呋喃妥因代谢物快速检测试剂盒说明书.doc

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呋喃妥因代谢物（AHD）快速检测试剂盒说明书

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一、概要
硝基呋喃类药物因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，作为禽类、水产和猪促生长的添加剂。但在长时间的实验研究过程中发现，硝基呋喃类药物和代谢物均可以使实验动物发生癌变和基因突变，正因为如此才导致此类药物禁止在治疗和饲料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。
由于硝基呋喃类药物在体内很快就能被代谢，而在组织中结合的代谢产物则能存留较长的一段时间，所以在分析此类药物的残留时经常要分析其代谢后的产物，管理部门就以检测代谢产物为手段达到检测硝基呋喃类残留的目的。呋喃妥因代谢产物AHD；呋喃它酮代谢产物AMOZ；呋喃唑酮代谢产物AOZ；硝基糠腙（呋喃西林）代谢产物SEM。
用来检测呋喃妥因代谢物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶联免疫方法结合了色谱技术，采用AHD衍生物的特异性抗体，具有很高的精确度，更灵敏的反应，较低的操作技术要求和短暂的检测时间，检测样本量大等特点在检测中很好的表现出来。
该试剂盒可以测定肉类（鸡、猪、牛、鱼、虾）、牛奶和蜂蜜中呋喃妥因代谢物的残留量。
二、原理
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物AHD经衍生化后和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗呋喃妥因代谢物的衍生物抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物AHD的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中呋喃妥因代谢物的残留量。
试剂盒特性
试剂盒灵敏度：0.1ppb
检测下限
组织、蜂蜜检测下限：0.2ppb
虾\鱼等水产组织因存在一定的干扰，检测下限在0.3ppb
样本回收率
水产、鸡肉、肝脏组织 …………………………… 75±15%
蜂蜜样本 …………………………………………… 90±15%
交叉反应率
呋喃妥因代谢物…………………………………… 100%
呋喃唑酮代谢物……………………………………… < 0.01%
呋喃它酮代谢物……………………………………… < 0.01%

硝基糠腙（呋喃西林）代谢物………………………… < 0.01%
三、试剂盒组成
1、96孔酶标板×1块（包被有偶联抗原）
2、标准液×6瓶：（1ml/瓶）
0ppb, 0.1ppb, 0.3ppb, 0.9ppb, 2.7ppb, 8.1ppb
3、酶标二抗 12ml …………………… 红色帽
4、抗体工作液 7ml ……………………… 绿色帽
5、底物液 A 液 7ml ……………………… 白色帽
6、底物液 B 液 7ml ……………………… 红色帽
7、终 止 液 7ml ……………………… 黄色帽
8、20×浓缩洗涤液 40ml …………………… 透明帽
9、2×浓缩复溶液 50ml …………………… 透明帽
四、所用仪器、试剂
仪器：
┅┅微孔板酶标仪450nm/630nm
┅┅匀质器
┅┅振荡器
┅┅离心机
┅┅微量移液器：单道 20ml～200ml、200ml～1000ml
多道 250ml
试剂：
┅┅乙酸乙酯
┅┅正己烷（或正庚烷）
┅┅K2HPO4·3H2O
┅┅2-硝基苯甲醛
┅┅甲醇
┅┅亚硝基铁氰化钾（K2Fe(CN)5·NO·3H2O）（供奶样用）┅┅ZnSO4·7 H2O（供奶样用）
┅┅浓HCl
┅┅NaOH
五、样本前处理步骤
样本处理前须知
处理任何样本时，都必须注意：
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
样本前处理需配制：
配液1：衍生化试剂 15.1mg 2-硝基苯甲醛
加甲醇10ml溶解（浓度为10mM）
配液2：用去离子水将2×浓缩复溶液与去离子水按1：1体积比进行稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本复溶。
配液3：C液（供奶样用）：12.5g 亚硝基铁氰化钾
用去离子水溶解定容至100ml
D液（供奶样专用）： 29.8g 硫酸锌
用去离子水溶解定容至100ml。
配液4：0.1M K2HPO4 22.8g K2HPO4·3H2O
加去离子水溶解定容至1L。
配液5：1M HCl 8.3ml 浓HCl
用去离子水定容至100ml。
配液6：1M NaOH 4g NaOH
用去离子水溶解定容至100ml。
（a）鱼虾和肉样
┅┅用均质器均质样本；
┅┅接d的描述方法。
注：样本应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存
（b）奶样
┅┅取出5ml的样本到玻璃离心管中；
┅┅分别加入C液和D液各250ml；
┅┅用振荡器充分混合样本后，用恒温离心机3000g以上离心10min,4-12 oC（39-54℉）。如果没有恒温离心机，则先将样本降温至大约8 oC（46℉），然后离心；
┅┅接d的描述方法
（c）蜂蜜
┅┅取1g样本到离心管中；
┅┅加入4ml的蒸馏水振荡溶解，0.5ml 1M HCL和100ml 衍生化试剂，充分振荡；
┅┅接d第二步描述方法（标 * 处）。
（d）接上面的方法
┅┅取1±0.05g的均质物（鱼虾/肉样）、牛奶的离心上清液1.1ml（相当于1ml的奶样），分别加入4ml的蒸馏水， 0.5ml 1M HCL和100ml衍生化试剂，充分振荡；
*┅┅在37 oC过夜孵育（大约16h）；
┅┅分别加入5ml 0.1M K2HPO4，0.4ml 1M NaOH和5ml的乙酸乙酯，剧烈振荡30s；
┅┅在室温下（20-25 oC/68-77℉）3000g以上离心10min；
┅┅取出2.5ml的乙酸乙酯层到另一个容器中50oC下氮气吹干或旋转蒸发仪蒸干；
┅┅用1ml的正己烷（或正庚烷）溶解干燥物，用1ml已稀释好的复溶液充分混合；
┅┅在室温下（20-25 oC/68-77℉）3000g以上离心10min；
┅┅取50ml下层用于分析。
样本稀释倍数：2
注：样本应当保存在阴凉避光处并且需要冷藏保存。
六、酶标免疫分析程序:
测定前应须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
操作步骤：
1、将试剂盒从冷藏环境中取出并将所需试剂从试剂盒取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂 使用前均须摇匀。
2、配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水稀释至800ml备用（或按需量稀释），稀释好的洗涤液在4℃环境可保存一个月，使用前也需回温。
3、取出板架及需要数量的微孔板，将不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃不要冷冻。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品均需做2孔。
6、加标准品/样本50ml/孔，然后加抗体工作液50ml/孔，用盖板膜盖板，37℃环境中反应30min，取出甩干，用洗涤液洗板5次每孔加250ml，每次10秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
7、 加酶标二抗：每孔加入100ml，用盖板膜盖板后置37℃环境中反应30min。取出甩干，用洗涤液洗板5次每孔250ml，每次10秒，拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
8、 显色：每孔加入显色剂A液50ml，再加B液50ml，轻轻振荡混匀，37℃环境中避光显色15min。
9、 测定：每孔加入终止液50ml，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），测定每孔OD值。
七、结果判定
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与呋喃妥因代谢物的含量成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.310，样本2的吸光度值为0.820，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.510；0.1ppb为1.320； 0.3ppb为1.030； 0.9ppb为0.660； 2.7ppb为0.389； 8.1ppb为0.198。则样本1的浓度范围是2.7ppb-8.1ppb，乘以其对应的稀释倍数；样本2的浓度范围是0.3 ppb-0.9 ppb，乘以其对应的稀释倍数。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于 标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

百分吸光度值（%）＝
B
×100%
B0
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0µg/L标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以AHD标准品浓度（µg/L）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中AHD实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
八、注意事项
1、 室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、 混合要均匀,洗板要彻底,否则会出现重复性不好的现象。
4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、 储存条件
保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻；将不用的微孔板放进自封袋重新密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、 试剂变质的迹象
显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、 加A、B液后一般显色15min即可，若颜色较浅，可延长显色时间，但不能超过30min。
9、 该试剂盒最佳反应温度为37℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
10、试剂盒有效期为半年，生产日期见包装盒。