食和越冬， 第年春天再转移至葡萄， 若虫和成虫均具传病能力， 通常在病株上吸食带菌后， 一般要经过一个循回期才能传病， 有时也能立即传病。野生寄主植物是该病的重要侵染源， 不仅提供了大量的介体昆虫， 还可提供大量菌源。犛 犖犜 附录犅（ 规范性附录）试剂和培养基及配制方法犅 琥珀酸 柠檬酸 磷酸盐缓冲液琥珀酸二钠 柠檬酸三钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 加蒸馏水至 ， 调节 至 ， 高压灭菌 。犅 犘 犇 培养基蛋白胨 胰蛋白胨 琥珀酸二钠 柠檬酸三钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 七水硫酸镁 氯化高铁血红素溶液 细菌培养用琼脂 蒸馏水 调节 至 ， 高压灭菌 。使用时培养基冷却 加入 过滤灭菌的牛血清蛋白溶液（ 质量浓度） 。犅 犆 犛 培养基蛋白胨 胰蛋白胨 磷酸氢二铵 磷酸氢二钾 七水硫酸镁 氯化高铁血红素溶液 酚红溶液（ ） 谷氨酰胺 葡萄糖 组氨酸 可溶性马铃薯淀粉 细菌培养用琼脂 犛 犖犜 蒸馏水 调节 至 ， 高压灭菌 。氯化高铁血红素溶液（ ） ： 蒸馏水中加 氢氧化钠和 氯化高铁血红素于暗处保存。酚红溶液（ ） ： 酚红加入 滴 氢氧化钠溶液， 加水补足 。犅 犘犠培养基蛋白胨 胰蛋白胨 七水硫酸镁 氯化高铁血红素溶液 酚红溶液（ ） 谷氨酰胺 细菌培养用琼脂 蒸馏水 调节 至 ， 高压灭菌 。使用时培养基冷却 加入 过滤灭菌的牛血清蛋白溶液（ 质量浓度） 。犅 犛 犘犠培养基蛋白胨 胰蛋白胨 七水硫酸镁 氯化高铁血红素溶液 酚红溶液（ ） 谷氨酰胺 细菌培养用琼脂 麦芽汁 蔗糖 肌醇 氯化硫胺素 氯化吡哆醇 烟酸 甘氨酸 蒸馏水 调 至 ， 高压灭菌 ， 使用时分别加入的甲基绿（ 每 培养基中加入） 和的甲基紫乙醇（ 每 培养基中加入 ） 。犛 犖犜 附录犆（ 规范性附录）双抗体夹心酶联免疫吸附测定犆 试材犆 酶联板的要求使用质量有保证厂商生产的酶联板。犆 包被抗体特异性的葡萄皮尔斯病菌抗体。犆 酶标抗体碱性磷酸酯酶标记的葡萄皮尔斯病菌抗体。犆 底物溶液对硝基苯磷酸二钠（ ） 溶解于底物缓冲液 中， 现配现用。犆 样品缓冲液（犛 犅）琥珀酸二钠 柠檬酸三钠 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 抗坏血酸钠 蒸馏水定容至 ， 调 至 ， 高压灭菌 。犆 包被缓冲液碳酸钠 碳酸氢钠 叠氮钠 蒸馏水定容至 ， 调 至 ，冰箱保存。犆 犘 犅 犛 犜缓冲液（ 洗涤缓冲液）氯化钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 氯化钾 吐温 蒸馏水定容至 ， 调 至 ，冰箱保存。犛 犖犜 犆 酶标抗体稀释缓冲液 （ 牛血清白蛋白） 或脱脂奶粉 （ ） 叠氮钠 溶于 ， 调 至 ，冰箱保存。犆 底物（犖 犘 犘） 缓冲液溶于 蒸馏水：氯化镁 叠氮钠 二乙醇胺 蒸馏水定容至 ， 调 至 ，冰箱保存。犆 终止反应液氢氧化钠（ ） 溶解于 蒸馏水中。犆 磷酸缓冲液（犘 犅 犛） ， ， 。犆 程序犆 包被抗体用包被缓冲液将抗体按说明稀释， 加入酶联板孔中， 孔， 加盖， 孵育过夜， 清空孔中溶液， 洗涤次。犆 样品制备根据不同植物的不同组织采用不同的样品制备方法。对阴性对照、 阳性对照作相应的处理或按照说明书进行： 葡萄植物取 的叶柄或者叶脉于 的次氯酸钠溶液中消毒 ， 蒸馏水清洗次， 吹干，用 缓冲液在灭菌的研钵中研磨， 得到的研磨液即可进行 检测。小枝或者根切成 的小段， 剥去树皮， 次氯酸钠溶液消毒 ， 然后用蒸馏水清洗次， 用 缓冲液在灭菌研钵中研磨粉碎， 得到的研磨液即可进行 检测。 柑橘植物取 叶片的中脉或叶柄用 的次氯酸钠溶液消毒 ， 用蒸馏水洗涤次， 加入 的 （ ） 溶液在无菌研钵中研磨， 得到的研磨液即可进行 检测。犆 加样酶联板孔中加入制备好的检测样品、 阴性对照、 阳性对照， 孔， 加盖， 孵育或 冰箱孵育过夜， 洗涤次， 每次 ， 重复次。犛 犖犜 犆 加酶标抗体根据说明书用酶标抗体稀释缓冲液将酶标抗体稀释至工作浓度， 加入到酶联板孔中， 孔， 加盖， 孵育， 洗涤次， 每次 。犆 加底物将底物 加入到底物缓冲液中， 终浓度为 （ 现配现用） ， 按每孔加入 ， 室温避光孵育 。犆 终止反应液必要时每孔加入 终止反应液（ 若立即检测 值则不需要） 。犆 读数 后用酶标仪在 处读 值。犆 结果判断对照孔的 值（ 缓冲液孔、 阴性对照及阳性对照孔） ， 应该在质量控制范围内， 即： 缓冲液孔和阴性对照孔的 值均 ， 当阴性对照孔的 值 时， 按 计算； 阳性对照 值阴性对照 值 ； 重复性好。样品 值阴性对照 值明显， 判为阳性； 样品 值阴性对照 值在阈值附近，判为可疑样品， 需重新做一次， 或用其他方法加以验证； 样品 值阴性对照 值明显， 判为阴性。犛 犖犜 附录犇（ 规范性附录）犘 犆 犚凝胶电泳检测犇 病原细菌 犇 犖 犃的提取犇 取 待检样品， 剪成小段， 用液氮研磨成粉末状， 移入灭菌的 离心管中， 加入 的 预热的提取试剂（ ， ， ， ， ， ） 剧烈振荡摇匀； 水浴 。犇 加入 的乙酸钾混匀于冰上静置 。犇 ， 犵离心 ， 将上清液转入一新的 离心管中； 加入 ， 三氯甲烷剧烈振荡 ， 然后在室温下保持 后， 离心 。犇 将上清液移至一新管， 加入倍体积的异丙醇， 混匀， 离心 ， 弃上清液； 乙醇洗涤沉淀， 室温干燥后， 将 溶解在 灭菌双蒸水中。注：病原菌 提取也可省略， 可直接用培养的菌株稀释悬浊液作为模板进行 反应。犇 葡萄皮尔斯病菌的检测引物序列 ： ： 犇 葡萄皮尔斯病菌检测的犘 犆 犚反应体系及参数犇 犘 犆 犚反应体系（ 见表犇 ）表犇 犘 犆 犚反应体系试剂名称终浓度 反应缓冲液 正向引物 反向引物 犜 犪 狇 聚合酶 模板补至 犇 阴性对照、 阳性对照和空白对照的设置阴性对照： 以待测健康的葡萄叶片 为模板；阳性对照： 采用葡萄皮尔斯病菌或含有待测基因序列的质粒；犛 犖犜 空白对照： 设两个， 一是提取 时设置的提取空白对照（ 以 代替样品） ， 二是 反应的空白对照（ 以水代替 模板） 。犇 犘 犆 犚反应参数 ， ， ， ， 个循环， 完成扩增后， 延伸 。犇 琼脂糖凝胶电泳制备 的琼脂糖凝胶， 按比例混匀电泳上样缓冲液和 扩增产物， 用 作为标记， 进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的 大小的特异性 条带， 并拍摄记录。 产物纯化后测序， 比对分析。犛 犖犜 参考文献 培养基制备指南第部分： 实验室培养基制备质量保证通则郭向荣， 张蜀秋等 葡萄木质部液中皮尔斯病病原细菌的直接检测 农业生物技术学报 ， （） ， ， ， （ ） ， ： ， （ ） ： ， （ ） ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ， （ ） ， （ ） ， 犛 犖犜 书书书犜犖犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准葡萄皮尔斯病菌检疫鉴定方法 中 国 标 准 出 版 社 出 版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张 字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元