生物技术概论作业.doc

使用木糖发酵酒精代谢工程研究
【摘要】
木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精及其她化工产品最为关键一环, 但自然界中缺乏能将上述生物质有效转化为乙醇微生物菌种。多年来, 依据代谢工程原理, 利用基因工程技术对酵母和细菌进行遗传改造, 或将木糖代谢路径引入传统酒精发酵菌酿酒酵母及高酒精产生菌运动发酵单胞菌中, 从而拓展其底物利用范围; 或使原本能够利用多个糖底物细菌取得选择性产生酒精能力, 构建了多种不一样类型木糖发酵重组菌株。即使这些重组菌株在木糖转化酒精方面均显示出良好应用前景, 但仍存在很多问题。有必需在对木糖代谢调控机制深入系统研究基础上, 深入改造现有菌株, 并结合生化工程技术对重组菌株发酵条件进行优化, 以实现高效生物转化木质纤维素原料制取乙醇。

【序言】
20 世纪70 年代石油危机及当今世界对能源需求急剧增加, 加紧了大家寻求开发燃油替换能源步伐。作为传统生物发酵产品和潜力巨大燃料, 乙醇已被公认为是最有发展前景可再生清洁能源之一。从降低温室气体排放和环境保护角度出发, 欧盟国家已提议生物燃料使用到 年要占整个运输燃料消耗2%, 而到 年, 这一数值要抵达5.75%。中国 年就在大中城市中开始逐步推广使用乙醇汽油(乙醇占10%∼15%), 这给燃料乙醇开发及工业化生产带来前所未有发展机遇。传统乙醇发酵生产关键以淀粉质和糖蜜为原料, 原料成本在生产总成本中占有很大百分比, 在一定程度上限制了整个乙醇工业发展。 与淀粉质原料不一样, 木质纤维素是世界上最为丰富生物质资源, 每年总产量约占全部生物质资源50%, 现在大多数这类物质没有得到很好利用。 所以, 利用木质纤维素为主可再生生物质资源, 生产可再生能源含相关键经济与社会意义。 木糖是半纤维素关键组成单糖, 在植物纤维材料水解液中含量可达成30%, 能够说木糖有效利用是生物质资源成功工业化转化关键。
对自然界能够利用木糖微生物代谢路径研究分析发觉, 木糖进入菌体细胞后首先在木糖还原酶(XyloseReductase, XR)和木糖醇脱氢酶作用下转化为木酮糖。在一些细菌中,木糖异构酶(Xylose Isomerase, XI)能够直接将木糖转化为木酮糖。木酮糖经过木酮糖激酶(Xylulokinase, XK)磷酸化生成5−磷酸木酮糖后能够进入磷酸戊糖路径(PPP), 最终以中间产物6−磷酸葡萄糖和3−磷酸甘油醛进入糖酵解路径生成酒精。 传统用于乙醇发酵生产微生物(酿酒酵母和运动发酵单胞菌等)能很好地利用葡萄糖, 且乙醇发酵率高, 乙醇耐受力强, 但均缺乏利用木糖能力。所以, 从20 世纪80 年代开始, 大家便尝试利用代谢工程手段改造酵母菌或细菌来发酵木糖等五碳糖生产酒精, 并取得了很大进展, 取得了不少含有应用前景工程菌株。本工作将介绍以酿酒酵母和细菌为初始菌株进行酒精代谢工程改造研究进展。

一、 酵母菌木糖代谢工程改造
对酵母菌木糖代谢改造关键集中在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中, 菌种改造包含木糖跨膜运输、 吸收利用、 磷酸戊糖路径、 糖酵解及胞内氧化还原状态维持等多个方面。
1、 木糖运输
木糖跨膜运输被认为是酿酒酵母和树干毕赤氏酵母(Pichia stipitis)利用木糖最关键障碍之一。在酿酒酵母中, 木糖吸收关键是经过高亲和力葡萄糖运输因子HXT4, HXT5, HXT7 和Gal2 介导进行, 所以, 葡萄糖存在能够强烈抑制木糖发酵酵母菌株对木糖吸收。Hamacher 等研究发觉, 当酵母菌本身全部18种单糖运输因子被去除后, 即使含有完整木糖代谢。路径酵母工程菌也不能在含木糖培养基上生长, 说明木糖在酿酒酵母中跨膜运输依靠于葡萄糖运输系统。对天然利用木糖Pichia stipitis 研究发觉, 它含有两个动力学性质完全不一样木糖运输系统, 其中低亲和力运输系统为木糖和葡萄糖所共享, 而高亲和力运输系统却是木糖特异性, 但这种运输系统性质还未被最终确定。相信对此新运输系统深入研究将有利于提升现在酿酒酵母木糖代谢工程菌对木糖高效利用。
2、 木糖向木酮糖转化及磷酸戊糖路径改造
早在1991年, Kotter 等将树干毕赤氏酵母木糖还原酶(XYL1)与木糖醇脱氢酶(XYL2)转移到酿酒酵母中使其表示, 得到酵母转化子能够在有氧条件下利用木糖并产生木糖醇。但研究发觉, XYL1 与XYL2 相对表示水平改变能够影响最终代谢产物形成; 伴随XYL2 表示量深入提升, 则会造成木酮糖累积分泌, 从而显示在这些转化重组酵母中, 木酮糖激酶活性在一定程度上成为木糖代谢限速步骤。
木酮糖激酶是木糖代谢路径中一个关键酶, 酿酒酵母本身表示活性很低。众多对木糖代谢路径中木酮糖激酶改造研究发觉, 即使在部分不一样遗传背景酿酒酵母菌株中过量表示P。stipitis XYL1, XYL2 及酿酒酵母本身XKS1, 能够在36 h 内产生较高产量乙醇(50 g/L), 但也有很多报道发觉, XKS1 过量表示仅在好氧条件下能够提升木糖利用率; 而在非通氧条件下, 即使能够提升转化菌株最终乙醇产量, 但木糖总消耗量却下降50%∼80%, 其中一个可能原因就是在厌氧条件下, 过量表示木酮糖激酶对木酮糖无限制磷酸化催化在某种程度上耗尽了胞内ATP, 从而引发细胞生长毒害。所以, 木酮糖激酶表示必需维持在一个既能确保木糖被有效利用, 又不对细胞生长造成损害适宜水平。Walfridsson 等曾提出增加非氧化PPP 路径能够抑制因为过量表示XYL1 与XYL2 而引发木糖醇过量积累。随即研究发觉, 即使过量表示转酮醇酶(Transketolase)造成转化酵母对木糖利用下降但转醛醇酶(Transaldolase)过量表示确能够增加转化酵母对木糖利用。最近, Karhumaa 等利用一株过量表示嗜热细菌Thermus thermophilus XI基因、 XK基因及众多非氧化磷酸化路径酶基因酵母菌株, 研究了这些不一样基因表示状态对木糖利用影响, 结果发觉酿酒酵母对木糖有效利用不仅依靠于从木糖到木酮糖有效转化, 也依靠于非氧化磷酸化路径对木酮糖深入有效代谢。
3、 有氧呼吸与氧化还原平衡对木糖代谢影响
早期研究发觉, 木糖还原酶对辅酶因子NADPH亲和力远远高于对NADH 亲和力, 但随即木糖醇脱氢酶却需要以NAD+为辅因子, 两步催化反应所需辅因子不一样被认为是缺氧条件下木糖代谢效率低下及木糖醇累积一个关键原因。 所以, 降低胞内NADPH 相对水平, 并促进NAD+因子再生是木糖代谢改造酿酒酵母, 使其有效利用木糖、 降低木糖醇积累所必需。大家曾试图经过改变菌种遗传背景, 从而使木糖代谢过程中细胞内氧化还原状态维持一个平衡状态, 如把过量表示XKS1 酵母转化子中6−磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf1)或6−磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(gdn1)敲除, 能够显著地提升乙醇产率, 但因为胞内NADPH 降低, 这些突变同时也降低了木糖吸收速率。Anderlunt等经过XR 与XDH 融合表示以增加木糖还原酶结合利用XDH 产生NADH 几率。结果表明, 得到酵母转化子与分开表示XR 和XDH工程菌株相比, 木糖醇产率降低11.3%。而乙醇得率提升20.3%。Watanabe 等经过对树干毕赤氏酵母XDH 酶进行定点诱变, 得到了一个对NAPD(+)亲和力提升4500倍、 且催化效率与野生型酶以NAD(+)辅因子效率相当突变体酶, 但此突变型酶在胞内生理活性及对木糖代谢影响还有待深入研究。
研究发觉, 不管天然利用木糖酵母菌株还是遗传改造酵母菌株, 只能在有氧条件下利用木糖, 但乙醇产生则需要厌氧条件。深入分析发觉, 线粒体电子传输产生ATP 并再生NAD+是酵母菌有效代谢木糖及生成酒精所必需, 所以, 酿酒酵母发酵木糖产生酒精工业化应用一个最大现实障碍就是确保工程菌株能在厌氧条件下利用木糖生长。Eliasson 等在首次报道重组酵母TMB3001在葡萄糖存在和厌氧条件下能够利用木糖产生酒精, 但酒精产率很低; Sonderegger等在采取逐步限氧和限葡萄糖连续发酵方法产生酒精, 经过进化工程最终分离得到能在厌氧条件下代谢木糖, 但不产生酒精菌株, 或不能厌氧利用木糖生长但能高效产生酒精菌株, 但这两类菌株遗传背景改变均不清楚。依据上述研究结果, 从商业角度出发, 能够采取在葡萄糖培养基厌氧发酵后, 再采取有限氧发酵模式利用剩下木糖, 从而达成高效转化木糖目。
除了代谢工程改造酿酒酵母外, 自然界中还存在其她部分酵母菌种能够直接利用木糖发酵产生酒精, 如嗜柔管囊酵母、 休哈塔假丝酵母及树干毕赤酵母等, 而且这些菌株对木质纤维素原料水解液也表现出很好发酵酒精商业应用潜力。中国经过细胞固定化或原生质体融合技术对这类菌株木糖发酵特征进行了研究与改善, 木糖及半纤维素水解液乙醇发酵浓度能够提升到20g/L。
二、 运动发酵单胞菌木糖代谢代谢工程改造
属于厌氧型细菌运动发酵单胞菌是自然界中迄今为止唯一已知将丙酮酸脱羧酶及乙醇脱氢酶与独特Enter-Doudoroff(ED)糖酵解路径相偶联高效产生乙醇微生物。与传统用于乙醇发酵生产微生物如酿酒酵母相比, 运动发酵单胞菌含有以下多个优点: (1)酒精产量靠近理论最大值(约97%), 酒精产量比酵母菌高5%∼10%, 产率比酵母菌高近5 倍, 且发酵生物量相对较低; (2) 高酒精耐受力, 耐受酒精浓度可达16%(3) 产物专一性高, 生长营养要求简单。 另外, 与酿酒酵母一样, 运动发酵单胞菌也是公认安全菌株, 发酵菌体生物量能够简单处理后作为动物饲料或肥料使用, 而且以淀粉质为原料, 基于运动发酵单胞菌酒精生产工业化试验也已成功进行。但与酿酒酵母相同, 运动发酵单胞菌底物利用范围有限, 除葡萄糖、 果糖和蔗糖外, 因为本身缺乏必需代谢路径而使其无法利用木质纤维素水解产生木糖等戊糖成份, 从而限制了其在酒精发酵生产应用。Zhang等在1995 年首次成功地将与木糖代谢相关4个基因转化到运动发酵单胞菌中, 而且成功地得到了表示。其中木糖异构酶基因(xylA)和木酮糖激酶基因(xylB)负责将木糖转化成磷酸戊糖路径关键中间物木酮糖−5−磷酸, 转酮醇酶基因(tktA)和转醛醇酶基因(talB)负责将木酮糖−5−磷酸转化成ED 路径中间物, 从而使木糖被吸收利用并生成乙醇。取得转化菌株CP4(pZB5)可在以木糖为唯一碳源培养基上生长, 而且乙醇产量达成了理论产率86%; 而对于木糖和葡萄糖各为25 g/L 混合碳源, 经30 h 发酵, 两种糖发酵转化率都可达成95%。依据最新专利报道, Mohagheghi 等又将发酵木糖和阿拉伯糖所需7个基因整合到运动发酵单胞菌染色体上特异位点⎯乳酸脱氢酶基因(ldh)中, 取得了一株稳定整合重组菌株AX101, 在给予新菌株发酵利用木糖和阿拉伯糖能力同时, 也降低了副产物乳酸生成。
在经过构建工程菌株发酵木质纤维素类生物质水解液生产酒精尝试中, 一个需要处理问题就是工程菌株对水解液中众多抑制因子, 尤其是乙酸耐受性问题。Lawford 等曾将携带木糖代谢相关基因质粒pZB4L转入运动发酵单胞菌ATCC39767, 接种于经预处理北美鹅掌揪木中连续培养, 并不停增加揪木酸水解稀释液, 使其含量由最初接种时10%达成培养末期50%; 培养149d 后, 分离得到一突变菌株, 其在含0.4%∼1.0%乙酸培养基中发酵乙醇产量达成了理论值94%∼96%。现在, 此菌种已初步在同时糖化发酵中得到应用。AX101一样存在着乙酸耐受度低问题, 此菌株在培养160代后仍能发酵木糖和阿拉伯糖, 但Mohagheghi 等发觉AX101在连续培养时, 当乙酸浓度超出4.5 g/L, 就因其代谢速率开始减缓而累积木糖。 最近, Mohagheghi 等新构建了木糖代谢路径基因染色体整合重组菌株8b, 该菌株在谷物秸杆稀酸水解液中发酵乙醇产量可达85%, 且能够耐受发酵液中16 g/L 乙酸, 显示出良好应用前景。已经有相关研究显示, 抑制因子耐受性问题处理, 能够从驯化筛选抗乙酸工程菌株及发酵前往除水解液中乙酸两个路径入手。
三、 大肠杆菌木糖代谢产生乙醇遗传工程改造
大肠杆菌可利用碳源广泛, 其中包含六碳糖和五碳糖(木糖和阿拉伯糖)。 但因为大肠杆菌缺乏高活力乙醇产生酶系, 而且糖酵解过程产生副产物较多(关键为有机酸)。上世纪80年代, Ingram 等用运动发酵单胞菌中高活力丙酮酸脱氢酶(PDC)和乙醇脱氢酶基因(ADHII)构建了PET 操纵子, 并将该操纵子导入大肠杆菌中表示, 结果大肠杆菌工程菌株乙醇产量得到了极大提升。 Beall 等发觉转化有pLOI297(含PET 操纵子)B系大肠杆菌在80 g/L木糖培养基和42℃发酵条件下, 最终乙醇产率可达成0.72 g/(L-h), 而乙醇耐受力可达成53∼56 g/L。中国最近也有类似工作报道, 但还处于起步阶段。
Ohta 等于1991 年将上述两个基因深入整合到B 系大肠杆菌ATCC11303 染色体上丙酮酸甲酸裂解酶基因(pfl)座位中, 在取得这两个基因高水平表示同时, 也消除了此酶对丙酮酸竞争作用, 从而加大了乙醇路径代谢流向。 经过对初始整合菌株系列诱变和筛选后, 最终取得大肠杆菌工程菌株(KO11)转化葡萄糖和木糖成乙醇产量分别达成了理论值103%∼106%。 因为KO11 同时含有琥珀酸脱氢酶基因缺点, 所以最终发酵产物中琥珀酸含量仅为含质粒重组菌株5%。深入研究发觉, KO11对蒸汽预处理松树水解产物及玉米纤维水解产物进行发酵, 乙醇产量能够达成理论值80%∼82%。 但因为KO11 最适生长pH 和温度分别是6.5与35℃,而木质纤维素类物质预处理时所用来自T。 reesei纤维素酶作用最适pH 与温度分别为4.6和55℃, 所以实施同时糖化发酵(SSF)过程还存在一定困难。同时,很多试验结果显示, 构建大肠杆菌酒精发酵菌株在无机盐基础培养基中, 发酵木糖酒精产率在很大程度上受细胞有限生长限制。Underwood 等研究则表明, 经过遗传改造增加胞内谷氨酸含量, 或直接在培养基中补加渗透压保护剂均能够增加细胞生长量及酒精产率。Yomano 等于1998 年筛选出一株突变株LY01, 其在140 g/L 木糖培养基上发酵木糖时间能够从120 h 缩短到96 h, 而且能够耐受木质纤维素水解产物中多个生长抑制因子如糠醛、 乙酸、 乙醇和有机酸等, 但菌株突变性质不清楚。
Hespell等则利用一个能够对外源乙醇产生路径进行厌氧选择大肠杆菌FBR 来确保发酵过程中重组菌株稳定性。FBR 因为缺失丙酮酸甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(ldh)而无法还原丙酮酸和循环糖酵解产生NADH, 所以在无氧条件下不能生长。将编码PET操纵子pLOI297 转化到FBR中, 不仅重建了发酵路径, 而且可实现发酵过程中对重组菌株选择, 其中一株重组菌株FBR5 在36∼60 h 内即可完全发酵木糖, 最终酒精产量达成0.46∼0.51 g/g (乙醇/木糖)。最近, Nichols 等还构建了一系列磷酸烯醇式丙酮酸−葡萄糖磷酸转移酶系统(ptsG−)缺点型菌株, 这些菌株因为ptsG 缺失使大肠杆菌主动运输葡萄糖路径受到阻碍, 从而解除了发酵过程中葡萄糖阻遏效应, 使突变菌株能够同时利用阿拉伯糖、 葡萄糖和木糖。

【展望】
半纤维素是纤维质原料关键组分之一, 怎样有效利用半纤维素是生物量全利用关键之一。以木质纤维素为原料生产乙醇, 其关键之一就是含有能有效利用多种糖底物, 且高效产生乙醇微生物菌种。因为这么菌种在自然界中并不存在, 所以大家转向利用代谢工程原理, 经过分子遗传改造相关菌株来取得能在厌氧条件下高效代谢发酵葡萄糖、 木糖及其她多种戊糖工程菌株。上述研究结果表明这一设想在理论上是可行, 而且也取得了多种类型重组菌株, 但在实践中仍存在很多需要处理问题。对酵母菌而言, 已经有重组菌株在木糖发酵过程中仍存在以下问题: 绝对依靠于通氧或可共代谢碳源存在; 乙醇产生效率较低, 且通常有较高含量木糖醇产生; 重组菌株构建多以试验室菌株为主, 而工业用菌株改造报道则较少等。对细菌代谢工程而言, 即使与酵母菌相比含有较高发酵温度, 但其最适pH通常靠近中性, 还不适协议时糖化发酵过程; 同时, 多种重组工程菌株所用试验发酵条件, 如培养基组成、 糖源组合及接种方法不一样, 所以发酵结果缺乏系统比较。另外, 对纤维质原料水解液中多种生长抑制因子耐受性及低营养要求适应性是重组细菌工程菌进入商业化应用必需处理一个问题, 而这一问题最终处理除深入经过进化工程手段筛选目标菌株, 还同时依靠于从工程角度研究适合纤维质原料预处理策略。
不管酵母菌还是细菌, 要实现代谢工程改造最终目标, 还需要在现有基础上, 利用当今生物学领域部分最新技术, 如微阵列分析、 转录组学、 蛋白质组学及自动定向进化等, 从整个基因组水平深入研究木糖代谢调控网络及机制, 找出影响木糖代谢, 尤其是厌氧条件下影响木糖发酵多种因子, 经过结合生化工程技术, 平衡这些因子在细胞内改变, 以实现最大效率木糖乙醇转化。 同时, 还能够将上述代谢工程理念应用于自然界中其她部分独特征状菌株, 以拓展改造菌株范围, 如直接改造一些能在高温下降解纤维素嗜热细菌或革兰氏阳性细菌、 树干毕赤酵母等, 在它们已经有一些独特征状基础上, 深入提升乙醇转化效率。相信对上述菌株深入改造以及相关同时发酵技术研究改善, 对最终实现直接利用木质纤维素生产乙醇含有深远而重大意义。

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