SN∕T 3746-2013 百合枯萎病菌检疫鉴定方法(出入境检验检疫).pdf

书 书 书中华人民共和国出入境检验检疫行业标准犛犖犜 百合枯萎病菌检疫鉴定方法犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犉狌 狊 犪 狉 犻 狌犿狅 狓 狔 狊 狆 狅 狉 狌犿犳 狊 狆犾 犻 犾 犻 犻 发布 实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发 布书 书 书前言本标准按照 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、上海市农业科学院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本标准主要起草人：戚龙君、宋绍、戴富明、曾蓉、杨翠云、王宏毅。犛犖犜 百合枯萎病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了百合枯萎病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于百合鳞球茎中携带的百合枯萎病菌的检疫鉴定。病菌基本信息中文名：百合枯萎病菌英文名： 学名：犉狌 狊 犪 狉 犻 狌犿狅 狓狔 狊 狆 狅 狉 狌犿 犾 犻 犾 犻 犻 分类地位：无性阶段属于：真菌界（ ） ，半知菌亚门（ ） ，丝孢纲（ ） ，瘤座孢目（ ） ，瘤座孢科（ ） ，镰刀菌属（犉狌 狊 犪 狉 犻 狌犿） 。未见有性阶段。传播途径：主要有：）土壤传播，土壤带菌传播是该病原菌传播的主要途径之一；）种球传病，带病的种球通过买卖、运输等途径传播病害；）残体带菌，病球的残体存在大量病原菌，在土壤中能长期存活，在再次种植过程中，能传播病菌。百合枯萎病菌的其他信息参见附录。方法原理本标准根据该病菌在百合鳞茎球上的主要危害症状特征、形态学特征以及反应特性为鉴定百合枯萎病菌的依据。仪器和用具 主要仪器与用具超净工作台、生化培养箱、生物显微镜、生物体视显微镜、仪、凝胶电泳仪、台式冷冻离心机、水浴培养箱、制冰机、旋涡振荡器、电泳仪、恒温水浴锅、紫外透射仪、凝胶成像系统、研钵和研棒、天平（感量 ） 、白磁盘和尖头镊子、计、塑料袋、离心管等。 主要试剂和培养基次氯酸钠、 、氯化钠、三氯甲烷、异戊醇、种脱氧核苷三磷酸（ ） 、溴化乙锭（） 、 酶、聚乙烯吡咯烷酮（） 、异丙醇、巯基乙醇、溴酚蓝、犜犪 狇酶等。培养基（马铃薯 ，蔗糖 ，琼脂 ，蒸馏水 ） 。病原菌鉴定 症状检查根据百合枯萎病在百合鳞球茎上的特有症状特点，在光线充足处，对于抽取的样品逐个检查块茎表犛犖犜 面是否有典型的病斑，将有典型病症以及有怀疑症状的鳞球茎做进一步的分离和病原菌检疫鉴定。 病菌分离、纯化及形态观察鳞球茎表面具有典型病斑的：可将块茎在流水下冲洗去除表面的杂物后，表面用的次氯酸钠消毒 ，无菌水冲洗次，切下病健交界处的小块组织（厚直径） ，置于上， 下分离培养，后在体视显微镜下观察。出现菌落后，将菌落的边缘或分生孢子转移到上继续纯化培养，产孢后进行形态鉴定（病原菌图片参见附录） 。 菌丝的犘犆犚检测在培养基上 培养获得的菌丝可直接进行检测，检测方法见附录。 鳞球茎上病原菌的犘犆犚和巢式犘犆犚检测对于没有典型病斑的鳞球茎，可直接进行和巢式检测，检测方法见附录。鉴定特征 菌落特征和病菌形态病菌在上气生菌丝绒状，洁白丰厚，培养中后期培养物正面或者背面可见牵牛紫色。产孢细胞短，简单瓶梗。小型分生孢子数量多，卵圆形或者椭圆型，隔隔，但多数无分隔，大小在（ ）（ ）之间。大型分生孢子组型美丽，月芽形，稍弯，向两端比较均匀变尖，一般隔隔，多数隔，大小为（ ）（ ） 。厚垣孢子多为球形，直径为 ，间生或顶生。未见有性阶段。 犘犆犚和巢式犘犆犚检测百合枯萎病菌培养菌丝的检测：产物在 处有特异性条带；鳞球茎中病菌的巢式检测：在 和 处有特异性条带。结果判定如症状检查、分离物培养性状与 相符合，且其菌丝基因组经 的检测在 有特异性条带，而阳性对照也在 有特异性条带、阴性对照在 无特异性条带，可判定该菌株为百合枯萎病菌；如阳性对照在 处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在 处无特异性条带，则为非百合枯萎病菌。对鳞茎球的巢式检测，在 和 处有特异性条带，而阳性对照也在 和 有特异性条带、阴性对照在 和 无特异性条带，可判定样本带有百合枯萎病菌；如阳性对照在 和 处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在 和 处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。样品保存与处理发现带有百合枯萎病菌的样品至少保存个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。犛犖犜 菌种保存与处理分离获得的百合枯萎病菌单孢分离培养物，保存在斜面培养基上，冰箱中保存至少个月，以备复检、谈判和仲裁。保存期满后进行灭活处理。 实验室记录与保存实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员的签字。犛犖犜 附录犃（资料性附录）百合枯萎病菌的其他信息犃 寄主范围目前已经报道的寄主有：百合、洋葱。犃 地理分布亚洲：韩国、日本、中国台湾。欧洲：西班牙、荷兰、意大利、波兰。美洲：美国。犃 病害症状百合枯萎病菌在百合鳞茎球上的主要为害症状特征：病菌从肉质根或鳞茎盘基部伤口侵入，造成肉质根和盘基变褐腐烂，并逐渐向上发展，鳞片出现褐色凹陷病斑，后期鳞片从盘基散开而剥落。犛犖犜 附录犅（资料性附录）百合枯萎病菌的培养特征和形态特征犅 百合枯萎病菌在上菌落形态见图 。图犅 百合枯萎病菌在犘犛犃上菌落形态（犃：正面；犅：反面）犅 百合枯萎病菌孢子形态见图 图 。图犅 百合枯萎病菌两种不同类型的分生孢子犛犖犜 图犅 百合枯萎病菌小型分生孢子着生方式图犅 百合枯萎病菌的厚垣孢子犛犖犜 附录犆（规范性附录）百合枯萎病菌丝的犘犆犚检测犆 试剂犆 提取缓冲液 ， ， （ ） ， （ ） 。犆 电泳缓冲液：犜犃犈缓冲液（ ） 然后加入 的去离子水，充分搅拌溶解。加入 的冰醋酸，充分混匀。加去离子水定容至，室温保存。犆 上样缓冲液 溴酚蓝， （质量分数）蔗糖。犆 菌丝体犇犖犃的提取（改良的犅狌 狊 狋狀犌狉 犪 犫法）菌落在培养基上 培养，刮取 的菌丝加入 提取缓冲液中，剧烈混匀后置于 下 ，旋涡振荡 后加入 三氯甲烷，旋涡振荡 ， 离心 ，上层水相转入另一 的离心管中，加入 的预冷的无水乙醇，上下颠倒轻柔混匀， 放置 。 离心 ，弃上清液，加 乙醇， 离心 弃上清。室温条件下自然干燥后加入 ，加 （ ） ， 。犆 犘犆犚扩增犆 百合枯萎病菌特异性引物上游引物 ：下游引物 ：犆 犘犆犚反应扩增的反应体系体积 ，其中包括病样模板， 反应缓冲液， （ ） ， （每种 ） ，正向引物（ ） ，反向引物（ ） ， 犜犪 狇酶（） 。反应条件： 变性 ，然后在 变性 、 退火 、 退火 、 延伸 条件下循环重复 次，最后 延伸 。犛犖犜 犆 对照阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组（ ）代替待鉴定菌株的基因组，其他条件相同。阴性对照：为 代替鉴定病原菌的基因组，其他条件相同。犆 产物分析制备 琼脂糖凝胶，移液器取 扩增产物和上样缓冲液混合，点样到凝胶上的样品孔中，用 作为分子量标记，电压下电泳。电泳结束经染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。犆 结果判断扩增结果为待测样本和阳性对照在 处有特异性条带，而阴性对照在 处无特异性条带，则菌株为百合枯萎病菌。扩增结果为阳性对照在 处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在 处无特异性条带，则为非百合枯萎病菌。犛犖犜 附录犇（规范性附录）鳞球茎中病原菌巢式犘犆犚检测犇 试剂犇 提取缓冲液缓冲液： ， （ ） ， （ ） 。缓冲液（） ： ， ， （ ） ，巯基乙醇（体积分数） 。犇 电泳缓冲液：犜犃犈缓冲液（ ） 然后加入 的去离子水，充分搅拌溶解。加入 的醋酸，充分混匀。加去离子水定容至，室温保存。犇 上样缓冲液 溴酚蓝， （质量分数）蔗糖。犇 鳞球茎犇犖犃的提取取百合鳞叶，剪成小碎片，置冷冻的研钵中加 粉末后速加液氮研成粉末。取 粉末，迅速转入至预冷的离心管中，即加 预冷的缓冲液迅速混匀，放置 后置冷冻离心机中（） 离心 ，弃上清液，留沉淀。重复操作次，沉淀，备用。往沉淀中加入 预热的提取缓冲液，迅速混匀，置 中水浴 ，其间不断振摇。取出放置至冷，吸取上清液至另一离心管中。加入等体积的三氯甲烷异戊醇（ ）轻柔倒转完全混匀，静置至分层。于室温， 离心 ，取上清液。重复以上步骤次，留上清液。往上清液中加入倍体积 后混匀，再往其中加入等体积倍异丙醇颠倒混匀，置 冰箱中放置 使沉淀。用 乙醇洗次，干燥。往沉淀中加入 溶解沉淀，再加入 （ ） ， 水浴 。犇 犘犆犚扩增犇 引物第一轮引物 犛犖犜 ： ：第二轮引物 ： ：犇 反应体系扩增的反应体系体积 ，其中包括病样模板， 反应缓冲液， （ ） ， （每种 ） ，正向引物（ ） ，反向引物（ ） ， 犜犪 狇酶（） 。第一轮引物扩增条件： 变性 ，然后在 变性 、 退火 、 退火 、 延伸 条件下循环重复 次，最后 延伸 。取第一轮反应产物，用作第二对引物反应的模板，进行第二轮反应。第二轮引物扩增条件： 变性 ，然后在 变性 、 退火 、 延伸 条件下循环重复 次，最后 延伸 。犇 对照阳性对照：以百合枯萎病菌的基因组（ ）代替待鉴定菌株的基因组，其他条件相同。阴性对照：为 代替鉴定病原菌的基因组，其他条件相同。犇 产物分析制备 琼脂糖凝胶，移液器取 扩增产物和上样缓冲液混合，点样到凝胶上的样品孔中，用 作为分子量标记，电压下电泳。电泳结束经染色后在凝胶成像系统观察、照相并记录。犇 结果判断扩增结果为待测样本和阳性对照在 和 处有特异性条带，而阴性对照在 和 处无特异性条带，则判定样本带有百合枯萎病菌。扩增结果为阳性对照在 和 处有特异性条带，而待测样本和阴性对照在 和 处无特异性条带，则判定样本无百合枯萎病菌。 犛犖犜 书 书 书 犜犖 犛中华人民共和国出入境检验检疫行业标准百合枯萎病菌检疫鉴定方法 中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲号（ ）北京市西城区三里河北街 号（ ）总编室： （ ） 网址 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本 印张字数 千字 年月第一版 年月第一次印刷印数 书号： 定价 元